Tema 2 Laboratorios de citogenética

y biología molecular
0. Introducción
La biología molecular estudia la composición, estructura y función de los ácidos
nucleicos, así como los procesos en los que están implicados.
La citogenética estudia la estructura, función y comportamiento de los cromosomas en
metafase.

1. Organización del laboratorio de citogenética y biología molecular

1.1 Organigrama del laboratorio
Director del laboratorio con amplia experiencia y formación, que coordine las distintas
secciones del laboratorio, actúe de enlace con el director técnico y proporcione
atención directa a los clientes. Tiene que dar la información de los resultados
patológicos que encuentre en las determinaciones que se han realizado. También
interrelaciona las distintas técnicas analíticas que pueden aplicarse en un determinado
protocolo, se encarga de la validación de nuevas metodologías y supervisa las
técnicas de uso.
Coordinador de área, controla y gestiona las técnicas y el personal asociado a cada
tipo de muestras. Analiza el apartado técnico, el apartado de estudio y valoración.
Coordinador técnico, se encarga de supervisar y organizar el equipo humano dedicado
a la recepción y procesado de las muestras biológicas recibidas en el laboratorio.
También realiza la gestión de stock de reactivos.
Personal técnico, realiza técnicas y prepara reactivos.
Personal de estudio, se encuentran realizando tesis doctorales, trabajos de master,
practicas, etc. la mayoría financiados con becas.

Director técnico

Director de laboratorio

Coordinador de área

Coordinador técnico Personal de estudio

Todos los protocolos técnicos y PNT deben ser autorizados por el director y el
coordinador del área Personal
correspondiente
técnico y han de ponerse en conocimiento y a
disposición de todo el personal. Se reevaluarán anualmente y los cambios que se
realicen en ellos se notificarán a los usuarios.
La estructura mínima necesaria debe incluir un coordinador de área, además del
director, para asegurar la supervisión adecuada de los procesos y de los resultados.

1.2 Características del personal

En el proceso de selección, se eligen personas metódicas, ordenadas, responsables,
aptas para el trabajo en equipo y con iniciativa. A estos requisitos iniciales debería
unirse a una formación amplia basada en los criterios marcados por el laboratorio.
Todos deben conocer los PNT que utilizan en los protocolos del laboratorio. El
laboratorio debe disponer de un programa establecido, así como de un registro de
cada miembro del equipo en el que conste la formación básica, técnicas que conoce,
cursos realizados, etc.

1.3 Estructura de los laboratorios

Estructura del Laboratorio de Citogenética
La estructura del laboratorio de citogenética esta diseñada para la prevención de la
contaminación. Debe estructurarse como mínimo en 3 salas:

Sala de cultivos
Es la sala limpia del laboratorio, en la que se va a realizar el procesado de muestras y
cultivos celulares. Debe estar situada en una zona tranquila, alejada de las vías de
paso habituales para evitar turbulencias. Debe estar dotada de un sistema que le
suministre aire filtrado y una ligera presión positiva para que el aire ambiente esté libre
de microorganismos. En esta sala se dispondrán las cabinas de flujo laminar, las
incubadoras y el microscopio invertido.

Sala de Laboratorio Convencional

Es la sala sucia, con el resto del equipamiento, excepto el equipo de criogenia. En esta
sala se van a realizar los procedimientos que no están directamente relacionados con
el cultivo celular, como la preparación de extensiones, tinciones, cariotipos, análisis y
confección de informes de los resultados obtenidos, citogenética molecular, etc. Esta
área puede tener una zona oscura para el microscopio de fluorescencia.
- Zona de condiciones ambientales controladas, se obtienen los portaobjetos con
las preparaciones que se emplean en el estudio citogenético posterior. Se
realizan en condiciones de temperatura y humedad relativa predeterminadas
para preservar las preparaciones y que mantengan la máxima calidad posible.

- Zona de bandeo, es donde se realiza el bandeado de los cromosomas

característico que luego permite reconocerlos e identificar las anomalías que
pueden tener.
Sala de frío
Contiene los congeladores y el equipo de criogenia. Esta sala debe estar separada de
la sala de cultivos porque los congeladores generan bastantes turbulencias. Debe
mantenerse entre 4-8ºC, con el fin de minimizar el consumo de nitrógeno líquido y
alargar la vida de los congeladores.

