Microbiologı́a

Cultivo Batch
y
Curva de Crecimiento

Donatella Orofino ft. Valentı́n Codega

2023-10-02
1. Cuestionario de la cátedra
1. Represente gráficamente una curva tı́pica del crecimiento de una población bacteriana en un sistema cerrado. Marque
las coordenadas en el gráfico y señale las diferentes fases de un ciclo de crecimiento. ¿En qué escala se grafica?

Figura 1: Curva de crecimiento tı́pica de una población bacteriana. Un recuento de viables mide el número
de células del cultivo que son capaces de reproducirse. La densidad óptica (turbidez), una medida cuantitativa de la
dispersión de la luz por un medio de cultivo, aumenta con el aumento del número de células.

Se gráfica el log10 (organismos viables) vs. tiempo. Se utiliza la escala logarı́tmica para poder diferenciar las distitnas
fases, ya que como son curvas exponenciales, de otra manera serı́a dificultoso.
2. Describa las condiciones fisiológicas de las células en cada fase del ciclo. Discuta los factores que determinan el
inicio y el final de cada fase. ¿Qué precauciones tomarı́a para minimizar la duración de la fase lag?
Un organismo creciendo en un recipiente cerrado como un tubo o un matraz (un cultivo discontinuo, o en batch),
no puede crecer exponencialmente por tiempo indefinido. Un ciclo de crecimiento completo incluye las fases de
latencia, exponencial, estacionaria y de muerte.
Fase de latencia
Cuando un cultivo microbiano se inocula en un medio fresco, el crecimiento empieza solo tras un perı́odo de tiempo
llamado fase de latencia. Este intervalo puede ser breve o extenso, según los antecedentes del inóculo y la naturaleza
del medio y las condiciones de crecimiento. Si se transfieren células de un cultivo que estaba en la fase exponencial
al mismo medio y en las mismas condiciones de crecimiento (temperatura, ventilación, etcétera), prácticamente no
se producirá fase de latencia, y el crecimiento exponencial empezará inmediatamente.
Habrá fase de latencia en las siguientes situaciones:
Si el inóculo se toma de un cultivo viejo, normalmente habrá fase de latencia porque las células carecen de
varios constituyentes esenciales y se necesita un tiempo para su biosı́ntesis.
Si el inóculo es de poca viabilidad (pocas células vivas) o contiene células dañadas por algún agente agresor,
como altas o bajas temperaturas, radiación o sustancias tóxicas, pero no muertas.
Si se transfiere un cultivo microbiano de un medio de cultivo rico a uno más pobre (empobrecimiento del
medio); por ejemplo de un medio complejo a un medio definido. Para crecer en cualquier medio de cultivo, las
células deben contar con una dotación completa de enzimas para la sı́ntesis de los metabolitos esenciales que
no están presentes en el medio (adaptación). Por tanto, ante una reducción del medio es necesario un tiempo
para la sı́ntesis de estas enzimas y la posterior biosı́ntesis de un pequeño reservorio de cada metabolito.
Fase Exponencial
Durante el crecimiento exponencial la población de células se duplica en intervalos regulares durante un tiempo
corto o largo según los recursos disponibles y otros factores.
Las células en fase exponencial están normalmente en su mejor estado de salud , y son las mejores para estudios
sobre las enzimas y otros componentes celulares
La velocidad de crecimiento exponencial varı́a mucho, y depende de las condiciones ambientales (temperatura,
composición del medio de cultivo), ası́ como de las caracterı́sticas genéticas del propio organismo. En general, los
procariotas crecen más rápidamente que los microorganismos eucariotas, y los eucariotas más pequeños, suelen

1
 crecer más rápidamente que los grandes. Esto deberı́a recordarnos el concepto que hemos estudiado anteriormente
de la relación entre superficie y volumen. Como vimos, las células pequeñas tienen más capacidad para el intercambio
de nutrientes y desechos que las células más grandes, y esta ventaja metabólica puede influir en gran medida en el
crecimiento y otras propiedades.
Fase Estacionaria
En un cultivo discontinuo, el crecimiento exponencial no se puede mantener indefinidamente. Crecimiento en estos
cultivos es limitado, bien porque se agotan los nutrientes en el medio o bien porque se acumulan los desechos del
organismo. Cuando el crecimiento exponencial cesa por uno de estos motivos (o por ambos), la población entra en
la fase estacionaria.
No se produce aumento ni disminución netos del número de células, de modo que la velocidad de crecimiento de
la población es cero. A pesar de la parada en el crecimiento, el metabolismo energético y los procesos biosintéticos
pueden continuar, pero normalmente a una velocidad mucho más reducida. Algunas células pueden incluso dividirse
durante la fase estacionaria, pero no se produce un aumento neto del número de células, ya que algunas células del
cultivo crecen y otras mueren, de manera que ambos procesos se equilibran (crecimiento crı́ptico).
Fase Muerte
Al igual que la fase exponencial, se produce siguiendo una función exponencial. Sin embargo, normalmente la fase
de muerte es mucho más lenta que la fase de crecimiento exponencial, y en un cultivo puede haber células viables
durante meses o incluso años.
3. ¿Qué se entiende por metabolito primario y secundario, y en qué fases del crecimiento microbiano son producidos?
Dé ejemplos de cada uno.
Metabolito primario:

