CRECIMIENTO MICROBIANO - 1

CRECIMIENTO MICROBIANO
El crecimiento se define como un incremento
en el número de células
 En procariotas continúa hasta que se divide
en dos nuevas células en un proceso llamado
fisión binaria
Cada célula hija recibe un cromosoma
completo y copias suficientes de
macromoléculas, monómeros e iones
inorgánicos para vivir en forma independiente
Bajo condiciones nutricionales estables la
bacteria E. coli puede completar su ciclo en 20
minutos
 El tiempo es variable y depende de factores
nutricionales y genéticos
 CRECIMIENTO MICROBIANO

CRECIMIENTO EQUILIBRADO:
• Aumento del número de individuos de una población
concurrente con el aumento de sus constituyentes químicos
• Duplicación del número de células y de la biomasa
CRECIMIENTO MICROBIANO

DIVISIÓN:
• fisión binaria o bipartición (bacterias) y gemación (levaduras)

TIEMPO DE GENERACIÓN:
• duplicación de la población microbiana
REPRODUCCIÓN BACTERIANA
• Fisión binaria
• Formación de nuevo ADN casi continuamente
• Intercambio genético:
• Transformación
• Genes tomados del ambiente que les rodea
• Conjugación
• Genes transferidos de célula a célula (pili)
• Transducción
• Genes transferidos por virus (fagos)
 CRECIMIENTO CELULAR
Hay tres aspectos determinantes del crecimiento
microbiano:

 Los factores del crecimiento.

 El estequiométrico, por el cual la concentración
final de microorganismos obtenidos dependerá
de la concentración y composición del medio de
cultivo
 El cinético, que indica la velocidad del proceso.
INFLUENCIA DE LOS FACTORES
AMBIENTALES SOBRE EL
CRECIMIENTO
 TENPERATURA

 El abanico es amplio y va desde puntos por debajo de la congelación del agua hasta
110° C, el rango habitual es 30° C
Se distinguen cuatro grupos:
Psicrófilos con temperaturas bajas 0-20 º C,
Mesófilas con medianas 20-45 º C,
Termófilas más altas 60- 90° C
Hipertermófilas con muy altas 90-110 º C

Congelación: existe un límite por el cual es imposible la reproducción, hay

crioprotectores (glicerol y dimetilsulfóxido) que permiten su conservación a
temperaturas (-70 ° C)
 Termofilia: termófilos poseen membranas ricas en ácidos grasos saturados que les
dan estabilidad a altas temperaturas. Las eucariotas están ausentes por encima de 60 °
C debido a la porosidad de sus membranas
La temperatura favorece reacciones del metabolismo bacteriano:
- Acelera su capacidad de síntesis
- Velocidad de multiplicación más rápida
Regla de Van´t Hoff: "la velocidad de las reacciones químicas se duplica por cada
incremento de 10º C de la temperatura
 pH y ACTIVIDAD DEL AGUA

 Acidez y alcalinidad - pH: sólo unas pocas especies pueden crecer

a pH extremos, la mayoría de los ambientes naturales tiene 5.9. Según
su tolerancia al pH:
 Los que crecen a pH ácidos (1 - 5.5) son acidófilos
 Los que crecen a pH básicos (8.5 - 11.5) alcalófilos
 Los que crecen a pH neutro (5.5 - 7.0) neutròfilos

La mayoría de las bacterias tienen su pH óptimo (exterior) entre 5 - 9

y cambian el pH de su hábitat acidificando o alcalinizando y con ello
facilitan o impiden la supervivencia de otras especies bacterianas.
 Acidógenas: acidifican su entorno al liberar productos ácidos
 Acidúricas: crecen en un medio ácido y son capaces de hacerlo
más ácido
 Disponibilidad del agua
•Actividad el agua: la disponibilidad del agua se expresa
en términos físicos como actividad del agua (a w) y sus
valores oscilan entre 0 y 1
•Los microorganismos necesitan presencia de agua, en forma
disponible, para crecer y llevar a cabo sus funciones metabólicas.

•aw: es la relación entre la presión de vapor de agua del medio

(P) y la presión de vapor del agua pura (Po).

