“UNIVERSIDAD DEL CENTRO DE VERACRUZ” S.C.

LICENCIATURA EN QUIMICO FARMACOBIOLOGO

ASIGNATURA

QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL II

QUINTO CUATRIMESTRE

PRACTICA 1

ENSAYO A LA FLAMA

PRACTICA 2

SEPARACION DE DOS PIGMENTOS NATURALES

DE PAPRIKA EMPLEANDO CROMATOGRAFIA DE
CAPA FINA

CATEDRÁTICO

MCQ. LIZZETTE IVETTE MORALES TOLEDO

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PRÁCTICA DE LABORATORIO
ENSAYO A LA LLAMA

I. OBJETIVO
El alumno aprende a identificar los estados basal y exitado de los átomos al aplicar
energía de absorción y obtener energía de emisión por medio de la llama.

II. INTRODUCCIÓN
En general el color de la flama se crea por una fuente de emisión en el espectro de
líneas del elemento y por tanto, a menudo se toma como una evidencia preliminar de
la presencia del elemento en una muestra.

III. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MATERIALES EQUIPOS REACTIVOS
 Mechero Bunsen   Ácido clorhídrico
 Gradilla concentrado 15 ml
 Navaja o exacto  Carbonato de sodio 0.3 g
 Vidrio de reloj  Cloruro de potasio 0.3 g
 Lápiz 2H  Cloruro de lítio 0.3 g
 Asa de cromo o  Cloruro de calcio
niquel o cucharilla de anhídrido 0.3 g
combustión  Sulfato de cobre 0.3 g
 7 tubos de ensaye  Cloruro de bario 0.3 g
 Vaso de precipitado  Cloruro de sodio 0.3 g
de 100 ml
 Pipeta de 10 ml
 Espátula
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IV. METODOLOGÍA
1. Una vez que obtuvimos los reactivos, tomamos el vaso de precipitado, introducimos
dentro de él 15 ml de ácido clorhídrico con mucho cuidado.
2. Depositar las sales en los tubos de ensaye previamente rotulados y colocar en la
gradilla.
3. Cuando tengamos todos los reactivos con cada uno de ellos tomamos una pizca
con el grafito y lo exponemos a la llama del mechero. Cuanto se termine esta acción
con un reactivo se meterá en el ácido clorhídrico para limpiar y se secará con una
franela. NOTA: tener cuidado de no introducir el lápiz completamente caliente.
4. Se observarán diferentes colores en la flama de cada uno de las sales.
5. Una vez terminada la practica preguntar por los recipientes de desechos y
colocarlos donde les correspondan. Lavar y secar el material.
NOTA: realizar esta práctica lejos de materiales inflamables. Lo ideal es realizar la practica
con el asa o la cucharilla de combustión.

V. RESULTADOS
1. El alumno deberá describir las observaciones y eventualidades acontecidas durante
la práctica.

2. Llenar la siguiente tabla con los resultados obtenidos.

Coloración de la Elemento
Compuesto Fórmula química
flama identificado
Cloruro de sodio
Sulfato de cobre
Cloruro de calcio
Carbonato de sodio
Cloruro de potasio
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Cloruro de bario
Cloruro de lítio

VI. CUESTIONARIO
1. La reacción que permite identificar un metal en una muestra mineral por medio de
calor directo es una:
2. Una muestra mineral de sal de cobre expuesta a la flama produce una coloración:
3. ¿Qué aplicaciones tiene la propiedad de los elementos de colorear a la flama?
4. Escribe los postulados de la teoría cuántica de Max Planck:
5. Escribe los postulados del modelo atómico de Bohr.
6. Como se explica lo observado en la práctica tomando como referencia la teoría
cuántica de Planck y el modelo atómico de Bohr

VII. CONCLUSIÓN
VIII. FUENTES DE CONSULTA
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PRÁCTICA DE LABORATORIO
SEPARACIÓN DE DOS PIGMENTOS NATURALES DE LA
PAPRIKA, EMPLEANDOR CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA Y
DE CAPA FINA

I. OBJETIVO
Familiarizar al estudiante con técnicas de separación como la cromatografía,
empacando una columna y realizando cromatografía de capa fina.