Esenciales para el crecimiento, desarrollo y mantenimiento de los microorganismos.

Sintetizados durante las fases tempranas y activas del crecimiento microbiano, metabolito excretado durante
la fase de crecimiento exponencial
Moléculas generalmente sencillas que participan de los caminos metabólicos esenciales.
Más baratos y sencillos de producir.
Ejemplos: aminoácidos, nucleótidos, ATP, coenzimas, glucosa.

Metabolito secundario:

Producto excretado por un microorganismo en la fase de crecimiento exponencial tardı́o y en la fase estacio-
naria.
Moléculas generalmente complejas que participan de caminos metabólicos no-esenciales, pero confieren capa-
cidades de supervivencia en situaciones de stress.
Tienen funciones especializadas y a menudo desempeñan un papel en la supervivencia, la competencia y la
adaptación del microorganismo en su entorno.
Ejemplos: Antibióticos, pigmentos, feromonas, toxinas.

4. ¿Cómo se mide el crecimiento de una población? Describa las distintas técnicas empleadas en la medición del
crecimiento y señale sus ventajas y desventajas.
Recuento por Microscopı́a
El recuento total de células microbianas en un cultivo o en una muestra natural se puede llevar a cabo simplemente
por observación y enumeración de las células presentes. El método más habitual es el recuento celular microscópico.
Se pueden hacer recuentos microscópicos en muestras secas sobre portaobjetos o en muestras lı́quidas.
Las muestras secas se pueden teñir para aumentar el contraste entre las células y el entorno. Con las muestras
lı́quidas, se usan cámaras de recuento que consisten en una rejilla con cuadrados de área conocida grabados en la
superficie de un portaobjetos de cristal. Cuando el cubreobjetos se coloca sobre la cámara, cada cuadrado de la
rejilla tiene un volumen exacto medido. Se puede contar al microscopio el número de células por unidad de área de
la rejilla, y se obtiene una medida del número de células por volumen de la cámara.
Inconvenientes y Fuentes de error:
Sin técnicas de tinción especiales, las células muertas no pueden distinguirse de las vivas, y es difı́cil conseguir
la precisión incluso aunque se repitan los recuentos.
Difı́cil ver las células pequeñas al microscopio, lo que puede llevar a recuentos erróneos, y las suspensiones
celulares de baja densidad tendrán pocas células (si es que hay alguna) en el campo del microscopio a no ser
que se concentren y resuspendan previamente en un volumen pequeño.
Las células con motilidad tienen que estar muertas o inmovilizadas de algún modo antes de contarlas, y los
desechos presentes en la muestra se pueden confundir fácilmente con células.

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Recuento de Células Viables o Recuento en Placa
Una célula viable es la que es capaz de dividirse y formar descendencia, son las de interés. Son necesarias placas
de agar. Se supone que cada célula viable crecerá y se dividirá para formar una colonia, de manera que el número
de colonias refleja el número de células.
Existen al menos dos métodos: siembra por extensión en placa y siembra por vertido en placa.

Figura 2: Dos métodos para la determinación de viables.