Valores mínimos:
• bacterias aw > 0.90
• levaduras aw > 0.85
• hongos filamentosos aw > 0.80.
 Solutos y aw.
• Los solutos presentes en el medio compiten por el agua y la “fijan”, disminuyendo
la cantidad disponible para los microorganismos.
• El agua difunde desde una región con alta concentración de agua (baja
concentración de solutos) hasta una región de menor concentración de agua (alta
concentración de solutos): Osmosis
• Plasmólisis: se produce cuando la célula está en ambiente con baja actividad del agua
y existe una tendencia de salida del agua intracelular
 NECESIDADES DE OXIGENO
Bacterias aeróbicas estrictas: utiliza concentraciones del 20% más
de Oxígeno
Microaerófilos: necesita concentraciones muy bajas de Oxígeno.
2-10%. Tienen superóxido dismutasa (SOD) y pueden o no tener
catalasa
Bacterias anaeróbicas estrictas: No tolera nada de Oxígeno. Les
resulta tóxico y mueren, solo crecen si hay 0.5%. No tiene ni SOD
ni catalasa
Bacterias anaeróbicas facultativas: utiliza oxígeno solo si lo hay.
No tiene problema para sobrevivir pero si hay oxígeno crece más
rápido, 2-8%, tienen SOD y catalasa

Anaerobio aerotolerante: no necesita oxígeno para crecer y

multiplicarse. Tolera el oxígeno pero no lo utiliza. Tienen SOD pero
no catalasa
 NECESIDADES DE OXIGENO
 El Oxígeno es tóxico para algunos porque no tienen las enzimas SOD y
catalasa, que degradan a los radicales libres del Oxígeno que son tóxicos. Con
estas enzimas (SOD y Catalasa), las bacterias pueden vivir con oxígeno
 El consumo de oxígeno es necesario para la respiración celular (para obtener
ATP)

Toxicidad del Oxígeno: elementos tóxicos:

 H2O2: Peróxido de Hidrógeno
 O2- : radical superóxido
 OH- : radical hidroxilo

Enzimas que intervienen:

 Superóxido dismutasa: 2 O2 + 2 H+------H2O +O2

Catalasa o peroxidasa: H2O2--------------H2O + O2

 Concentración de oxigeno.
•Cuando el O2 es el sustrato limitante, la tasa de crecimiento
especifica varia con la concentración del oxigeno disuelto, de acuerdo
a una cinética de saturación.
•El oxigeno se introduce al caldo de cultivo normalmente
esparciéndolo en el medio.
•La transferencia del oxigeno desde las burbujas de gas, hasta las
células esta limitada por la transferencia de oxigeno a través de la
película liquida que rodea las burbujas de gas
CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS SÓLIDOS
 Un medio sólido es una solución nutritiva (como el líquido), pero incorporado a
un gel, que le da consistencia.
 Los tipos de gelificantes más usados para los medios sólidos: agar-agar (o
simplemente, agar) es el más usado; gelatina (tiene el inconveniente que se licua a
temperaturas relativamente bajas)
 Los medios sólidos se suelen inocular mediante asa de siembra o espátula,
diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en placas de Petri .Tras la
incubación a la temperatura y condiciones adecuadas, cada bacteria o agrupación
bacteriana da origen, por crecimiento, a una acumulación de células, visible a
simple vista, denominada colonia
 La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 107 células para una
colonia de unos 5 mm). Se debe a que las bacterias no pueden dispersarse, y
durante mucho tiempo este medio sólido permite un aporte continuo de
nutrientes y eliminación continua de productos de desecho. Por lo tanto, se parece
a un cultivo continuo, excepto que no hay drenaje de células.
 Con vistas a la determinación taxonómica, se suele tomar nota de una serie de
características de las colonias: tamaño, forma general y de bordes, color,
consistencia, aspecto de la superficie y elevación sobre el sustrato
CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS
 Una población bacteriana presenta un patrón de crecimiento
cuando se inocula en un medio de cultivo fresco cerrado (líquido o
sólido)
 En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento dura sólo
unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes y/o
acumulación de desechos
 En estos sistemas hay una fase de latencia (fase lag) de retraso
mientras las células se ajustan a las nuevas condiciones es un
período de ajuste metabólico que depende del tamaño del inóculo,
bondad del inóculo (estado metabólico previo)
 Fase exponencial o fase logarítmica de crecimiento continuo
donde se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas
pocas generaciones (menos de 10), el valor de (g) dependerá de la
composición del medio, temperatura, pH, osmolaridad
CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS
 Fase estacionaria se caracteriza porque el coeficiente de crecimiento se hace nulo
pero aun existe crecimiento que se equilibra con las muertes celulares, se agotan
nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho, incluso el pH se hace
inadecuado, aun hay reacciones metabólicas pero el metabolismo es diferente
(células son más chicas) al de la fase logarítmica , el citoplasma se condensa, la
membrana se hace menos fluida y suele ser más resistente a los agentes físicos y
químicos
 Fase de muerte si la incubación continua en la fase estacionaria, las células
empiezan a morir y hay incluso lisis celular , es también una función exponencial
pero más lenta que la exponencial
 FORMAS DE CULTIVO
Las fermentaciones, pueden clasificarse en: continua, semicontinua o
intermitente.
PROCESO INTERMITENTE. Fermentación Batch.

