Tema-4.

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Análisis Instrumental II

3º Grado en Química

Facultad de Ciencias Experimentales

Universidad de Almería

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
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Tema 4. Cromatografía líquida de

exclusión por tamaños y de afinidad
Raquel Picazo Merino | Analisis Instrumental II | 26/03/2019

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 Cromatografía líquida de exclusión por tamaño
La cromatografía de exclusión por tamaño, también denominada cromatografía de penetrabilidad sobre geles
o de filtración de geles cuando la fase estacionaria es un gel hinchado, es una técnica muy valiosa que se
aplica particularmente a especies de elevado peso molecular (proteínas, polímeros, ácidos grasos, glúcidos).
La separación se basa en efectos de exclusión, como diferencias en el tamaño de las moléculas y/o en su
forma.
El termino cromatografía de exclusión por tamaño, se puede utilizar cuando la separación se basa en el
tamaño molecular.

A diferencia de otros métodos cromatográficos, en la cromatografía de exclusión por tamaño no hay

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interacción química o física entre los analitos y la fase estacionaria. Los analitos de mayor tamaño no son
retenidos por lo que son excluidos y se eluyen con rapidez (avanzan a través de los espacios intersticiales),
mientras que los analitos que tienen tamaños menores que los de los poros pueden penetrar en ellos y son
retenidos por más tiempo.

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FASE MÓVIL
La fase móvil se debe de caracterizar por:

- Debe de arrastrar los diferentes componentes, sin interaccionar ni con la muestra ni con la fase
estacionaria.
- La muestra debe ser soluble en la fase móvil para evitar interferencias en los resultados.

Para elegir la fase móvil idónea para cada ocasión se debe de tener en cuenta los siguientes parámetros:

- A mayor viscosidad menos reproducibles son los resultados

- El aumento de la temperatura favorece la resolución de la muestra, que la difusión se produce con
mayor facilidad.
- Los valores bajos de fuerza iónica favorecen las interacciones iónicas soluto – fase estacionaria,
mientras los valores altos favorecen las interacciones hidrofóbicas.
- El pH influye en la ionización de los solutos y grupos activos de la fase estacionaria
- Al aumentar el flujo del disolvente se produce una disminución de la eficiencia de la columna.
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 FASE ESTACIONARIA
Como fase estacionaria se utiliza un material poroso con las siguientes características:

- Uniformidad: con tamaño de partícula y de poro determinado y uniforme

- Estabilidad: quimica (sobre todo el pH y la temperatura)
- Máxima inercia frente a los compuestos a separar
- Preparación rápida y sencilla
- Resistencia mecánica a las altas presiones

La selección de la fase estacionaria se realiza en función de:

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- El tipo de separación a efectuar (resolución total o separación en dos fracciones)
- La selectividad del gel respecto a los productos que se quieren separar
- La distribución de pesos moleculares de los componentes de la muestra

RELLENOS PARA LAS COLUMNAS

Los rellenos empleados en cromatografía de exclusión por tamaño deben ser inertes, estables, resistentes y
con un tamaño de partícula y de poro uniformes. Están compuestos por pequeñas partículas de sílice o de
polímeros, con un diámetro entre 5 y 10 μm, que tienen una red de poros donde se quedan atrapadas las
moléculas de soluto. Los analitos de mayor tamaño no son retenidos por lo que son excluidos y se eluyen con
rapidez. Los que tienen tamaños menores que los de los poros pueden penetrar en ellos y son retenidos por
más tiempo.

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Partículas de Sílice
Las partículas de sílice presentan las siguientes ventajas e inconvenientes:

- Ventajas:
• Gran rigidez, esto facilita el empacado y permite la aplicación de altas presiones
• Mayor estabilidad, lo cual permite el uso de una gran variedad de disolventes, incluida el agua.
• Regulación rápida al cambiar de disolvente
• Estabilidad a elevadas temperaturas
- Inconveniente:
• Tendencia a retener solutos por adsorción
• Capacidad para catalizar la descomposición de las moléculas de soluto.