Con ambos métodos es importante que el número de colonias que se desarrollen en el medio no sea ni demasiado
alto ni demasiado bajo. En las placas demasiado llenas es posible que no todas las células formen colonias; además,
algunas colonias podrı́an fusionarse, lo que provocarı́a mediciones erróneas. Si el número de colonias es demasiado
pequeño, la significación estadı́stica del recuento será baja. La práctica habitual, que es la más válida a efectos
estadı́sticos, es contar colonias solamente en placas que tengan entre 30 y 300 colonias. Para obtener el número de
colonias adecuado, casi siempre hay que diluir la muestra que se va a contar.
Inconvenientes y Fuentes de error:
Si se cuenta un cultivo mixto, no todas las células depositadas en la placa formarán colonias a la misma
velocidad; si se usa un tiempo de incubación corto se obtendrán menos colonias de las posibles. Tamaño de
las colonias puede variar. Si se desarrollan colonias muy pequeñas, pueden pasar desapercibidas durante el
recuento. Con los cultivos puros, el desarrollo de las colonias es un proceso más sincrónico y la morfologı́a
uniforme de las colonias es la norma.
Falta de homogeneidad en las siembras
Imprecisiones en el pipeteo de la muestra lı́quida
Muestras no uniformes (por ejemplo, muestras con grumos celulares)
Mezclado insuficiente
Intolerancia al calor (si se preparan las placas por el método de vertido)
Si hay dos o más células juntas crecerán para formar una sola colonia, ası́ que si una muestra contiene muchos
grumos el recuento de viables será equivocadamente bajo. Los datos de estas muestras se suelen expresar como
número de unidades formadoras de colonias en lugar del número real de células viables, porque una
unidad formadora de colonia puede contener una o más células.
Recuento por Espectrofotometrı́a
Durante el crecimiento exponencial, todos los componentes celulares aumentan en proporción al aumento del número
de células. Uno de estos componentes es la propia masa celular. Las células dispersan la luz, y un método rápido y
práctico de estimación de la masa celular es la medición de la turbidez. Una suspensión de células tiene un aspecto
nebuloso (túrbido) a la vista porque las células dispersan la luz que pasa a través de la suspensión. Cuantas más
células hay, más se dispersa la luz y más túrbida es la suspensión. Como la masa celular es proporcional al número
de células, se puede usar la turbidez para estimarlo.
Densidad Óptica (DO): La turbidez se mide con un espectrofotómetro, un instrumento que hace pasar la luz a
través de una suspensión celular y mide la luz no dispersada que emerge.
Para organismos unicelulares, la densidad óptica es proporcional, dentro de ciertos lı́mites, al número de células.
Por tanto, las lecturas turbidimétricas se pueden usar como sustituto de los métodos de recuento total o recuento
de viables. Sin embargo, para poder hacer esto hay que preparar una curva de calibración que relacione el número
de células (recuento microscópico o recuento de viables), el peso seco o el contenido de proteı́nas con la turbidez.
En una representación de este tipo, la proporcionalidad sólo se cumple dentro de unos lı́mites.
Son rápidas y fáciles de hacer, y además normalmente no destruyen ni alteran significativamente la muestra.
Inconvenientes y Fuentes de Error:

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 Cuando la densidad es muy alta, la luz de la fotocélula del espectrofotómetro dispersada por una célula puede
ser dispersada de vuelta hacia la fotocélula por otra célula, de manera que para la fotocélula es como si esta
luz no se hubiera dispersado en absoluto. A densidades ópticas tan altas, la correspondencia unı́voca entre el
número de células y la turbidez se desvı́a de la linealidad y las mediciones de DO pierden precisión.
Para que las mediciones de la DO sean un reflejo preciso de la masa celular (y, por tanto, del número de
células) en un cultivo lı́quido, conviene reducir al mı́nimo los grumos y las biopelı́culas. Normalmente esto se
consigue agitando, revolviendo o, de alguna manera, manteniendo las células bien mezcladas durante el proceso
de crecimiento para impedir que se formen agregados y que las células nadadoras se peguen a las superficies,
que es el primer paso en la formación de biopelı́culas.

5. ¿Cómo define el tiempo de generación de un cultivo bacteriano? ¿Esperarı́a que el tiempo de generación sea una
constante caracterı́stica de una especie bacteriana? Justifique.
Tiempo de Generación (g): tiempo necesario para que una célula se divida para formar dos células hijas.
El tiempo de generación en una especie bacteriana concreta es muy variable, y depende de factores nutricionales y
genéticos ası́ como de la temperatura. En la naturaleza, las células microbianas probablemente crecen a velocidades
mucho menores que las que se observan en el laboratorio, ya que, seguramente, las condiciones y los recursos
necesarios para el crecimiento óptimo en el laboratorio no se dan en el hábitat natural, y a diferencia de lo que
ocurre en un cultivo puro, los microorganismos en la naturaleza viven con otras especies en comunidades microbianas
y deben competir con sus vecinos por los recursos y el espacio.
6. Explique que es la velocidad especı́fica de crecimiento y qué unidades tiene.
Relación fija entre el número inicial de células de un cultivo y el número presente tras un perı́odo de crecimiento
exponencial:

N = N0 2 n

donde N es el número de células finales, N0 es el número de células iniciales, y n es el número de generaciones

durante el perı́odo de crecimiento exponencial.
El tiempo de generación (g) de la población con crecimiento exponencial es t/n, donde t es la duración del crecimiento
exponencial expresada en unidad de tiempo. Sabiendo el número inicial y final de células en una población de
crecimiento exponencial, es posible calcular n, y a partir de n, el tiempo de generación, g.
Tomando el logaritmo, llegamos a la siguiente expresión:
log N − log N0
n=
log 2

log N = n × log 2 + log N0

Al graficar log(organismos viables) vs. tiempo, la pendiente resulta: m = 0, 301n/t. El término κ = 0, 301/g se
llama velocidad especı́fica de crecimiento. Sus unidades son [κ] = θ−1 .

7. Se siembran 4 células en un medio rico, la fase de latencia dura 1 h y las bacterias tienen un tiempo de generación
de 20 min, ¿cuántas bacterias habrá al cabo de 2, 4 y 6 h posteriores a la siembra?

N0 = 4 células
g = 1h
n = t/g
N = N0 2n

Si pasaron 2h: n = 2 → N = 4 × 22 = 16 células

Si pasaron 4h: n = 4 → N = 4 × 24 = 64 células
Si pasaron 6h: n = 6 → N = 4 × 26 = 256 células

8. Defina rendimiento, producción y productividad de una fermentación. ¿Qué sistema se esperarı́a que fuera más
productivo? ¿Por qué?
producto f ormado
Rendimiento: Y = sustrato consumido , ¡OjO!: No es el sustrato agregado.
g
Productividad : P = l×h velocidad a la que se produce el producto deseado
durante el proceso de fermentación.
Se expresa tı́picamente en unidades de producto por unidad de tiempo, como gramos por litro por hora (g/L/h)
o unidades formadoras de colonias por hora (UFC/h). La productividad mide la eficiencia en la producción de
producto en un perı́odo de tiempo especı́fico.

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 Producción: cantidad total de producto deseado obtenido al final de un proceso de fermentación. Se expresa
en unidades de masa del producto (como gramos o litros) o en unidades de actividad biológica (como unidades
formadoras de colonias, UFC). La producción es una medida de la cantidad absoluta del producto obtenido.

En general, se espera que un sistema de fermentación Batch sea menos productivo que un sistema de fermentación
continuo o semicontinuo. Esto se debe a que en los primeros, la producción de producto suele ser limitada por la
disponibilidad de sustrato y nutrientes, y el proceso se detiene una vez que se agotan estos recursos. Un sistema
continua o semicontinua permite la adición continua de sustrato y la eliminación de producto, lo que puede man-
tener el proceso en un estado de producción constante a lo largo del tiempo. Esto puede resultar en una mayor
productividad, especialmente en aplicaciones industriales.
La elección del sistema también depende de otros factores, como el costo de operación, la complejidad del proceso,
la facilidad de control y la calidad del producto final. Por lo tanto, la selección del sistema de fermentación más
adecuado debe basarse en un análisis integral de estos factores y los objetivos especı́ficos del proceso de producción.

9. a) Plantee el balance de masa para la biomasa en un fermentador batch en cada una de las etapas de la curva de
crecimiento de un cultivo bacteriano
dX
Fase Lag: dt =0
Fase Exponencial: dX dt = µX − αX = µX > 0 donde µ es la velocidad especı́fica de crecimiento de la
población y α es la velocidad especı́fica de muerte de la población.
Fase Estacionaria: µX = αX → dX dt = 0
dX
Fase Muerte: µX < αX → dt <0
b) En qué etapa de la curva la concentración de biomasa es constante y máxima? En la fase estacionaria.
c) ¿En qué fase de la curva un cultivo bacteriano será más sensible a la penicilina?
Suele ser más efectivo administrar el antibiótico durante la fase exponencial de crecimiento bacteriano, cuando
las células son más activas y están sintetizando activamente la pared celular. Esto se debe a que, durante
esta fase, las bacterias están experimentando una replicación celular rápida y están sintetizando activamente
nuevas paredes celulares y componentes de la membrana celular. La penicilina y otros antibióticos β-lactámicos
actúan especı́ficamente inhibiendo la sı́ntesis de la pared celular bacteriana.
La penicilina interfiere con la formación de la pared celular al inhibir una enzima llamada transpeptidasa,
que es responsable de la unión de las cadenas de peptidoglicano en la pared celular bacteriana. Cuando las
bacterias están en la fase de crecimiento exponencial y están sintetizando activamente la pared celular, son
más vulnerables a la acción de la penicilina porque la inhibición de la sı́ntesis de la pared celular interrumpe
su capacidad para mantener la integridad estructural.