•Se refiere al crecimiento de células en sistema cerrado.

•En el inicio del cultivo, el medio estéril se inocula con un volumen
adecuado de microorganismos y se permite que se lleve a cabo la
fermentación en condiciones óptimas. A lo largo del proceso no se
añade ningún nutriente, salvo el oxígeno, por lo que se produce el
agotamiento de los nutrientes, lo que ocasiona cambios
fisicoquímicos en el caldo que dan origen a fases típicas de un cultivo
microbiano.
•Consecuencia: Varían el pH, temperatura y la concentración de
nutrientes con el tiempo.
CICLO DE CRECIMIENTO MICROBIANO.
•El crecimiento no es lineal y sigue un patrón
 CURVA DE CRECIMIENTO
ESTACIONARIA

Log CÉL.
MUERTE
VIABLES EXPONENCIAL

LATENCIA

TIEMPO
 FASE DE LATENCIA
• latencia: adaptación al medio, organismos metabólicamente activos

• depende de edad del inóculo y diferencia entre el medio de cultivo de

procedencia y el nuevo
Fase de latencia
•Cuando se introduce un inoculo en medio fresco, el crecimiento
usualmente no comienza de inmediato sino después de un tiempo
llamado de latencia o acostumbramiento.
• En este periodo de transición los microorganismos, producen las
enzimas necesarias para aprovechar un nuevo medio ambiente.
•En esta fase no hay incremento en el número de células, pero hay
actividad metabólica, aumento en el tamaño individual de las células,
en el contenido proteico, ADN y peso seco de las células.
•Si un cultivo que está creciendo en fase exponencial es inoculado al
mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento,
no se observa fase de latencia y el crecimiento exponencial sigue a la
misma velocidad.
•Si una población se transfiere de un medio de cultivo rico a un
medio pobre, se observa latencia porque las células para poder
seguir creciendo deben tener las enzimas necesarias para sintetizar
algunos metabolitos esenciales que no están presentes en el medio.
 Factores que afectan la fase de latencia
•Generalmente la fase de latencia aumenta con la edad del inoculo.
•Si un cultivo que está creciendo en fase exponencial es inoculado al
mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento,
no se observa fase de latencia y el crecimiento exponencial sigue a la
misma velocidad.

•Se puede producir una pseudo fase de latencia, cuando el inoculo es

pequeño o con baja porción de células viables.

Si se desea minimizar la fase de latencia es recomendable:

•- Las células deben estar adaptadas a las condiciones del medio

donde crecerá.
•- Las células debe ser jóvenes (en fase exponencial)
•- El tamaño del inoculo debe ser entre el 5% y 10% v/v.
Fase exponencial o fase logarítmica
• Es el período en el cual, cada vez que pasa un tiempo de
generación la población microbiana se duplica. La velocidad de
crecimiento es máxima.

• En esta fase la concentración de nutrientes es alta, y la tasa de

crecimiento celular es por tanto independiente de la
concentración de nutrientes.