Estructura del Laboratorio de Biología Molecular

La estructura de este laboratorio esta condicionada por la técnica principal que se
realiza en él, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Esta técnica permite obtener un gran numero de copias de un fragmento concreto de
ADN partiendo de una cantidad mínima de material genético.
Es indispensable que se cumplan los siguientes requisitos:
- Utilización de un flujo de trabajo unidireccional para evitar posibles
contaminaciones.

- Separación en diferentes salas debidamente señalizadas de los diversos

pasos necesarios para el procesado de las muestras.

Un laboratorio de Biología Moléculas debe constar, como mínimo, de 4 salas

independientes:
Sala de preparación de reactivos
Es el área limpia del laboratorio (sin ADN). En ella se preparan todos los reactivos que
se van a utilizar en el laboratorio, incluyendo la mezcla de reacción de PCR. Es
fundamental que los reactivos no se contaminen con ADN por lo que debería tener una
ligera presión positiva. Debe tener una cabina de bioseguridad.
Sala de preparación de muestras y extracción de ADN
Es una sala sucia (con ADN), por lo que seria conveniente que tuviese una ligera
presión negativa, para evitar que pueda escaparse material contaminante. Debe contar
con una cabina de bioseguridad y un espectrofotómetro.

Sala de PCR
Dispone de los termocicladores necesarios para llevar a cabo la PCR y un espacio de
trabajo para añadir las muestras de ADN a la mezcla de reacción.

Sala de post-PCR
Dispone de los equipos de electroforesis y de documentación de geles. Esta es
también una sala sucia, por lo que debería tener una ligera presión negativa. En
situaciones ideales la documentación de geles puede situarse en una sala oscura junto
con el microscopio de fluorescencia.

La estructura parcelada del laboratorio de Biología Molecular en salas no es condición

suficiente para garantizar la asepsia y así poder garantizar que los resultados
obtenidos sean fiables. Es necesario que el personal técnico sea consciente de la
extremada facilidad con la que se puede producir la contaminación de las muestras y
por ello hay que tener muy en cuenta el flujo de trabajo.
El flujo de trabajo y de las muestras debe ser siempre unidireccional, desde las áreas
limpias hacia las sucias, por lo que cada área de trabajo debe ser autónoma:
Pre-PCR → PCR → post-PCR
En una sala de aislamiento con presión positiva hay mayor presión de aire en la sala
de aislamiento que en los pasillos vecinos. Se utiliza para evitar la transmisión de
material contaminado desde el exterior hacia el interior.
Una sala con presión negativa tiene un presión inferior que la de las áreas vecinas, lo
que evita que el aire fluya fuera de la sala para evitar que pueda escaparse material
contaminante.

1.4 Equipamiento de los Laboratorios de Citogenética y de Biología

Molecular
Hay dos tipos de equipamientos en los laboratorios, el especifico y el genérico.
Los equipos e instalaciones deben cumplir los requisitos de la Comunidad Europea
(etiqueta CE).
Es conveniente duplicar los equipos esenciales para que en caso de avería no se
paralice el laboratorio.

Equipamiento en el Laboratorio de Biología Molecular

Equipamiento Específico
Es el que permite realizar las técnicas exclusivas de este laboratorio.
- Termociclador, es el aparato en el que se lleva a cabo la PCR y es básico en
cualquier laboratorio de biología molecular. Permite realizar secuencialmente
un numero elevado de ciclos repetitivos programables con temperaturas
diferentes y distintos tiempos de incubación.
· Bloque incubador, es la parte mas importante y se trata de un soporte
metálico con múltiples pocillos para colocar los tubos de reacción de
PCR. Es capaz de mantener de manera homogénea, las distintas
temperaturas que se programan para cada fase y en cada ciclo de
PCR. El rango de temperatura que pueden alcanzar estos bloques va
de 4-96ºC.
· Tapa del bloque incubador, es una tapa termostatizada a 102-105ºC
que, una vez cerrada, entra en contacto directo con la tapa de los tubos
de reacción. Esto evita que el agua de la mezcla de reacción PCR se
evapore por efecto de las temperaturas en el bloque incubador y se
condense en la tapa, lo que alteraría el desarrollo de la reacción.