II. INTRODUCCIÓN
La cromatografía es un método físico de separación basado en la diferencia de distribución
de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una móvil y otra
estacionaria. Las moléculas de soluto de la mezcla son retenidas por la fase estacionaria
y arrastradas por la fase móvil, de manera que, si los componentes de la mezcla presentan
diferentes afinidades por alguna de las fases, sus velocidades medias de avance a lo largo
del sistema serán diferentes. La afinidad viene determinada por las fuerzas de tipo Van der
Waals, puentes de hidrógeno o transferencia de cargas. Los componentes que sean
fuertemente retenidos por la fase estacionaria se moverán más lentamente a lo largo de
dicha fase que aquellos que se unen débilmente. Como consecuencia de esta diferencia
de movilidad los componentes de la mezcla se separan en bandas discretas, que pueden
analizarse cualitativamente o cuantitativamente mediante el uso de los detectores
adecuados.

Fig. 1. Esquema de separación de dos analitos mediante el uso de una fase estacionaria y una móvil.
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La cromatografía es una técnica extremadamente versátil, que permite tanto la
separación de mezclas como la purificación de productos, la determinación del grado de
purezas de un compuesto, el seguimiento de reacciones o la detección y caracterización
de compuestos. Su principal ventaja frente a otros métodos de separación y purificación
consiste en que ésta técnica puede aplicarse a cantidades muy pequeñas de producto (del
orden de µg). Las técnicas cromatográficas se pueden clasificar atendiendo a varios
criterios: naturaleza de las fases (sólido, líquido, gas), relación de polaridad de las fases
(fase normal, fase inversa), mecanismo de separación (adsorción, exclusión, intercambio
iónico, reparto, afinidad), disposición de las fases (columna, en plano) y forma de desarrollo
del proceso (frontal, de desplazamiento, de elución). En la siguiente tabla se da una
relación general de los diferentes métodos cromatográficos basada en la fase móvil:

Tabla 1. Se describen los diferentes métodos cromatográficos basadas en la naturaleza de la fase móvil.
Clasificación Mecanismo de
Fase estacionaria Fase móvil
general separación
Adsorción
Cromatografía Sólido Líquido
Exclusión
líquida
Resina cambiadora Líquido Intercambio iónico
(LC)
Líquido Líquido Reparto
Cromatografía de Líquido Gas Adsorción
gases (GC) Sólido Gas Adsorción
Cromatografía de
Sólidos – especies Fluidos
fluidos supercríticos Reparto
orgánicas supercríticos
(SFC)

Cromatografía de columna (CC) y cromatografía de capa fina (TLC)

En ambas técnicas la fase móvil está constituida por un líquido, y la fase

estacionaria por un sólido y el mecanismo de separación se basa en la diferencia de
adsorción de los componentes de la mezcla en la superficie activa de la fase estacionaria.
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La primera (CC) la fase estacionaria se sitúa en un tubo (columna), en la segunda (TLC)
se deposita sobre la superficie abierta plana.

La adsorción se debe a interacciones intermoleculares del tipo dipolo-dipolo, dipolo-

dipolo inducido o enlaces de hidrógeno entre el adsorbente y el soluto. El adsorbente más
utilizado es el gel sílice (Fig 2) donde las interacciones tienen lugar en los grupos Si-OH y
Si-O-Si; también se emplea con relativa frecuencia alúmina (Al2O3).

El adsorbente debe ser inerte con la sustancia a cromatografiar. El gel de sílice

presenta carácter ácido y la alúmina puede adquirirse con carácter neutro, ácido o básico.