Partículas poliméricos
En un principio, la cromatografía de exclusión por tamaño se llevo a cabo fundamentalmente utilizando
como copolímeros estireno – divinilbenceno entrecruzados de estructura semejante (excepto en que los
grupos de ácido sulfónico están ausentes). El tamaño de poro en estos polímeros se controla por el grado de
entrecruzamiento entre las cadenas poliméricas y por tanto con la cantidad relativa de divinilbenceno
presente en la producción. Como consecuencia, los rellenos poliméricos se han comercializado con distintos
tamaños promedio de poro (esto es una ventaja). Los geles de estireno – divinilbenceno son hidrofóbicos y de
este modo sólo puede utilizarse con fases móviles no acuosas (esto es un inconveniente) se utilizan fases
móviles no polares pera la cromatografía de macromoléculas solubles en disolventes orgánicos.

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 La masa molecular máxima por encima de la cual el analito ya no es retenido por un determinado relleno se
conoce como límite de exclusión.

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En la actualidad se fabrican geles hidrofílicos con los que se pueden emplear disolventes acuosos, por tanto
existen dos métodos cromatográficos:

- Cromatografía de exclusión en gel: un gel es una red tridimensional cuya estructura está
entrecruzada al azar, suelen ser polímeros hidrofílicos e insolubles. Los geles normalmente utilizados
son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida.
Geles de dextrano: gel de dextrano es un polímero ramificado de glucosa, entrecruzado y formado

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en pequeñas bolitas que se comercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintos tipos, según
el tamaño de poro, proporcionando límites de exclusión comprendidos entre 1 y 200.000 daltons.
Estos geles se identifican por una denominación de G-10 hasta G- 200, lo que se refiere a la capacidad
de retención de agua del gel multiplicada por 10. Es un gel insoluble en agua pero hidrofílico.
- Cromatografía de penetrabilidad sobre gel: emplea disolventes orgánicos no polares y rellenos
hidrofóbicos.

VOLUMEN INTERPARTÍCULA DE LA COLUMNA (V0)

El volumen interpartícula es el volumen de la columna en los intersticios de las partículas del gel. Se llama
también volumen intersticial de la columna.
En cromatografía de exclusión, el volumen interpartículaes igual al volumen de retención de un compuesto
no retenido; sin embargo, no es igual al volumen total de fase móvil en la columna. Ello se debe a que en la
práctica, las moléculas de fase móvil son siempre menores que los poros más pequeños del relleno de la
columna. Por esta razón, entrarán en todos los poros accesibles del relleno y por consiguiente se eluirán más
tarde.
Por el contrario, en la cromatografía de líquidos general el volumen total y el volumen de retención de un
compuesto no retenido, son prácticamente iguales.

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 CARACTERÍSTICAS DE LA RETENCIÓN EN CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN

El intervalo útil de pesos moleculares para un

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determinado relleno se obtiene a partir de una
curva de calibrado como la de la figura.

Análisis de una muestra patrón (parte superior);

más abajo se representan los volumenes(tiempos)
de retención frente a los logaritmos de los
correspondientes pesos moleculares

El pico A corresponde a un componente no

retenido, cuyas moléculas son mayores que los
poros más grandes de las partículas del gel
(Límite de Exclusión). Todas las moléculas con
Mw mayor que A eluirán conjuntamente en el

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pico A (no se retienen ya que no se introducen en
los poros)

El pico D, a un componente cuyas moléculas son

menores que los poros más pequeños de las
partículas del gel (Límite de Penetración).
Todas las moléculas con Mw menor que D eluirán
conjuntamente el pico D.

MwA > MwB > MwC > MwD

Las moléculas con Mw comprendido entre el Límite de Exclusión y el de Penetración son retenidas en los
poros durante un tiempo variable que depende de su Mw: Región de Penetración Selectiva.

Podemos diferenciar los siguientes volúmenes en una columna:

- Volumen intrapartícula de la columna (Vi)

Es el volumen que ocupa la fase móvil dentro de los poros de las partículas del gel. Se llama también volumen
intrasticialde la columna, o volumen estacionario de la fase móvil.