- Equipo de electroforesis, sirve para separar moléculas de ácidos nucleicos

de distintos tamaños, analizar los productos amplificados en una PCR, purificar
y obtener fragmentos de tamaños concretos de ADN, etc. Se realiza mediante
un campo eléctrico en una disolución tampón en la que se sumerge un gel que
contiene las muestras de ácidos nucleicos. Estos migran con mayor o menor
velocidad a través del gel según su carga, tamaño y conformación
tridimensional. Se utiliza gel de agarosa o de poliacrilamida, dependiendo del
tamaño de las moléculas que queremos separar. La localización final de los
ácidos nucleicos en el gel se realiza con un agente fluorescente como el
bromuro de etidio.

- Documentador de geles, se utiliza para visualizar los resultados después de

terminar la electroforesis y fotografiarlos.
· Transiluminador, consiste en una fuente de luz ultravioleta situada por
debajo de una superficie transparente al UV donde se coloca el gel.
Cuando la luz ilumina el gel, el agente intercalante emite fluorescencia,
visualizándose las bandas de ácidos nucleicos.
· Cámara fotográfica, se trata de una cámara adecuada para trabajar con
luz ultravioleta y controlada por un software especifico.
También forman parte de este equipamiento especifico los secuenciadores, que se
encargan de la extracción de ácidos nucleicos y de la secuenciación de los fragmentos
que son objeto de estudio.

Equipamiento genérico
Es común con otros laboratorios, aunque algunos aparatos pueden tener
características especiales para este laboratorio.
 - Cabina de bioseguridad, en los laboratorios de BM se deben utilizar cabinas
de flujo laminar vertical de clase II, que protegen de contaminación a la
muestra, al manipulador y al medio ambiente. Su uso es importante cuando se
trabaja con ARN, ya que las ARNasas son omnipresentes y pueden degradar
el ARN de una muestra rápidamente.

- Sistema de purificación de agua, el laboratorio de BM requiere un suministro

de agua estable purificada tipo II y agua ultrapura tipo I. La elección de un
equipo de purificación de agua u otro dependerá del consumo diario de ambos
tipos de agua.

- Espectrofotómetro, sirve para medir la concentración de acido nucleico de

una muestra y su pureza en un rango de longitudes de onda entre 230-320nm.

- Microscopio de luz transmitida y fluorescencia, interpreta las técnicas de

hibridación in situ fluorescente. Es aconsejable que tenga una cámara.

- Autoclave, es imprescindible si se trabaja con microorganismos y aconsejable

en cualquier caso. Sirve para esterilizar el material de laboratorio.

- Incubador o estufa, si se trabaja con bacterias se necesitarán estufas de

cultivo de microbiología; en cambio, si se trabaja con cultivos celulares se
requerirán incubadores con CO2 y humedad controlada.

- Baño termostático, termobloque y placa calefactora, tiene temperatura

regulable y es básico para realizar incubaciones, digestiones y tratamientos
enzimáticos. La placa calefactora debe alcanzar de manera homogénea y
estable temperaturas de 95-100ºC para desnaturalizar el ADN de células y
tejidos en las técnicas de hibridación in situ.

- Centrifugadora y microcentrifugadora, deben tener rotores que permitan

centrifugar desde tubos de 50ml a Eppendorf de 0,2ml. Lo ideal es que alguna
sea refrigerada.

- Neveras y congeladores de -20ºC y -80ºC, es fundamental para conservar los

reactivos y las muestras, la mayor parte de los reactivos (enzimas) se conserva
a -20ºC, la conservación de todas las muestras de ARN y el almacenamiento a
largo plazo de muestras de ADN se realiza a -80ºC.

- Otros equipamientos pueden ser la balanza, agitadores magnéticos, vortex…

Equipamiento en el Laboratorio de Cultivos Celulares y Citogenética

El laboratorio de cultivos celulares tiene como objetivo el crecimiento de células
eucariotas en medios de cultivo artificiales en condiciones controladas.
El laboratorio de citogenética tiene como objetivo el estudio de los cromosomas de
especies eucariotas.
Equipamiento específico para Cultivos Celulares
- Cabina de flujo laminar, es la infraestructura en el interior en la cual se
realizan todos los procesos y manipulaciones de cultivos celulares. La
adecuada es la cabina de seguridad biológica clase II, que previene al cultivo,
al manipulador y al medio ambiente de la contaminación.

