PROCESOS BIOQUÍMICOS

TEMA 2: LEVADURAS DURANTE LA

FERMENTACIÓN

1. ETAPAS DE LA FERMENTACIÓN:
1.1 INICIO:
Generalmente, son las levaduras apicultas (forma de limón) con bajo poder fermentativo (de 4 a 5 %
VOL) las más abundantes en esta etapa inicial. Las más comunes son Kloeckera apiculata y
Hanseniaspora ovarum.
Son oxidativas y producen bastante acidez volátil (ácido acético). Se multiplican muy rápidamente, pero
son muy malas fermentadoras, necesitan de 21 a 22g de azúcar para producir 1º de alcohol. Tienen su
origen en la uva (pruina) o en la bodega. Es importante minimizar su desarrollo y para ello es necesaria
una buena higiene y el sulfitado.
Son muy sensibles al alcohol, al SO2 y a la falta de oxígeno, que son factores selectivos que provocan
que las levaduras saccharomyces se impongan a estas levaduras salvajes. Otro factor a tener en cuenta es
la temperatura ya que por encima de 25ºC mueren, y a medida que avanza la fermentación la tª aumenta.
1.2 MEDIA:
Por encima de los 4 o 5% VOL las levaduras que van a dominar el proceso fermentativo son
saccharomyces Cerevisiae o saccharomyces Pastorianus. Ambas tienen un poder fermentativo elevado y
son bastante persistentes al SO2 y al etanol.
1.3 FINAL:
Al alcanzar los 10 o 11% VOL hay otras especies de levaduras como saccharomyces Bayanus que
ejercen su predominio gracias a su elevado poder fermentativo que puede superar los 18% VOL. Es la
levadura típica en estas etapas finales y en procesos Re fermentativos de vinos embotellados.
2. POST-FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA:
Una vez terminada la fermentación alcohólica al agotarse los azúcares Saccharomyces se muere. Y si las
condiciones no son las adecuadas, como por ejemplo falta de higiene, se pueden favorecer las levaduras
post-fermentativas perjudiciales.
Una de estas es Brettanomyces, la cual puede dejar grandes secuelas en los vinos donde se desarrollan,
que van desde olor a “ratón” hasta aromas a “medicina” u orín. Se trata de una levadura muy complicada
de eliminar y con un desarrollo impredecible.
Las principales ventajas de Brett para desarrollarse en un vino son: Una gran habilidad para fermentar
azúcares residuales, gran adaptación a las condiciones ambientales del vino (alta concentración de
etanol, ph acido y anaerobiosis). No siempre la presencia de este microorganismo implica que vaya a
haber enfermedad en ese vino, en otros casos altera los caldos aumentando su acidez volátil y aportando
aromas desagradables.
Estos olores se deben en primer lugar a la producción de ácido acético que aumenta la acidez volátil que
de aromas a vinagre. Este acético provoca la aparición de acetato de etilo que da aromas a acetona. Los
fenoles volátiles que producen Brett a partir de los polifenoles del vino son ácido p-coumárico aromas a
medicina y Ácido ferúlico a aromas a madera húmeda, 4-etilfenol y el 4-etil guaiacol. Por último,
productos derivados del metabolismo de la lisina son los causantes del olor a ratón y orín de caballo.
Si el desarrollo de Brett no es excesivo los vinos según algunos expertos pueden ganar complejidad
aromática y son descritos como aroma tipo Brett en sus cualidades.
También existen levaduras que forman un delgado velo blanquecino en la superficie de los vinos mal
conservados denominadas flores del vino. Sucede cuando el nivel de SO2 es bajo, hay falta de higiene,
pero sobre todo si el vino está en contacto con el aire. Estas levaduras se alimentan de alcohol
produciendo etanal oxidando el vino. También forman gran cantidad de ácido acético y acetato de etilo
(aroma a pegamento), provocando al final picado acético. Las especies más comunes son: Candida
micoderma, Hansenula anómala y Pichia.
3. CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO:
 PROCESOS BIOQUÍMICOS
Entendemos por crecimiento microbiano al aumento del nº de microorganismos a lo largo del tiempo. Por
tanto, no nos referimos al crecimiento de un único microorganismo si no al de la población. El crecimiento
de la población es el aumento del número de células como consecuencia de un crecimiento individual y una
posterior división. El tiempo que tarda una célula en nutrirse, crecer y dividirse se denomina tiempo de
generación (g). Cada vez que transcurre un tiempo de generación, el nº de células se duplica, siendo un
crecimiento exponencial. El tiempo de generación puede ser de unos 20 min en condiciones óptimas hasta
de varios meses en peores condiciones.
3.1 CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LÍQUIDO:
Podemos distinguir 4 fases en la evolución del crecimiento microbiano.
 Fase lag de Adaptación: Durante esta fase los microorganismos se adaptan a las condiciones
ambientales. No hay incremento en el nº de células, pero hay gran actividad metabólica en donde la
célula crea proteínas, duplica su ADN y aumentan de tamaño.
 Fase logarítmica o exponencial: En esta fase la velocidad de crecimiento es máxima y constante y el
tiempo de generación es mínimo. No hay mortalidad y los nutrientes se consumen a velocidad
máxima. Si un cultivo que se encuentra en esta fase se inocula en un medio de cultivo con las mismas
condiciones no se observaría primera fase y el crecimiento sería exponencial. La evolución del
número de células se explica con los siguientes modelos matemáticos:
Log N – Log N0 = M/2,303 (t-t0)
N0= nº inicial de células
N= nº final de células.
(t-t0)= Tiempo transcurrido
M (nu)= Constante de velocidad (Tasa de crecimiento).
g= 0,693/M
g= tiempo de generación
 Fase estacionaria: En esta fase no se incrementa el nº de células. Las células producen metabolitos
secundarios que liberan o acumulan.
Los microorganismos entran en fase estacionaria bien por que se agote algún nutriente esencial o bien
por que se acumulen en exceso productos de desecho en exceso. Esta fase es el perfecto ejemplo del
estado metabólico real de los microorganismos en ambientes naturales.
 Fase de muerte o de declinación: En esta fase la población decrece, las células mueren y liberan
productos que por una parte siguen de sustento para las levaduras vivas hasta que todo se agote y se
produzca la extinción total. Si Re incubamos una población microbiana tras la fase estacionaria,
aunque vivan progresivamente entraran en la última fase de muerte.
3.2 CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SÓLIDO:
Las fases y la cinética de crecimiento son iguales que en el punto anterior. En estos medios estudiamos las
células por unidad de superficie o de masa.
Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer en un medio sólido el resultado final al cabo del
tiempo es una colonia. Se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula viva y aislada que
se encuentra con las condiciones óptimas para dar lugar a una colonia tras un breve lapso de tiempo. Cuando
el nº inicial de células es muy alto por unidad de superficie se juntan muchas colonias y se forma el césped.
3.3 CONCEPTO DE MUERTE:
Desde el punto de vista microbiológico un microorganismo muere cuando pierde de forma irreversible la
capacidad de dividirse. Como consecuencia no hay aumento en el nº de microorganismos y por la tanto no
hay crecimiento. Sin embargo 1 microorganismo puede estar muerto desde este punto de vista y seguir su
actividad metabólica. En ciertos casos la capacidad de dividirse puede ser perdida de manera transitoria si
las condiciones no son adecuadas, y volver a recuperarse si las condiciones vuelven a ser favorables.
 PROCESOS BIOQUÍMICOS

4. MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:

4.1 RECUENTO DE VIABLES:
Consiste en diluir una muestra para poder contabilizar células con precisión. Se siembra un volumen
determinado para estimar tras el conteo de nº de colonias aisladas. Las placas deben tener de 25 a 250
colonias para poder distinguir bien unas de otras y contabilizar la UFC.
Para realizar esta práctica hay que realizar diluciones seriadas en tubos de ensayo de volumen conocido e
inocular en nuestro medio 1ml para poder determinar la concentración de células/mm.
PROBLEMA EXÁMEN: (número) x 1 millón
4.2 MÉTODO TURBIDIMÉTRICO:
El sistema se basa en que las células en suspensión dispersan la luz causando turbidez. La turbidez depende
de la masa en suspensión, es decir midiendo una, estimamos la otra. Se basa en la ley de Lambert-Beer. Esta
ley concluye que hay una relación entre la transmisión de la luz a través de una sustancia y la concentración
de la sustancia y también su longitud. El aparato es un lector microplaca que nos permite medir la densidad
óptica de un cultivo a través de la turbidez y como resultado nos da una curva de crecimiento que relaciona
la absorbancia con la concentración de células x ml. Siempre trabajamos con un blanco que sirve como
muestra de referencia y con un 0 sin muestra.
4.3 RECUENTO DIRECTO:
Consiste en la observación al microscopio de volúmenes muy pequeños en unos porta objetos especiales
denominados cámaras de Petroff-Hauser. Estas cámaras están divididas en cuadrados que a su vez se dividen
en 12 cuadriculas más pequeñas. Para calcular el nº de células multiplicamos por los siguientes factores: nº
de células · 16, 25, 50, 1000= 2,8 x 108 cels/ml.  Problema exámen
4.4 MEDIDA DE LA ACTIVIDAD METABÓLICA:
Las bacterias y levaduras durante su actividad producen diversos productos y agotan determinados
nutrientes. En el caso de las levaduras durante la fermentación producen liberación de Co2 y agotan la
glucosa o fructosa. Cualquiera de estos 2 parámetros puede servir para contabilizar tanto el desarrollo
microbiano como el proceso fermentativo.