• Es un periodo de crecimiento balanceado, en el cual todos los

componentes celulares se incrementan en la misma proporción.
• crecimiento equilibrado a velocidad constante

• depende de condiciones ambientales y características intrínsecas

Fase de desaceleración. En esta fase el crecimiento desacelera
debido a la escases de algún nutriente esencial o de la acumulación
de algún producto toxico, resultado del crecimiento previo.
•Estos factores ocasionan un crecimiento desbalanceado,
ocasionando cambios en las estructuras celulares, para aumentar
sus perspectivas de crecimiento en un medio hostil.
•Un ejemplo de producto inhibitorio es el etanol producido por las
levaduras alcohólicas.
•Si de algún modo se remueve el producto toxico, puede haber una
nueva fase de crecimiento.
Fase estacionaria
•En esta fase la velocidad de muerte celular se iguala a la velocidad
de reproducción de las sobrevivientes.
•En esta fase las células sobrevivientes, producen metabolitos
secundarios (como los antibióticos).

•Las limitaciones del crecimiento ocurren por: agotamiento de

algún nutriente esencial, por acumulación de productos tóxicos, o
por una combinación de las causas anteriores.
 FASE ESTACIONARIA

• agotamiento de nutrientes esenciales

• acumulación de productos de desecho metabólico
• no se aprecia incremento neto de la población
 Fase de muerte
•Ocurre una disminución progresiva en el número de células
viables.
•velocidad de muerte celular > velocidad de división celular
•Cuando la concentración de sustrato es mínima, la célula se ve
forzada a metabolizar su propio protoplasma (se conoce como
metabolismo endógeno)

Manejo industrial.
•La fase de latencia, no es deseable, por que se pierde tiempo y
acarrea pérdidas económicas
•Para minimizar esta fase, se hace crecer el inóculo aparte, en un
medio de cultivo igual al que se va a emplear en el bioproceso
(cultivo o fermentación) y luego se procede a transferirlo cuando
las células ya se encuentran en la fase exponencial (inoculación).
 FASE DE MUERTE
• falta de energía para mantenimiento celular
• disminución del número de células del cultivo
• velocidad exponencial
• generalmente lisis celular
Ventajas y Desventajas del proceso batch.
•Ventaja: sencillez.
•Desventajas: alto requerimiento de mano de obra, y
demasiados tiempos muertos.
•Tiempos muertos: Fase de adaptación, fase de decaimiento,
periodo de descarga, y renovación de la carga del reactor para
un nuevo batch.
PROCESO SEMICONTINUO

• Se evitan las fases de adaptación y decaimiento.

• Periódicamente se extrae medio agotado y se repone medio
fresco.
Criterios:

• mantener la concentración de sustrato suficientemente alta

para evitar escases.
• la concentración del producto suficientemente baja para no
sobrepasar los límites tolerables.
Proceso semicontinuo
•Se operan de forma similar a los batch, pero sólo se cosechan
parcialmente a intervalos regulares, reponiendo el cosechado con
medio fresco.
•Es como repetir un cultivo batch indefinidamente, pero ahorrando la
mayor parte del tiempo de servicio entre lotes.

•Los parámetros a controlar: volumen y tiempo de adición, se calculan

de modo que el cultivo se mantenga en fase logarítmica.

•Si el volumen extraído es muy grande puede diluirse el medio, tanto

que la masa microbiana puede volver a la fase de acostumbramiento.

•Si el volumen extraído es muy pequeño para igual tiempo el cultivo

puede agotarse y pasar a la fase estacionaria.

•Si el tiempo de renovación es muy grande el cultivo puede alcanzar a

la fase estacionaria y si es muy pequeño el cultivo puede regresar a la
fase de acostumbramiento.
 CULTIVO CONTÍNUO

