ALUMNA : Arroyo Rua Bertha

PROFESOR : César Mario Mallaupoma

CURSO : PPP-II

HPLC
2021
Fundamentos Teóricos

La cromatografía Líquida
HPLC sirve para separar,
identificar y cuantificar
compuestos químicos.
 ¿ Qué es la cromatografía ?
Es un método de separación en el que los compuestos químicos son
separados deacuerdo a sus interaciones con la fase estacionario y la fase
móvil
Interacción de los compuestos
químicos

Interacción de los compuestos

químicos con la fase
estacionaria y móvil

Tiempo de interacción de los

compuestos químicos según la
retención generada
 INSTRUMENTOS
Es muy importante determinar los parámetros instrumentales como químicos para realizar una
buena separación (que conllevaría a la identidificación y cuantificación)
Parámetros a evaluar
 PARTES DEL EQUIPO Detector,
Plataforma de depende de la
suministro de técnica
solventes

Horno, se coloca
Autosampler la columna

Bomba, pasar la
fase móvil con
flujo constante
 TIPOS

Fase móvil : Polar

1. Fase reversa
Fase estacionaria : Apolar

Fase móvil : Apolar

2. Fase normal Fase estacionaria : Polar

La fase estacionaria puede ser un enlace

3. Intercambio
catiónico o aniónico, se emplea para análisis de
iónico
aminoácidos

4. Exclusión por Las partículas de mayor tamaño son las que

tamaño eluyen primero, se encuentra en un Tamiz o
filtro.
 Es el valor que permite identificar el grado de separación de
Resolución los componentes

Los picos
están muy
bien
separados

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 La resolución también está afectada por la
eficiencia, la selectividad y la retención

Es una manera de medir la retención de un analito

Factor de retención K
(capacidad)
Factor de selectividad Valores mayores de selectividad (alfa) indican buena
(separación) separación

Cambios que
cambian la
selectividad
en HPLC en
fase reversa
 Valores mayores de selectividad (alfa) indican buena
Factor de eficiencia
separación

Simetría del pico

 Se emplean Sílica en fase reversa y normal, se debe de tener
Columnas en HPLC en cuenta la calidad de la sílica, la pureza

Columnas analíticas : 3-10um de diámetros, partículas

Distribución y tamaño
grandes dan pobre resolución. Lo recomendable es 3.5 a
de partículas 5um

Es un tratamiento que se le da a la columna, evita que los

grupos silanol expuestos reaccionen.

End Capping
 Aquí hay que tener en cuenta la miscibilidad de los
solventes, sobre todo cuando se trabaja con distintas fases

Empleo
el
conector
0
Fase móvil

Se emplea el UV-Cut Off en el caso de trabajar con detector

UV-Violeta, se deben de conocer sus longitudes de onda

Para la preparación de la fase móvil, se tiene que tener

cuidado con la pureza, viscosidad, buen filtrato (Buffer), PH,
desgasificar la fase móvil
Compatibilidad de la membrana de filtración

Para realizar la filtración

de la Fase móvil es muy
importante conocer la
compatibilidad de la
membrana de filtración

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Importancia de la desgasificación de la Fase móvil

Una burbuja en el sistema dará muchos

inconvenientes

Al no desgasificar la fase móvil, se podría

dañar la fase estacionaria

Los picos pueden estar distorcionados

La desgasificación se da al inicio del trabajo

 Elución de la Fase móvil

La composición de porciones de fase móvil son fijas, no se

Isocrático alteran. La composición es constante

Gradiente La composición de porciones de fase móvil no son fijas, es

decir son alteradas en relación al tiempo

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 Conclusiones
• La técnica de Cromaografía líquida HPLC, es una técnica que permite separar,
identificar y cuantificar compuestos químicos que se encuentran en una matriz.

• El HPLC permite trabajar con moléculas que presenten grandes pesos moleculares.

• El End capping es una técnica que se usa para el tratamiento de las columnas de
HPLC, evitando la formación de colas en los picos.

• Para elegir la fase móvil, es necesario determinar en que fase se está trabajando.

• Para elegir la Fase estacionaria se debe de considerar ciertas propiedades químicas y

físicas del analito en relación a la columna.
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 Referencia
• Científica Andina SAC. (14 de Septiembre de 2020). Fundamentos Teóricos de HPLC
[Video]. Youtube. Obtenido de https://www.youtube.com/watch?v=nM8oCCQpE9M

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