- Incubador de CO2, proporciona las condiciones ambientales optimas para el

crecimiento de las células en el medio de cultivo. Consta de un control de
temperatura, recircularizador del aire interior, control de CO2, control de la
humedad. Hay un incubador especial que se llama Roller y se utiliza para
incubar cultivos de células que solo crecen en monocapa alrededor de una
botella cilíndrica.

- Microscopio invertido, gracias a él se controla el crecimiento de un cultivo. El

tamaño de los frascos de cultivo impide la utilización de un microscopio óptico
convencional y por ello se recurre al microscopio invertido.

- Equipo de criogenia, permite conservar a largo plazo y en forma visible

muestras de células y líneas celulares. El equipo de criogenia está constituido
por un depósito de nitrógeno líquido.

Equipamiento específico para Citogenética

- Microscopio óptico convencional, para visualizar las metafases teñidas con
técnicas de bandeo.

- Cámara digital, para obtener imágenes de las metafases para su posterior

análisis.

- Software especifico, para análisis de metafases.

- Microscopio óptico normal y de fluorescencia, para el recuento de células.

Equipamiento genérico
- Equipo de esterilización, con autoclave y sistema de filtración.

- Sistema de purificación de agua, debe ser ultrapura, estéril y libre de

pirógenos.

- Neveras y congeladores de -20ºC y -80ºC, para conservar los reactivos.

- Centrifugas, placa calefactora para ISH, pHmetro, balanza, agitador
magnético, etc.

1.5 Formación del personal

El profesional al empezar se debe aportar una base teórica de los conceptos que
desarrollará. Seguidamente, debe realizar una etapa de practicas controladas, se
continua con una fase de trabajo real supervisado, hasta asegurar que cumple los
principios y protocolos esenciales.
La duración del periodo de formación, si se parte de que no existe experiencia previa,
seria de aproximadamente 30-45 días en el ámbito técnico y de 3 a 5 meses en el
ámbito del estudio citogenético.
Mas adelante, de manera regular, se deben realizar sesiones de formación continuada
para reciclar al personal y así mantener sus técnicas actualizadas.

2. Funciones del personal técnico en el laboratorio de citogenética y

biología molecular
En relación con el área técnica, las tareas son las siguientes:
- Calibración, limpieza y mantenimiento preventivo de los equipos que se
utilizan, con control de su buen funcionamiento.

- Recepción, identificación y registro de las muestras recibidas, cotejando la

información adjunta con el tipo de muestra.

- Preparación de los reactivos necesarios para la realización de los

procedimientos técnicos que se efectúen.

- Puesta en marcha de los cultivos celulares.

- Procesado de los cultivos celulares según el tipo de muestra y la técnica que

se va a aplicar.

- Almacenamiento y control de las muestras efectuadas.

- Obtención de las preparaciones que se destinan a otras analíticas cuando sea

necesario.

- Inventario y control del material necesario para la realización de las técnicas

que se emplean.

- Notificar cualquier incidencia o posible variación de los parámetros que se

utilizan en las diferentes técnicas al responsable del laboratorio para que
realice las gestiones apropiadas.

3. Manipulación de muestras en condiciones estériles. Técnica aséptica

Las áreas estériles son zonas libres de agentes patógenos. Para mantener las
condiciones de esterilidad se deben cumplir las normas tanto el personal como en las
instalaciones y equipos.
3.1 Personal
En las zonas estériles es necesario restringir el acceso a todo el personal que no sea
imprescindible.
Todo el personal con acceso al área debe recibir una formación específica, previa al
inicio de su trabajo en la sección, sobre el modo de actuar en condiciones de
esterilidad.
Es imprescindible seguir un protocolo estricto de la manipulación de muestras y
cultivos celulares que evite en todo momento la posibilidad de contaminación. Este
programa de formación incluye las instrucciones en procedimientos de limpieza y
esterilización, equipo y vestimenta, y uso de equipos en condiciones estériles y su
mantenimiento.
El personal adscrito a las zonas estériles necesariamente debe cumplir unos
estándares de higiene y limpieza estrictos para evitar introducir microorganismos
patógenos del exterior en las zonas estériles.
- No deben introducir relojes, maquillaje y joyas.
- Los cambios y lavado de los uniformes deben seguir una periodicidad
establecida.
- Es necesario reglamentar el equipo de trabajo: guantes, uniforme, mascarilla…
- No dejar objetos personales en zonas de trabajo.
- Utilizar siempre el uniforme de trabajo.
- Emplear guantes, mascarilla y lentes protectoras.
- No utilizar lentes de contacto.
- No comer ni beber en el laboratorio.
- No fumar en la zona de trabajo.
- Lavarse las manos antes y después del inicio de la manipulación de muestras o
cultivos.
- No llevar el uniforme en comedores ni cafeterías.
- Manipular las muestras y cultivos en campas de flujo laminar vertical.
- Utilizar siempre que sea posible material desechable de un solo uso.