- Volumen total de fase móvil (Vt)

Es la suma de los volúmenes inter e intrapartícula:

𝑉𝑡 = 𝑉0 + 𝑉𝑖

En la definición de Vt, el volumen extra-columna del sistema (Vext lo que no es volumen del relleno, por
ejemplo conexiones…) se desprecia; si no fuera así, se debería añadir:

𝑉𝑡 = 𝑉0 + 𝑉𝑖 + 𝑉𝑒𝑥𝑡

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 PARAMETROS DE RETENCIÓN
- Volumen (tiempo) de retención de un compuesto no retenido (V0, t0)

Es el volumen de retención de un compuesto cuyas moléculas son mayores que los poros más grandes de las
partículas del gel. Será pues el primer componente en eluirse.
Si se desprecia cualquier volumen extra-columna, Vo, será igual al volumen interparticulade la columna.

- Volumen (tiempo) de retención (Vr, tr)

Es el volumen (tiempo) de un compuesto cuyas moléculas son más pequeñas que los poros más grandes de
las partículas del gel, pero mayores que los poros más pequeños.

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- Volumen de retención ajustado (V, t)

Es el volumen (tiempo) de retención menos el volumen de retención de un compuesto no retenido:

𝑉 = 𝑉𝑅 − 𝑉0

El tiempo de retención correspondiente es t:

𝑡 = 𝑡𝑅 − 𝑡0

- Volumen (tiempo) total de la fase móvil (Vt, tt)

Es el volumen (tiempo) de retención de un compuesto cuyas moléculas son menores que los poros más

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pequeños de las partículas del gel.

- Factor de retención o factor de capacidad (Ke)

Es la relación entre el volumen (tiempo) de retención ajustado y el volumen (tiempo) de retención de un

compuesto no retenido.

𝑉𝑅 − 𝑉0 𝑡𝑅 − 𝑡0
𝐾𝑒 = =
𝑉0 𝑡0

- Constante de distribución en cromatografía de exclusión (Ko)

Es la fracción del volumen intrapartícula (volumen de los poros) accesible por difusión, a las moléculas de un
determinado compuesto:

𝑉𝑅 − 𝑉0
𝐾0 =
𝑉𝑖

Para un compuesto no retenido VR = Vo, por lo que K = 0. Para un compuesto cuyas moléculas son menores
que los poros más pequeños, VR= Vt por lo que K0 = 1. En otras palabras, el valor de K0 varía entre cero y la
unidad.

En cromatografía de exclusión, K0 está relacionado con el volumen de retención de un compuesto y los

volúmenes inter e intrapartícula de la columna (Vo y Vi, respectivamente):

𝑉𝑅 = 𝑉0 + 𝐾0 𝑉𝑖

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 Además de la diferencia intrínseca de tamaño existente entre las moléculas que van a ser cromatografiadas,
hay diferentes factores que influyen en una correcta separación de las mismas:

- Longitud de la columna. La capacidad de separación de sustancias de diferente tamaño aumenta

con la longitud de la columna.
- Flujo. La resolución de la separación disminuye al aumentar el flujo del líquido con que son
arrastradas las moléculas a lo largo de la columna. Normalmente el flujo oscila entre 2 y 10 cm/h
- El volumen de la muestra a separar. Debe ser pequeño comparado con el volumen total de la
columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando volúmenes de muestra iguales o menores al
5% del volumen total.
- Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se alteran

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profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no está empaquetado homogéneamente en la
columna o se encuentra excesivamente comprimido.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS
- Ventajas
• Tiempos de separación cortos y bien definidos
• Bandas estrechas que conducen a buena sensibilidad
• No hay pérdida de muestra, porque los solutos no interaccionan con la fase estacionaria
• No se desactiva la columna porque no hay interacción entre soluto y relleno
- Desventajas
• La escala de tiempos es corta, por lo que solo se puede incluir un número limitado de picos en

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el cromatograma
• No es aplicable en la separación de muestras con componentes de tamaño semejante
(isómeros)
• Para que la resolución sea aceptable, las diferencias entre el peso molecular debe ser mayores
del 10%

APLICACIONES
- Separación de moléculas de alto Pm de productos naturales, de las especies de bajo Pm y de las sales
(separación de proteínas de aminoácidos y péptidos)
- Separación de homólogos y oligómeros
- Determinación de Pm de polímeros o productos naturales, comparando los volúmenes de elución de
patrones
- La técnica conocida como desalinización es útil, por ejemplo, para la separación de hemoglobina y
cloruro sódico.