10. Esquematice el fermentador utilizado en el TP de producción de biomasa y señale sus partes; ¿Cómo esterilizarı́a
el fermentador y el medio de cultivo?

Figura 3: Fermentador Industrial de Agitación

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 Figura 4: Fermentador Industrial de Agitación

Para la entrada de aire estéril se usa un filtro de profundidad. Las paletas se usan para homogeneizar las burbujas
de O2 y distribuirlas a toda la muestra. En la salida de gases se usa un filtro de membrana, ya que se pueden
arrastrar m.o., como si fuera un spray, al ambiente. El toma de la muestra llega hasta la base del fermentador.
En una fermentación industrial tı́pica, los procesos de aireación y enfriamiento son los componentes claves para la
monitorización y el ajuste en lı́nea.
Para esterilizar el fermentador optarı́a por autoclave, filtración estéril, radiación UV (superficies), CIP (esterilización
in situ). El medio de cultivo lo esterilizarı́a o con filtros de membrana o en autoclave.
11. ¿Qué parámetros controları́a durante una fermentación?

Oxı́geno disuelto
pH
Temperatura
Nutrientes
Presión
Biomasa
Agitación

12. Defina los blancos de los siguientes antibióticos y a qué microorganismos afecta:

a) Cicloheximida
Blanco: inhibe sı́ntesis de proteı́nas en ribosomas
M.O. afectado: eucariotas, como levaduras y hongos
b) Poliximidas
Blanco: se unen a los lı́pidos de membrana citoplasmática, alterando la pemeabilidad y causando la lisis
de las células
M.O. afectado: bacterias Gram-(-)
c) Penicilinas
Blanco: inhiben la sı́ntesis de la pared celular bacteriana, se unen a transpeptidasas que participan en
formación de pared celular y lleva a la lisis celular
M.O. afectado: bacterias Gram-(+), Streptococcus, Stapylococcus y Clostridium
d ) Sulfonamidas

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 Blanco: interfieren en sı́ntesis de ácido fólico, inhiben enzima que es necesaria para la formación, un cofactor
esencial para sı́ntesis de nucleótidos
M.O. afectado: amplia gama, Streptococcus y Escherichia coli
e) Rifampicina
Blanco: inhibe sı́ntesis de ARN bacteriano, impide la elongación de cadenas de ARN y detiene transcripción
M.O. afectado: Gram-(+), patógeno causante de tuberculosis

13. Problema tipo parcial - Dado el siguiente gráfico en escala Log- natural de DO600nm vs. tiempo (minutos), indique:

a) Si es posible predecir si se trata de un cultivo bacteriano o fúngico. (De ser posible, indique cuál serı́a)
No es posible predecir con certeza si se trata de un cultivo bacteriano o fúngico solo a partir de una curva de
crecimiento. Se podrı́a probar con la respuesta a un antibiótico.
b) Defina µ máxima, cómo la calcuları́a en la curva control, aclare entre qué puntos se calcuları́a, y qué unidades
tiene.
La velocidad de crecimiento en la fase exponencial es constante y máxima.
µmax : velocidad especı́fica de crecimiento máxima en la fase crecimiento exponencial.

S
Figura 5: Ecuación de Monod: µ = µmax ( S+K S
) donde [µmax ] = h− 1

Lo podrı́a calcular a partir de dX/dt = µX en la zona de linealidad de la curva de calibración.

c) ¿A qué puede deberse que las curvas G y C presenten una menor concentración celular en fase estacionaria
respecto del control?
Podrı́a deberse a la acción de un bacteriolı́tico que produjo la lisis de las células.
d ) ¿Qué significa la “viabilidad” de los microorganismos?
Refiere a su capacidad para mantenerse vivos y funcionales en un estado activo y metabolizante.
e) En cada una de las curvas del gráfico, ¿es posible conocer la concentración de microorganismos viables?
No es posible conocer la concentración de m.o. viables pq la D.O. también tiene en cuenta los m.o. muertos.