Cromatografía de adsorción de columna (CC)

En la figura 3 se muestra esquemáticamente una columna cromatográfica. La fase
estacionaria consiste en un sólido adsorbente empaquetado en una columna de vidrio. La
mezcla a separar (muestra) se deposita sobre la superficie superior de la fase estacionaria
quedando adsorbida en ella. A continuación, se vierte la fase móvil (eluyente) en la parte
superior de la columna y se permite su paso a través de la fase estacionaria. Durante el
proceso cromatográfico los componentes de la muestra son arrastrados por la fase móvil
a distintas velocidades efectuándose la separación. La velocidad de arrastre de cada
componente depende de su grado de adsorción en la fase estacionaria y de su afinidad
por la fase móvil.
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Fig. 3. Diagrama mostrando los componentes necesarios para realizar cromatografía de columna .

Para que la separación de los componentes de la mezcla sea efectiva, su velocidad

de migración a lo largo de la columna debe ser superficialmente diferente y la longitud de
la columna adecuada. Algunos adsorbentes comúnmente utilizados son: gel de sílice,
alúmina, sacarosa y almidón. La fase móvil consiste en un disolvente o mezcla de
disolventes, seleccionados en base a la polaridad con el fin de optimizar la separación de
los componentes de la muestra en la columna. De forma orientativa se puede establecer
el siguiente orden de polaridades para los disolventes usados con mayor asiduidad:

Éter de petróleo < tetracloruro de carbono < ciclohexáno < éter etílico < acetona < benceno
< acetato de etilo < cloroformo < etanol < metanol < agua < piridina < ácido acético.

La fase móvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria debido a la fuerza de la

gravedad.

Preparación de columna

Se llena la columna hasta un tercio de su altura con el eluyente. A continuación, se

prepara una suspensión del adsorbente (fase estacionaria) en el eluyente (fase móvil) y se
vierte lentamente (para evitar la formación de burbujas) en el interior de la columna. Esta
operación se puede realizar en varias adiciones, añadiendo más eluyente a la suspensión
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a medida que sea necesario. Con el fin de favorecer una distribución más uniforme del
adsorbente en la columna, así como eliminar las pequeñas burbujas que se puedan haber
formado, se puede golpear suavemente la pared externa de la columna con un tubo de
goma. La columna se llena aproximadamente la mitad de su altura, reservándose la parte
superior para la fase móvil. Se abre la llave de la columna y se deja fluir el eluyente hasta
que la altura de éste en la columna quede aproximadamente un milímetro por encima del
adsorbente. La superficie de la fase estacionaria debe presentar un aspecto uniforme, liso
y perpendicular al eje longitudinal de la columna.

NOTA: a lo largo del proceso cromatográfico la columna nunca debe “secarse”, esto es, la
fase estacionaria debe encontrarse en todo momento cubierta por la fase móvil, ya que de
lo contrario la fase estacionaria se contraería y agrietaría.

Aplicación de la muestra

La muestra se deposita (“siembra”) en la superficie superior del adsorbente

contenido en la columna con la ayuda de una pipeta. Si la muestra es líquida se puede
sembrar directamente, si es sólida se siembra una solución concentrada de la misma en
un disolvente adecuado (de baja polaridad). Para evitar que se deforme la superficie del
adsorbente de la adición, se puede depositar la muestra en la pared interior de la columna
permitiendo que resbale hasta la superficie del adsorbente. Finalizada la adición de la
muestra se abre la llave de la columna y se eluye hasta que la muestra sea adsorbida y el
nivel del líquido quede aproximadamente 1 mm por encima de la superficie del adsorbente.
Se lavan las paredes internas de la columna con un poco de eluyente y se eluye de nuevo
hasta que el nivel del líquido vuelva a quedar a 1 mm por encima de la superficie del
adsorbente.
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Desarrollo/evolución de la columna

Una vez sembrada la muestra, se llena la parte superior libre de la columna con el
eluyente y se abre la llave de la columna estableciendo un flujo continuo de la fase móvil.
Se van tomando fracciones consecutivas del eluyente que serán examinadas
posteriormente para determinar su composición. A medida que sea necesario se va
adicionando más eluyente a la parte superior de la columna, hasta que el análisis de las
fracciones confirme que la elución de los componentes de la mezcla se ha completado.