• Población microbiana creciendo en un recipiente de volumen

constante al que se añade medio fresco y se quita medio usado

• quimiostato y turbidostato
 EL QUIMIOSTATO

 Es un reactor que mantiene el

crecimiento bacteriano en la fase
exponencial
Es un cultivo continuo el volumen se
mantiene constante (recambio entre medio
fresco y usado) y se alcanza un estado de
equilibrio entre el número de células y su
estado metabólico
 Es un cultivo balanceado mantenido por
tiempo indefinido por un sistema de flujo
que se compone: una cámara de cultivo de
volumen constante a la que llegan
nutrientes y de la que se eliminan los
productos tóxicos de desecho
 Características: estado constante o
estable; concentración bacteriana y
concentración del sustrato: constante; tasa
de dilución y rendimiento celular:
constante
Se usan dos elementos de control: la velocidad de dilución y la concentración del
nutriente limitante (C o N)
 La velocidad de dilución controla la velocidad de crecimiento en rangos muy
amplios y la densidad celular (células/ml) esta controlada por el nivel del nutriente
limitante
 Los parámetros a tener en cuenta son: f (ml/h); volumen cámara de cultivo (ml);
densidad celular (x); factor de dilución D=f/v (h -1)
 Si logramos que el coeficiente de crecimiento (m) se haga igual al factor de
dilución (D), entonces dx/dt=0 y por tanto la cc de las células se hace constante
(x=x) y el cultivo se encuentra en estado dinámico de equilibrio

EL QUIMIOSTATO
 Los MO pueden cultivarse en una amplia gama de tasas de crecimiento
exponencial y permite crecimientos balanceados y restringidos ya que el nutriente o
sustrato está presente en una concentración baja como para limitar la densidad de
población
 Sin embargo, a tasas altas de dilución la concentración microbiana cambia
rápidamente y el cultivo puede ser lavado totalmente (dilución crítica)
 A muy bajas diluciones el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es la
fuente de energía ya que sólo se usa para reacciones de mantenimiento celular y no
para crecimiento (energía de mantenimiento) como ser potencial de membrana,
trasporte activo o síntesis de proteínas

EL QUIMIOSTATO
 Aplicaciones:
Procesos industriales de fermentación (producción de bebidas alcohólicas, de
antibióticos, de aminoácidos, etc)
 Permite estudiar: aspectos fisiológicos (catabolismo de sustrato limitante), selección
de mutantes ; estudios ecológicos
 Su aplicación más conocida es para la depuración de aguas ya sea
mediante procesos aeróbicos o anaeróbicos . El “medio de cultivo fresco” es el agua
residual que entra en la planta y alimenta a los fangos activados por MO que luego se
retiran por decantación

EL QUIMIOSTATO
 Control por quimiostato
•El elemento de control es la concentración de un
nutriente limitante (C o N). Los demás nutrientes en
el medio se encuentran en exceso.
Los parámetros a tener en cuenta son:
•F (m3/h);
•volumen del reactor (m3);
•densidad celular (x);
•factor de dilución (D): Es la relación entre el caudal
de alimentación, y el volumen de cultivo. D=F/V (h -1)
• D indica las veces que se renueva el volumen del
biorreactor por unidad de tiempo. D= 0.25 h-1 indica
que en una hora se renovó 25 % del volumen de
cultivo, o bien que cada 4 h se renueva el volumen
de cultivo.
•Si la tasa de crecimiento se hace igual al factor de dilución
(D), entonces dx/dt=0. Por tanto, la cc de las células se
hace constante (x=x) y el cultivo se encuentra en estado
dinámico de equilibrio.
•Con altas tasas de dilución el cultivo puede drenarse totalmente
(DC: dilución crítica).
•Es decir, el cultivo se “lava” porque su velocidad de crecimiento es
inferior a la tasa de dilución.

•A muy bajas diluciones (D) el quimiostato no funciona si el

nutriente limitante es la fuente de energía.
• Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de energía sólo
se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular,
pero no queda para el crecimiento.
DETERMINACION DE LA CONCENTRACION
CELULAR
 MEDICION DEL CRECIMIENTO CAMARA DE
PETROFF HAUSSER
 Se puede medir siguiendo los cambios en el número
de células o el peso de la biomasa celular
 El número de células se puede medir al microscopio y
se llama recuento directo
Se puede realizar en muestras secas o líquidas para las
que se usan cámaras especiales de recuento donde el
valor de células es convertido a células por mililitro de
suspensión
 Càmara de Petroff Hausser: portaobjeto especial con
graduación en superficie y medidas concretas:
 0.02 mm de profundidad
 área de 1 mm 2 dividida en un retículo de 25
cuadrados grandes
 cada cuadrado grande está subdividido a su vez en
4 x 4= 16 cuadrados pequeños
 la muestra se distribuye en 16 x 25= 400 celdillas
 MEDICION DEL CRECIMIENTO