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2. Cuestionario de Patricia
1. Esquematice un fermentador de tanque aireado y agitado, señalando las partes principales.
2. Complete la tabla correspondiente a una fermentación batch:

Fase dX/dt Utilidad Proporción Metabolitos Concentración Concentración Concentración

en proceso viables/ producidos de metabolitos células
de producción no viables nutrientes tóxicos totales
Lag 0 no - - alta baja baja
Exponencial >0 si alta 1° alta baja alta
Estacionaria 0 si alta 2° baja alta máx
Muerte <0 no baja - baja alta alta

3. Defina µ, µmax , y td . ¿Qué unidades tienen?

µ: velocidad especı́fica de crecimiento de población, [µ] = 1/t

µmax : velocidad especı́fica de crecimiento máxima en la fase crecimiento exponencial.
td : tiempo de duplicación, tD = log 2/µ

Figura 6: Tiempo de duplicación.

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4. ¿Qué relación encuentra entre la ecuación de Monod y la de Michaelis-Menten? ¿qué unidades tienen las respectivas
constantes y qué indica un bajo valor de las mismas?
Ambas ecuaciones son muy similares entre sı́, ya que lo que condiciona el comportamiento de los m.o. son sus
enzimas; las constantes en ambos casos tienen unidades de concentración.
S
Ecuación de Monod: µ = µmax ( S+K S
)
[S]
Ecuación de Michaelis-Menten: ν = νmax ( [S]+K M
)

KS indica la afinidad del m.o. con un nutriente determinado. Cuanto más simple sea el nutriente, más fácil será de
utilizar el m.o., y menor el valor de la cte. En Michaelis-Menten, un valor bajo de KM indicaba una buena afinidad
de la enzima por el sustrato.
5. Defina rendimiento, producción y productividad. Compare y justifique la productividad en un sistema batch y en uno
continuo. ¿A qué puede deberse que en la escala industrial se implementen ampliamente los procesos batch?

Rendimiento: Es lo formado en relación a lo consumido. Puede estar referido a la variación de biomasa o a la

de producto, ambos frente a lo consumido de sustrato.
Producción: Es un valor numérico, dice cuánto se obtiene de algo en un determinado tiempo.
Productividad : Producción en función del tiempo. Tiene en cuenta los tiempos que no está en funcionamiento
la fermentación, sea tiempo de limpieza, llenado, latencia, etc. Se grafica la producción en función del tiempo
y se busca la productividad máxima (tangente al máximo de la curva) y la total (final del proceso).

A escala industrial, es más sencillo instalar un Batch, aunque el tamaño de los equipos deberı́a ser mayor. Sin
embargo, los Batch corren en desventaja en cuanto a la productividad. Esto es, considerando el tiempo que lleva
el lavado de un fermentador Batch y relacionándolo con el tiempo de la fermentación, se deberı́a tener parada
la producción tiempos de orden comparable al de la fermentación en sı́. Sin embargo, en un proceso continuo, se
puede tener el fermentador funcionando por varios dı́as, por lo que el tiempo que lleva limpiar, esterilizar, etc. es
despreciable frente al total.
6. ¿Cómo es una curva diáuxica y a qué puede deberse?
Curva diáuxica: curvas con un crecimiento exponencial que en determinado momento se estancan y luego de un
tiempo vuelven a crecer.

Figura 7: Diauxia

El sustrato más fácil de usar es el que se agota 1°. Luego crecen con otro sustrato pero más lentamente (menor
pendiente). Esto puede deberse por ejemplo a la presencia de dos azúcares distintos en el medio, digamos glucosa
y lactosa. En este caso, el m.o. siempre usa primero lo que le resulta más fácil, que en este caso serı́a la glucosa,
y una vez que esta se acaba debe comenzar a producir las enzimas para degradar la lactosa. De esta manera,
crece la población con glucosa, se estanca cuando metaboliza la lactosa a glucosa con las correspondientes enzimas
(hidrolasas e isomerasas) y vuelve a crecer al usar la glucosa generada.
7. Mencione el significado cada término de la siguiente ecuación correspondiente a un sistema batch:

dS µX qp X
=− − mX −
dt YX/S YP/S

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 dS
dt : tasa de cambio de la CC del sustrato (S) en función del tiempo
µX
YX/S : consumo de sustrato para formación de biomasa (crecimiento)

YX/S : rendimiento de biomasa con respecto al sustrato, cuánta biomasa se forma a partir del sustrato consumido
mX: tasa de consumo de sustrato debido a mantenimiento de biomasa (energı́a de mantenimiento), energı́a
utilizada en funciones celulares (movilidad...)
qp X
YX/S : tasa de consumo de sustrato debido a formación del producto
qp : tasa de producción del producto por unidad de biomasa y tiempo

¿Qué término/s agregarı́a en un sistema continuo?

dS µX qp X
= D(Sin − S) − − mX −
dt YX/S YP/S

En un sistema continuo, se añaden términos adicionales para representar la entrada constante de sustrato y la
eliminación constante de biomasa y producto.