Fig. 4. Esquema de la separación de dos componentes por cromatografía de columna.

Cromatografía de adsorción de capa fina (TLC)

En la cromatografía en capa fina la fase estacionaria se deposita, formando una

capa delgada, sobre un material de soporte tal como placas de vidrio o aluminio. La fase
móvil asciende a lo largo de la fase estacionaria por capilaridad, produciéndose la
separación de los componentes de la muestra en base a su diferente distribución entre la
fase móvil y la fase estacionaria, de forma análoga a la descrita en el apartado anterior
para la cromatografía de columna. En lo que se refiere a la composición de la fase móvil y
la fase estacionaria, las consideraciones que se han hecho para la cromatografía en
columna son también aplicables a la de cromatografía en placa fina. Así mismo, el campo
de aplicación de ambas técnicas es muy similar, de hecho, una de las principales
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aplicaciones de la TLC es seleccionar las condiciones óptimas para llevar acabo un CC.
Algunas de las ventajas que presenta esta técnica son su bajo costo, su rapidez y su
sensibilidad. En la fig. 5 se muestra de forma esquemática un proceso cromatográfico en
capa fina. La máxima altura que alcanza el disolvente e la placa recibe el nombre de frente
de disolvente, y se utiliza como referencia para calcular las distancias relativas recorridas
por los componentes de la mezcla en el cromatograma.

Fig. 5. Esquema de la separación de dos componentes (A y B), empleando cromatografía de capa fina
(TLC)

Se denomina factor de retardo (Rf) a la relación existente entre la distancia recorrida

por un compuesto y la recorrida por el disolvente en el mismo tiempo:

𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜

𝑅𝑓 =
𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒

𝑑𝐴
𝑅𝑓𝐴 =
𝑑𝐷

𝑑𝐵
𝑅𝑓𝐵 =
𝑑𝐷
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Fig. 6. Determinación del Rf de dos compuestos A y B.

Este factor depende tanto de las condiciones experimentales (T, grado de

saturación de la cámara de desarrollo, cantidad de muestra, etc.) como de la composición
de la fase móvil y de la fase estacionaria, pero es una constante física (al igual que el punto
de fusión) de cada especie química. Por este motivo, para un sistema cromatográfico dado
(condiciones experimentales/fase estacionaria/fase móvil), el valor de Rf de un compuesto
determinado es constante, permitiendo la identificación de especies.

Preparación de las placas

Las placas para cromatografía TLC se preparan depositando una fina capa de suspensión
del adsorbente sobre un soporte adecuado y secando el disolvente en estufa. No obstante,
existe una amplia gama de placas para TLC disponibles comercialmente con diferentes
tipos de adsorbentes y soportes.

Aplicación de la muestra

La aplicación de la muestra se realiza, generalmente, depositando una disolución

de la misma (del 0.01 al 0.1 %) aproximadamente 1 cm del borde inferior de la placa con
la ayuda de una pipeta pasteur o un capilar de vidrio. En el caso de las disoluciones diluidas
se realizan varias aplicaciones superpuestas permitiendo que el disolvente se seque entre
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aplicación y aplicación. Cuando se depositan varias muestras en la cromatoplaca, estas
deben estar espaciadas un mínimo de 1 cm entre sí.

Fig. 7. Aplicación de la muestra en placa de cromatografía de capa fina

Desarrollo de la placa

Se introduce la placa en una cámara cerrada saturada con los vapores del disolvente (fase
móvil) con el que se llevará a cabo el desarrollo. Para favorecer la saturación, se puede
introducir en la cámara un papel filtro cuya parte inferior quede sumergida en la fase móvil.
El papel filtro debe dejar una franja de la pared de la cámara al descubierto, para poder
seguir el proceso cromatográfico sin necesidad de destapar la cámara (fig. 8).