3.2 Instalaciones
- Las áreas estériles deben estar separadas de las restantes zonas del
laboratorio.
- Usar los equipos, reactivos y materiales fungibles en las salas
correspondientes y nunca intercambiarlos.
- Restringir el acceso a personas.
- Limpiar y desinfectar en profundidad diariamente antes y después de su
utilización.
 - Eliminar regularmente los residuos generados.
- Los equipos de refrigeración deben tener filtros de partículas.
- En dichas zonas deben existir flujos de aire verticales o la presión del aire debe
ser positiva para evitar la entrada de microorganismos patógenos. El diferencial
de presión respecto a las áreas circundantes debe ser de 10-15 pascales.
- Las puertas no deben abrirse simultáneamente, para impedir corrientes de aire.
- Debe existir un mecanismo de apertura secuencial.
- Las superficies de trabajo deben ser suaves, impermeables e irrompibles para
evitar accidentes y facilitar su desinfección.
- Siempre que el equipamiento lo permita, las operaciones y mantenimiento
deben realizarse sin comprometer la esterilidad de la zona.
- Siempre que sea posible, utilizar material estéril de un solo uso.

3.3 Equipos
- Cabinas estériles de seguridad biológica, todas las muestras biológicas deben
manipularse dentro de cabinas estériles de seguridad biológica. En los
laboratorios de citogenética se recomienda utilizar las cabinas de clase II.
Estas deben tener protección frontal, proporcionar flujo vertical de aire a través
de un filtro HEPA y, sólo a veces, estar equipadas con mecheros tipo Bunsen.
Deben limpiarse con etanol al 70% al finalizar cada sesión de trabajo.

- Incubadores, estos equipos deben ser desinfectados de acuerdo a un protocolo

que establece cómo y cuándo debe realizarse. Es vital que estén libres de
microrganismos patógenos para evitar su multiplicación y diseminación a otros
cultivos celulares. Deben abrirse lo mínimo posible para intentar mantener los
parámetros de funcionamiento estables y evitar la entrada de agentes
patógenos.

- Poyatas/Suelos, es necesario desinfectarlos diariamente con etanol al 70% o

desinfectantes apropiados.

- Equipos de aire acondicionado, deben estar equipados con filtros especiales

para impedir que actúen como diseminadores de los agentes patógenos. Es
imprescindible mantener estos filtros siempre limpios. Debe evitarse que el flujo
de aire que expelen los equipos incida directamente sobre alguna zona
especialmente sensible.

3.4 Técnica aséptica en los laboratorios de biología molecular y

citogenética
Laboratorio de Biología Molecular
Aquí la técnica aséptica es el conjunto de actividades encaminadas a prevenir la
contaminación por microorganismos, ácidos nucleicos y nucleasas, cumpliendo dos
objetivos: prevenir la contaminación de la muestra y evitar la contaminación del
trabajador por productos biológicos y químicos peligrosos.
 - Lavado de manos, el lavado frecuente de manos es la norma de higiene básica
cuando se manipulan muestras biológicas y reactivos químicos.

- Uso de EPIs, los principales equipos son guantes sin talco y batas. El uso de
guantes debe compaginarse con otras practicas de trabajo que impidan su
contaminación con las muestras manipuladas.

- Descontaminación de superficies, la limpieza y descontaminación de las

superficies de trabajo se pueden realizar por métodos físicos, como la
irradiación con luz UV o por métodos químicos, como el lavado con soluciones
de hipoclorito sódico al 10% o descontaminantes comerciales.