D: tasa de dilución o tasa de flujo del medio de cultivo en sistema continuo, velocidad a la que el medio fresco
entra en el sistema para reemplazar el volumen del medio de cultivo que se retira del sistema
Sin : concentración de sustrato en el medio fresco que entra en el sistema continuo
D(Sin − S): entrada constato de sustrato en el sistema continuo y la eliminación constante de sustrato a través
del flujo del medio de cultivo

8. Mencione los métodos usados para determinar microorganismos viables y totales, indicando cuáles requieren trabajar
en condiciones de esterilidad.
Recuento de Viables:
Recuento en placa (UFC/ml) (E)
Tinción con colorantes vitales (E)

Recuento de totales:
Medición de DO
Recuento Microscópico (cel/ml): cámara de Neubauer
Determinación de Biomasa (g/L)

9. Califique como Verdadero o Falso los siguientes enunciados sobre los antibióticos:

a) Son compuestos β-lactámicos F

No todos, solo algunos como la penicilina.
b) Son producidos por hongos filamentosos para inhibir bacterias F
No todos, pueden ser producidos por bacterias para atacar otras bacterias.
c) Son metabolitos secundarios V
d ) Los diferentes antibióticos pueden tener diferentes sitios blanco de acción V
e) Los diferentes antibióticos pueden tener diferentes mecanismos inhibitorios de acción V
f ) Pueden inducir resistencia en los microorganismos originalmente susceptibles V
Sı́, es posible que los antibióticos induzcan resistencia en microorganismos originalmente susceptibles. Este
fenómeno se conoce como ”inducción de resistencia” o ”selección de resistencia”. Sucede cuando la exposi-
ción a un antibiótico conduce al desarrollo y la propagación de cepas de microorganismos que son resistentes
a ese antibiótico especı́fico.

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10. a) ¿A qué sistema pueden corresponder estas curvas?

Pueden corresponder a un Batch, ya que el sustrato disminuye con el tiempo.

b) ¿Cómo se modificarı́an estas curvas en los otros dos sistemas?

Figura 8: (a) Batch, (b) Fed-Batch, (c) Continuo

Figura 9: Curvas de crecimiento para distintos sistemas.

c) ¿Cómo se modificarı́a la curva de producción de biomasa microbiana si por problemas en el control de tempe-
ratura no se alcanza la temperatura óptima para el crecimiento del microorganismo productor? ¿Y si falla el
sistema de enfriamiento?
Si la temperatura es subóptima, la curva de crecimiento podrı́a tener una menor pendiente. Si la temperatura
aumenta en exceso por falla del sistema de enfriamiento, se puede dar la inhibición del crecimiento y muerte,
además de que podrı́a llegar a afectar los productos.

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11. Complete la tabla:

Sistema Volumen CC Baja CC de CC de biomasa CC de metabolitos

constante de sustrato durante creciente dentro tóxicos creciente
sustrato todo proceso del fermentador dentro del fermentador
Batch sı́ no no sı́, h/f. est. sı́, f. est.
Fed-Batch no no sı́ sı́, todo el t si
Continuo sı́ sı́, EE cte. sı́ sı́, entra en 0 no, se sacan
(quimiostato)

12. En un proceso de obtención de biomasa de Saccharomyces cerevisiae mediante una fermentación batch ¿es posible
modificar y cómo?:

a) La duración de la fase lag

En una fermentación, representa un tiempo improductivo con gasto energético y alto riesgo de contaminación
(competencia).
¿Cómo evitar o disminuir duración? Inóculo...
Sembrado en el mismo medio que contenido de fermentador: si el medio del fermentador es distinto y/o más
probe que el del inóculo, las células tendrán que sintetizar enzimas esenciales y/o enzimas para sintetizar
algunos metabolitos esenciales que no estén presentes en el medio. Se puede realizar un preacondiciona-
miento para saltear esta adaptación.
En crecimiento activo: si el inóculo se toma de un cultivo ”viejo”(fase estacionaria), y se inocula en el
mismo medio, generalmente se presenta la fase lag, debido a que las células generalmente agotan una
serie de coenzimas esenciales u otros constituyentes celulares y se requiere cierto tiempo para volver a
sintetizarlas.
Células en buen estado: no hayan sido dañadas por tratamiento con calor, radiaciones o sustancias quı́micas,
puesto que requerirı́an tiempo y energı́a para reparar dicho daño.
Alta CC celular.
b) La duración de la fase exponencial
Asegurarse que nutrientes estén en exceso
Condiciones ambientales óptimas (T, pH, agitación, aireación, etc.)
c) µmax
Depende del m.o. y selección de cepas
Condiciones ambientales óptimas (T, pH, agitación, aireación, etc.)