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 Cromatografía de afinidad
La cromatografía por afinidad es un tipo de cromatografía de líquidos que se basa en la unión reversible entre
el analito de interés y un ligando específico, inmovilizado en un soporte sólido inerte. Cuando la muestra
pasa por la columna, sólo son retenidas las moléculas que se unen de manera selectiva al ligando por afinidad
y las que no se unen avanzan con la fase móvil. Después, los analitos retenidos pueden ser arrastrados
cambiando las condiciones de la fase móvil (se debilita el enlace analito – ligando).

Por tanto las características generales de esta técnica son:

- Alta selectividad en el mecanismo de retención

- Campo de aplicación restringido

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- Separación de un solo soluto o varios de la misma familia y con características similares
- Empleo de sistemas de baja presión
- Columnas cortas de escasa eficiencia cromatográfica (solo se necesitan separar unos pocos
compuestos)

Esquema general:

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 MATRICES O SOPORTES EMPLEADOS EN CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

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Las matrices o soportes empleados en cromatografía de afinidad son el material sobre cuya superficie activa
se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad, estos materiales deben poseer las siguientes
características:

- Deben ser rígidos, resistentes, insolubles, permeables y reactivos

- Deben tener una gran superficie (a mayor superficie más ligandos se pueden acoplar y por tanto hay
más separación)
- Deben tener un tamaño de grano y porosidad controlado
- Deben tener un carácter suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de
proteínas y otras moléculas

Estos materiales suelen ser de dos tipos:

- Matrices de polisacáridos (agarosa, celulosa, dextrano)

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- Matrices sintéticas (vidrio, poliacrilamida)

LIGANDOS DE AFINIDAD
Los ligandos de afinidad son moléculas bioquímicas ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte, y
son las responsables de la adsorción específica del analito.

Según su naturaleza, pueden ser macromoléculas biológicas o bien moléculas de bajo peso molecular de
biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas, respectivamente.

Según su actuación podemos distinguir dos tipos:

- Ligandos específicos: como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto
- Ligandos generales: se enlazan con un determinado grupo de compuestos bioquímicos de
características parecidas como las lectinas (que se enlazan a polisacáridos) y nucleótidos.

INMOBILIZACIÓN DEL LIGANDO

En este proceso se pueden distinguir dos etapas:

- Etapa 1. Activación del soporte, consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la superficie
del soporte.
- Etapa 2. Anclaje químico del ligando mediante la reacción de grupos del mismo con el soporte
activado.

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 FASE MOVIL
La fase móvil debe soportar el fuerte enlace entre las moléculas del analito el ligando (debe permitir el
acoplamiento analito – ligando) y, a la vez, debe ser capaz de debilitar o eliminar la unión entre el analito y el
ligando, una vez se han eliminado las especies indeseables, de modo que el analito pueda ser eluido (ej.
Cambiando el pH). Una vez finalizada la separación se produce la regeneración de la columna, generalmente
mediante el empleo de la primera fase móvil.

Según la naturaleza de los ligandos y los analitos distinguimos dos procedimientos generales de elución:

- Elución bioespecífica: la fase móvil contiene un inhibidor por el que el analito tiene preferencia
(compite con el ligando). El analito se retira entonces del ligando y es eluido.

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- Elución no específica: la fase móvil provoca un cambio en el sitio activo del ligando, mediante
variaciones del pH, de la constante dieléctrica o de la fuerza iónica del medio. También se puede
desnaturalizar el ligando mediante reacciones químicas con urea o tiocianato potásico.

APLICACIONES
La cromatografía por afinidad es muy específica y su mayor campo de aplicación se encuentra en la
purificación o aislamiento de sustancias de naturaleza biológica, como proteínas o ácidos nucleicos.

Se utiliza principalmente con fines preparativos en análisis cuantitativos, pues permite aislar con rapidez
biomoléculas en estudios bioquímicos.

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