Fig. 8. Cámara de desarrollo de la placa cromatográfica.

Revelado de la placa

Existen diversos procedimientos para detectar los componentes de las muestras en la

placa tras el proceso de separación. Uno de los más utilizados consiste en incorporar a la
fase estacionaria un material flouorescente y examinar la placa, una vez finalizado el
desarrollo, bajo luz UV. Otro método consiste en nebulizar la placa con una solución de
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yodo o de ácido sulfúrico. En la presente práctica no se utilizará revelador ya que la paprika
tiene color.

III. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MATERIALES EQUIPOS REACTIVOS
 Jeringa desechable  Baño maria  Extracto de paprika
de 5 ml y de 10 ml  Fase móvil, hexano:
 Gasas acetato de etilo (95:5
 Papel filtro de 1 cm v/v)
de diámetro  Hexano
 2 g de gel sílice
 Gotero
 Cromatofolios de 3x5
cm (de no haber
elaborar con papel
filtro)
 Vaso de precipitado
 Vidrio de reloj
 Soporte universal
 Pinzas de nuez

IV. METODOLOGÍA

1. Remueva la jeringa y el embolo y colóquela en un soporte con prensa como en la

figura y coloque en el fondo de la jeringa un pedazo de gasa de 2x2 cm como filtro.
2. Pese en un vaso de precipitado pequeño, 2 g de gel de sílice.
3. Adiciones al vaso de precipitado con el gel de sílice suficiente hexano para formar
una papilla y deposite ésta en la jeringa, enjuague el vaso con unos ml más de
hexano y deposítelos en la jeringa, debe asegurarse que la mayoría del gel de sílice
se colocó en la jeringa, es la fase estacionaria.
4. Adicione a la parte superior de la jeringa un filtro de papel, para que no distorsione
la fase estacionaria cuando adicione la muestra o la fase móvil.
5. No permita que la jeringa (columna) se seque, adicione con un gotero hexano si es
necesario.
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6. Con el hexano 2 mm por encima del papel filtro, adicione 5 gotas de la muestra
(extracto de paprika) y pequeñas cantidades de la fase móvil con un gotero hasta
que la muestra esté dentro de la fase estacionaria, luego puede agregar cantidades
más grandes.
7. Continúe corriendo la columna adicionando fase móvil, el β-caroteno amarillo baja
primero, luego un segundo pigmento naranja de segundo.
8. Recoja cada uno de esos pigmentos de tubos de ensayo pequeños.
9. Concentre hasta sequedad en baño maría y en la capilla cada uno de los pigmentos
recolectados.
10. Reconstituya con una gota de hexano, cada uno de los pigmentos y aplíquelos junto
con la muestra original en una placa de capa fina de gel de sílice de 3x5 cm.
11. En un vaso de precipitado con 1 ml de fase móvil, desarrolle el cromatograma hasta
2 mm antes de la placa.
12. Compare las tres muestras que aplicó y calcule los Rf de cada pigmento.

V. RESULTADOS

VI. CUESTIONARIO
1. ¿Por qué los derivados halogenados suben más que los alcoholes en una cromatografía
en capa fina?

2. Al cambiar un eluyente menos polar por otro más polar, ¿cómo se afecta la velocidad
de elución de un alcohol? ¿y la de una cetona?

3. el valor de Rf, ¿depende del adsorbente utilizado? ¿y del eluyente?

4. ¿Cuál es la principal diferencia entre CC y TLC?

5. ¿qué tipo de fuerza causa el movimiento de la fase móvil en la cromatografía líquida de

adsorción en columna?
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VII. CONCLUSIONES

VII. FUENTES DE CONSULTA