13. Defina la velocidad de dilución (D) y su relación con el tiempo de retención. ¿Qué ventaja representa trabajar a
altos de D? ¿Hasta cuándo es posible aumentar el valor de D? Justifique su rta.
Velocidad de dilución (D): tasa de flujo o velocidad a la que se agrega medio de cultivo fresco al sistema y se
elimina el exceso de volumen del sistema. Se mide generalmente en volumen de medio de cultivo fresco por unidad
de tiempo (por ejemplo, litros por hora o metros cúbicos por segundo).

D = 1/τ

El tiempo de retención (τ ) se refiere al tiempo promedio que una unidad de volumen del lı́quido de cultivo pasa
dentro del sistema de cultivo (biorreactor) antes de ser eliminada. En otras palabras, es el inverso de la velocidad
de dilución. Un tiempo de retención más largo significa que el lı́quido de cultivo permanece en el sistema durante
un perı́odo más prolongado antes de ser reemplazado por medio fresco.
La ventaja de un D alto serı́a la mayor productividad, además del matenimiento de las condiciones óptimas de
crecimiento para los m.o.. Existe un lı́mite práctico determinado por las capacidades del sistema y las necesidades
del proceso. A medida que D se incrementa, también aumenta la demanda de medio de cultivo fresco y se requieren
sistemas de suministro y eliminación de residuos más grandes y costosos. Además, tasas de dilución extremadamente
altas pueden no ser adecuadas para ciertos microorganismos, ya que pueden resultar en un estrés considerable.
También podrı́a ocurrir que el m.o. no pueda crecer lo suficientemente rápido y se termine ”lavando”.
14. Defina trofofase e idiofase. Indique qué tipo de metabolitos se producen en cada una de ellas. Ejemplifique.

Trofofase (trofos = nutrición): fase de crecimiento activo (fase exponencial), aquı́ se producen los metabolitos
1° como las enzimas.
Idiofase (idio = caracterı́stico): fase estacionaria, donde se producen los metabolitos 2° caracterı́sticos del
m.o., como los antibióticos naturales.

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15. En una fermentación continua en un tanque aireado y agitado para la producción de biomasa de una bacteria
facultativa,

a) ¿Es posible que una levadura contaminante se elimine durante el proceso sin el agregado de antimicrobianos?
Sı́, es posible debido a...
Competencia por nutrientes
Condiciones ambientales no óptimas
Metabolitos tóxicos
En el caso de contaminación con un hongo filamentoso, es posible que este se lave, debido a que su tiempo
de duplicación es mayor que el de las bacterias. Sin embargo, esto no ocurre con las levaduras, por lo que se
acumulan.
b) En caso de querer prevenir la contaminación con levaduras desde el comienzo de la fermentación, ¿podrı́a
agregar algún antimicrobiano al medio de fermentación? Justifique su respuesta.
Deberı́a ser algún antibiótico que actúe especı́ficamente contra las levaduras, sin afectar a las bacterias. Es
posible.
c) ¿Cómo podrı́a verificar la presencia/ausencia de levaduras en el biorreactor durante el transcurso de la fer-
mentación?
Tomo una alı́cuota de muestra y miro por el microscopio por la presencia de levaduras (son más grandes).
Tinción selectiva para levaduras o me fijarı́a si se encuentra presente un producto especı́fico de dichas levaduras.
d ) ¿Cómo se afectarı́a el proceso si se cortara la aireación?
Aerobios facultativos: en condiciones adecuadas de nutrientes y cultivo pueden crecer en ausencia de O2 .
El crecimiento de los m.o. serı́a menor, y disminuirı́a la productividad.

16. ¿A qué esquema de fermentación (batch, fed batch, contı́nuo) responderı́a nuestro planeta Tierra?
En el planeta Tierra tenemos un sistema semicerrado, donde se obtiene energı́a a partir del Sol. Por ello, se podrı́a
considerar como un sistema fed-Batch.

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