 La muestra dispensada entre porta y cubre se deja

reposar unos minutos y se cuenta el número de células
en varias celdillas (en general 16 equivalente a un
cuadrado grande), se anota el número n y se establece:

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células / ml

 Limitaciones:
 las células vivas no se distinguen de las muertas
 las células pequeñas son difíciles de apreciar
 se requiere habilidad para obtener precisión
se necesita contraste de fases cuando la muestra no
está teñida
 no es bueno para suspensiones poco densas, sólo sirve
para suspensiones concentradas ( mayores a 10 x 10 6
cel./ml)
 Cámaras de recuento
•Existen cámaras especificas como: Cámaras de Neubauer, Cámara
de Petroff-Hausser, el hemocitómetro, Microscopio graduado de
Helber, etc.
Cámara de Neubauer.
•Esta cámara está adaptada al microscopio de campo claro o al de
contraste de fases
•Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente
deprimidas en cuyo fondo se ha marcado con la ayuda de un
diamante una cuadrícula de dimensiones conocidas.
•Se cubre la cámara con un cubreobjetos que se adhiere por simple
tensión superficial (en especial una vez que se haya añadido la
muestra líquida).
•Cuadrado de 3 x 3 mm. Cámara de Neubauer
•El área sombreada y marcada L es 1
mm2.
•La depresión tiene 0.1 mm de
profundidad.
•El volumen de la superficie L, bajo el
cubreobjetos es de 0.1 mm3 (0.1
microlitro)
•Los cuadrados L están subdivididos en
16 cuadraditos de 0,0025 mm2 cada
uno.
•El cuadrado del centro está dividido en
5 cuadrados por lado con una longitud
lateral de 0,2 mm, y superficie de 0,04
mm2.
•Al contar las cuatro áreas sombreadas
(L), si hay un total de x células entre las
cuatro áreas, la concentración en la
suspensión celular será :

células / mL = 10000 (x/4)

Técnica de conteo

Reglas para que las células, no se

cuenten dos veces reglas:

-Se cuentan las células dentro de la zona

definida.
- También se cuentan las células, que se
apoyan o tocan en dos caras , p.ej. en la
línea de medida izquierda y superior.
Observaciones sobre el recuento
o Efectuar conteo en forma de meandro
o En los conteos de cámaras, el diafragma del condensador en el
microscopio deberá estar cerrado en gran parte.
o El valor medio de los conteos se aplica luego en una fórmula de cálculo o
se multiplica por el factor correspondiente.
Cámara Petroff-Hausser
•El retículo del fondo está
dividido en 25 cuadrados
grandes
•Cada cuadrado grande tiene
16 cuadraditos
•Volumen de la cámara= 0,02
mm3
•Área de la cámara 1 mm2
 Cámara de conteo SEDGEWICK RAFTER
•Es una cámara graduada de 50 x 20 x 1 mm (= 1 cm³).
•La cámara de conteo tiene 1 mm de profundidad. El área total es
de 1000 mm2 y el volumen de 1000 mm3 o 1 ml.
•Consiste en un marco de cerámica rectangular. Posee un grabado
de 1000 cuadrados y está cubierto por un cubreobjetos espeso.
•Esta diseñada para contar plancton en un microscopio compuesto
o en un microscopio invertido,
• medición cuantitativa del número exacto de partículas en un
volumen preciso de un fluido.
RECUENTO DE
VIABLES

 El recuento en placa determina el número de células capaz de generar colonias

sobre la superficie de un medio sólido
 Hay dos formas, por siembra en superficie: se siembra 0.1 ml de muestra y se
extiende por la superficie con una barra de vidrio o metal
 O bien, por siembra en profundidad: se siembra de 0.1 a 1.0 ml en la placa de
Petri y se agrega el medio sólido fundido (40 ° C) y se incuba
 Por este método se pueden usar volúmenes más grandes
 Hay que tener en cuenta que el organismo a ser contado resista temperaturas de
40 a 45° C
 El número de colonias que puede ser contado oscila entre 30-300 colonias
 DILUCIONES