- Prevención de contaminación ambiental, para prevenir la contaminación

cruzada ambiental es imprescindible el uso de cabinas de bioseguridad de
clase II y puntas de micropipeta especiales. Estas puntas de pipeta pueden ser
de dos tipos:
· De desplazamiento positivo, tienen en su interior un émbolo que las
convierte en auténticas microjeringas. Las pipetas que las utilizan tienen
un vástago que encaja en el émbolo, el cual sube y baja en el interior de
la punta succionando y expulsando el fluido, sin que este toque en
ningún momento el cuerpo de la pipeta ni se produzcan aerosoles.
· Puntas con filtro, son las mas utilizadas. Tienen un filtro en su interior
que impiden que los posibles aerosoles alcancen el cuerpo de la pipeta.

- Prevención de carryover, la contaminación por productos amplificados es un

serio problema en laboratorios de diagnóstico que amplifican continuamente las
mismas secuencias diana en un número muy elevado de muestras, puesto que
la contaminación con cantidades muy pequeñas de estos productos es
suficiente para producir falsos positivos. La norma principal para evitar el
carryover es no revertir nunca el flujo de trabajo transportando muestras
amplificadas desde las áreas de PCR o post-PCR a las zonas de preparación
de muestras y purificación de ácidos nucleicos (pre-PCR).

Laboratorios de Citogenética y Cultivos Celulares

Aquí las condiciones de trabajo se ajustan a una estricta técnica aséptica que impide
la contaminación de los cultivos con microorganismos, por eso, todas las
manipulaciones se realizan dentro de la cabina de flujo laminar.
- Lavado frecuente de manos.
- Uso de guantes y batas desechables estériles.
- La puerta de la sala siempre debe estar cerrada.
- Uso exclusivo de material y reactivos estériles.
- El material desechable estéril no es intercambiable con el de otras salas.
- No introducir mecheros bunsen en las cabinas porque genera turbulencias que
alteran el flujo laminar.
- Colocar en el interior de la cabina exclusivamente el material que se vaya a
utilizar en la sesión de trabajo.
- No sacar el material de su embalaje hasta el momento de uso, evitando tocar
con él cualquier superficie.
 - El material usado reutilizable de vidrio se puede colocar en un recipiente con
hipoclorito sódico al 10% hasta finalizar la sesión de trabajo. Después se lleva
al laboratorio general para su limpieza y esterilización.
- El material fungible utilizado en la cabina se deposita en contenedores
adecuados para material contaminado, que se retiran al finalizar la sesión de
trabajo.
- Restringir el acceso a la sala de cultivos exclusivamente al personal que esté
realizando algún procedimiento. No se deben recibir visitas en esta sala.
- Limpieza de las cabinas de flujo laminar como se indicó anteriormente.
- En las cabinas dotadas de lámpara germicida UV, esta se puede conectar
después de la limpieza un máximo de 30 minutos.
- Realizar un mantenimiento programado de las cabinas que incluya
comprobación del filtro HEPA.
- Limpieza y desinfección de superficies como se indicó anteriormente.

3.5 La contaminación de las muestras

La contaminación es la introducción accidental en la muestra de material exógeno que
altera su pureza.
Esta contaminación causa resultados erróneos o no interpretables. En este sentido, los
dos tipos de contaminantes más peligrosos son: los ácidos nucleicos extraños a la
muestra y las enzimas no deseadas que degradan ácidos nucleicos (nucleasas).
Las fuentes de contaminación pueden ser muy variadas:
- Contaminación cruzada por: material no amplificado del medio ambiente o
microorganismos ambientales, contaminantes procedentes del propio personal
técnico de laboratorio o contaminantes de las superficies de trabajo.

- Contaminación por productos amplificados generados mediante PCR en el

propio laboratorio (carryover en la terminología inglesa).

- Contaminación de los reactivos comerciales y del material fungible. Esto es

debido a que la mayoría de los fabricantes garantizan la esterilidad de sus
productos, pero esto no es sinónimo de ausencia de ADN o nucleasas. El
término estéril significa ausencia de microorganismos viables, pero algunos
métodos de esterilización no garantizan la eliminación del ADN de los
microorganismos ni la inactivación de las enzimas, sobre todos las ARNasas.