 Cuando el cultivo es denso se usa

el método de diluciones
 Se usan diluciones seriadas en
base 10: 1.0ml de muestra en 9.0ml
de diluyente o bien, 0.5ml muestra
en 4.5ml de diluyente
 El número de colonias depende
del inóculo , medio de cultivo y las
condiciones de incubación (medio
de cultivo, temperatura y tiempo de
incubación)
 La expresión del resultado será
como unidades formadoras de
colonias por mililitro (ufc/ml) ya que
la ufc puede contener más de una
célula
 Conteo en placas.
•Se asume que cada colonia ha sido formada por una única célula del
medio de cultivo original. Esta suposición puede subestimar la
densidad de población.
•Las células son entonces medidas como unidades formadoras de
colonia – UFC.
•Para realizar el recuento se seleccionan las placas de la que
contengan entre 25 y 250 colonias.
 MASA CELULAR Y TURBIDEZ
 Medida de la masa bacteriana: Métodos directos
Se puede determinar el peso seco donde la masa seca (estufa a 105 º C toda la
noche) es aproximadamente entre el 10 al 20% de la masa húmeda
 Inconvenientes: método tedioso que requiere tiempo y errores en pesadas ( 1
mg de peso seco equivale a una masa bacteriana de 5 x 10 9 bacterias)
 o bien, el peso húmedo donde se centrifuga y se elimina el sobrenadante y se
determina el peso del sedimento
 Inconvenientes: grandes errores debido al líquido intercelular retenido, tipo y
forma de las agrupaciones de la cepa, etc
 Determinación de componentes característicos: peptidoglicano, ARN, ADN,
proteínas se usan en bacterias que forman grumos no dispersables o crecen en
filamentos en general se emplean en determinaciones en ambientes naturales
 Métodos indirectos :
Turbidimètricos (ópticos): la base común consiste en la medición de la
cantidad de luz dispersada o trasmitida a través del cultivo bacteriana. La
dispersión de la luz dentro de ciertos limites es proporcional a la masa del cultivo
 MASA CELULAR Y TURBIDEZ
 Escala de Mc Farland: es una serie
de patrones de turbidez (precipitado
de SO4 Ba) previamente calibrados y
se establece la equivalencia entre la
turbidez de cada tubo y la masa o
concentración de bacterias
(células/ml) que genera una turbidez
similar
 Un método más útil es la medida
de turbidez con fotómetro o
espectrofotómetro que hacen pasar
luz a través de las suspensión celular
y detectan la cantidad de luz no
dispersada
 Los resultados se expresan en
unidades fotométricas o unidades
de densidad óptica proporcionales al
número de células y a la masa celular
 MASA CELULAR Y TURBIDEZ
Hay que realizar una curva estándar de
calibración que relacione medidas
directas (recuento en placa o
microscopía) con las indirectas de
turbidez
 En el método de turbidimetría es
necesario determinar el contenido de
ufc/ml de la muestra original (de la cual
se hicieron las diluciones para la
calibración) con el método de recuento
en placa.
 Con esta información y las
absorbancias de las diluciones, se hace
una curva de calibración. Teniendo esta
curva, se podrá determinar las ufc/ml de
otras muestras luego de leer la
absorbancia de las mismas.
 Contadores electrónicos de partículas :
se pasa una suspensión bacteriana por un
tubo capilar entre los dos polos de una
corriente eléctrica
 Cada vez que pasa una bacteria se
interrumpe la corriente y es recogida por un
dispositivo electrónico que detecta el
numero y tamaño de las partículas que van
pasando (el tamaño es función de la
intensidad del pulso de voltaje al paso de la
partícula)

 Citometría de flujo activada por

fluorescencia (FACS): las partículas se
marcan antes con anticuerpos monoclonales
hacia alguna molécula de superficie y se
unen a un fluorocromo (molécula que se
excita al absorber la radiación láser y emite
fluorescencia a diferente longitud de onda)
 Equipos automáticos
"Cell Coulter" de Beckman-Coulter
•Se basa en medir los cambios en la resistencia
eléctrica que se producen cuando una partícula
no conductora en suspensión en un electrolito
atraviesa un pequeño orificio.
•El contador consta de dos cámaras separadas
por un material no conductor, en el que hay un
orificio de tamaño similar al de las células.
•Cada cámara contiene un electrodo, la
suspensión de células a ser contadas se coloca
en una de las cámaras y se aplica presión para
que las células pasen a la otra cámara a través
del orificio, cada vez que una célula pasa a través
del orificio ocasiona un cambio en la
conductividad eléctrica que es registrado por un
dispositivo electrónico y de esta manera el
contador indica el número de células en esa
suspensión.
 Cell Coulter :Ventajas y desventajas

•Es posible contar y medir varios miles de partículas por

segundo, independientemente de su forma, color y
densidad.
•Las limitaciones de este método son:
- Se cuentan células vivas y muertas.
- Las suspensiones deben estar libres de partículas
diferentes a los microorganismos que se cuentan, por
que el aparato no puede distinguir entre una u otra.
 Número mas probable (NMP)

•Es una técnica de estimación estadística basada en el hecho que a

mayor número de bacterias en una muestra, mayor será la dilución
necesitada para reducir la densidad hasta el punto en que ninguna
bacteria se le permita crecer en una serie de tubos de dilución.
•Se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo)
de células en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de
muestras.
•Muestras microbianas son añadidas a tubos con caldos adecuados en
unas cinco replicas e incubados, la presencia o ausencia de gas y
turbiedad formados en la fermentación da un estimado del número de
células.
•Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas
procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos
que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes.
 Número mas probable (NMP)
•Se toma la muestra original y se subdivide unas 10 veces, o mas para
evaluar la presencia/ausencia en múltiples replicas.
•El grado de dilución para el cual comienza a aparecer la ausencia
indica que los elementos se han diluido tanto que hay muchas
submuestras en las que no aparece.
•Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que
algunos tubos contendrán tan sólo un microorganismo y otros tubos
no contendrán ninguno.
•Se usan las tablas de Cochran.
•Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido
ninguna célula, se puede estimar el número más probable (NMP) de
microorganismos presentes en la muestra original, a partir de una
tabla estadística.
•El NMP es una afirmación que existe 95% de probabilidad que la
población bacteriana sea de rango correcto.
•Este método es más útil cuando las bacterias a contar no crecen en
medios sólidos, o cuando la bacteria puede crecer en un medio
líquido diferencial, como sucede con las bacterias coliformes, que
usan selectivamente lactosa.
 Número mas probable (NMP) para 6 tubos, lectura 6,3,1

10 mL de inóculo
6 tubos positivos
(com crescimento
bacteriano)

1 mL de inóculo 3 tubos positivos

1 tubos positivos
0,1 mL de inóculo
Tabla: NMP de
bacterias por 100
g (ml) de material
analizado
empleando cinco
tubos inoculados
con 10, 1 y 0.1 ml
o g de material

Tsoumada de: Enumeration

of coliforms, faecal
coliforms and of e. Coli in
foods using the MPN
methoD MFHPB-19 April
2002 por Donna
Christensen Crawford y
Rick Szabo
 Uso de la tabla
•Consideremos positivos los siguientes cultivos:
(1) 5 tubos inoculados con 10 ml de la dilución (1/10) del material :
los cinco (5) son postivos
(2) 5 tubos inoculados con 1 ml de la dilución (1/10) del material:
solo uno (1)es positivo
(3) 5 tubos inoculados con 0,1 ml de la dilución (1/100) del material:
ninguno (0) es positivo
•Cada uno de los cinco tubos de las tres diluciones representan
respectivamente a 1, 0.1 y 0.01 g (ml), del material analizado.
•La lectura se toma en la ubicación de la Tabla correspondiente a la
lectura 5-1-0 (NMP de 33) si se hubiesen utilizado 10, 1 y 0.1 g (ml)
de material.
•Como se usaron cantidades 10 veces menores (1/10) de aquellas
con las que se construyó la tabla, el valor de 33 debe multiplicarse
por 10, lo que proporciona un valor de 330 organismos por 100 g
(ml) de material.
•Como usualmente se expresa por g (ml) de material, este valor
(330) debe dividirse por 100.
•El recuento obtenido por el NMP es en este caso de
3,3 organismos por g (ml) de material analizado.