Universidad de Chile

Facultad de Ciencias
Departamento de Biologa

Laboratorio n2
Curva de calibracin para la concentracin de
protenas y de ONF

Integrantes
Brbara Gonzlez R.
Violeta Sotomayor L.
Carrera: Licenciatura en Biologa
Fecha: 31/08/2017
 Introduccin

En una primera instancia, se prepar una serie de muestras que contenan BSA (albmina
de suero bovino), reactivo de Bradford y agua, adems de una muestra problema con una
concentracin desconocida de BSA, para luego medir su absorbancia en un
espectrofotmetro. Posteriormente se realiz una curva de calibracin donde se interpola la
muestra problema para determinar su concentracin. En un segundo experimento, se
prepar una serie de muestras que contenan fosfato de sodio (amortiguador), carbonato de
sodio, agua y ONF (o-nitrofenol), para luego medir su absorbancia en un espectrofotmetro
y realizar una curva de calibracin que se utilizar en experimentos posteriores.

La espectrofotometra es un estudio ms detallado de la absorcin de energa radiante por

las especies qumicas permite una mayor precisin en su caracterizacin y cuantificacin. El
trmino sugiere la medicin de la cantidad de energa radiante que absorbe un sistema
qumico en funcin de la longitud de onda de la radiacin. [1]
La relacin que existe entre absorcion de radiacion y la longitud de la trayectoria a travs
del medio absorbente fue formulada por Bouguer y Lambert. Posteriormente, Beer formul
la relacin entre la concentracin de la especie absorbente y el grado de absorcin. La
combinacin de ambas, da como resultado la ley de Lambert-Beer que expresa la relacin
entre absorbancia de luz monocromtica y la concentracin de un cromforo en la solucin,
relacionando la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente despus
de que en dicho medio se produzca absorcin. La ley explica que hay una relacin
exponencial entre la transmisin de luz a travs de una sustancia y la concentracin de la
sustancia, as como tambin entre la transmisin y la longitud del cuerpo que la luz
atraviesa. [2]

sta se expresa mediante la siguiente ecuacin:

= 10 (1)

O de igual manera,
= (2)

Donde:
= Intensidad saliente
= Intensidad entrante
= Coeficiente de extincin molar
= Longitud de la cubeta
= Concentracin de soluto

=Absorbancia ( )

El objetivo del prctico es realizar una curva de calibracin para ONF la que se utilizar en
trabajos posteriores, y para BSA con el fin de determinar la concentracin de una muestra
problema de BSA, adems de aplicar la ley de Lambert-Beer, para determinar otros
parmetros.
 Materiales y mtodos

Se procedi de acuerdo a la gua de laboratorio (Departamento de biologa, 2017).

Para el experimento 1.1 se diluy la muestra de BSA 5 veces, utilizando 1 [mL] de BSA y 4
[mL] de Agua destilada. La muestra problema y su duplicado se prepararon con 0,2 [mL] de
Bradford, 0,5 [mL] de BSA y 0,3 [mL] de agua.

Los materiales utilizados se detallan a continuacin:

BSA 0,1 [mg/mL] Reactivo de ONF 0,5 mM Agua 20 tubos de Espectrofotmetro

Bradford destilada ensayo

Muestra Fosfato de Carbonato de Etanol Gradilla 6 pipetas de 1mL

problema de BSA sodio 0,1 M sodio 1,0M

Resultados brutos

Experimento 1.1
Solucin patrn de BSA 100[g/mL] diluida cinco veces, 1 mL de muestra patrn de BSA
en 4 ml de 2 . La absorbancia de todas las muestras se midi en el espectrofotmetro a
595 [nm]

Tabla I. Protocolo para la obtencin de curva de calibracin para BSA.

Tubo BSA [mL] Reactivo de 2 [mL] Volumen

Bradford [mL] total [mL]

1 1 0 0,2 0,8 1

2 2 0,1 0,2 0,7 1

3 3 0,2 0,2 0,6 1

4 4 0,3 0,2 0,5 1

5 5 0,4 0,2 0,4 1

6 6 0,5 0,2 0,3 1

Para medir la absorbancia de la muestra problema, se prepara un tubo con 0,5 ml de

muestra problema, 0,2 ml de reactivo de Bradford y 0,3 ml de 2 .
Tabla II. Datos de absorbancia medida para cada concentracin en [ g/mL ] de protena.

Tubo Absorbancia BSA [g/mL] Tubo Absorbancia BSA [g/mL]

[Abs] [Abs]

1 0,442 0 4 0,810 6

1 0,492 0 4 0,823 6

2 0,600 2 5 0,850 8

2 0,650 2 5 0,832 8

3 0,722 4 6 0,944 10

3 0,703 4 6 0,887 10

Problema 0,861 - Problema 0,898 -

Experimento 1.2

Tabla III. Protocolo para la obtencin de curva de calibracin para ONF.

Tubo ONF [mL] 2 [mL] Amortiguador 2 3 [ml] Volumen

[mL] total [mL]

1 0 2,2 0,5 0,3 3

2 0,5 1,7 0,5 0,3 3

3 0,6 1,6 0,5 0,3 3

4 0,9 1,3 0,5 0,3 3

5 1,2 1,0 0,5 0,3 3

6 1,8 0,4 0,5 0,3 3

Solucin patrn de ONF 0,5 mM, como amortiguador fosfato de sodio 0,1M y carbonato de
sodio de 1,0 M. La absorbancia es medida a 420 [nm].

Tabla IV. Datos de absorbancia medida para cada concentracin en [ g/mL] de ONF.

Tubo Absorbancia ONF [g/mL] Tubo Absorbancia ONF [g/mL]

[Abs] [Abs]

1 0,002 0 4 0,349 0,15

2 0,209 0,08 5 0,483 0,2

3 0,248 0,1 6 0,725 0,3

 Anlisis de resultados

Para la construccin de los grficos se calcul el promedio de las absorbancias obtenidas a

partir de los tubos blancos, dando como resultado 0,467 [Abs] y 0,002 [Abs], para el
experimento 1.1 y 1.2 respectivamente. ste valor se rest a los valores de absorbancia
obtenidos para cada muestra, de esta forma se obtuvo la absorbancia solamente de BSA y
no la de otros compuestos.

Curva de calibracin para experimento 1.1

Figura 1. Grfico de absorbancia en relacin a la concentracin de protena g/ml. Puntos azules indican
informacin para muestras patrn, puntos rojos indican informacin para muestra problema .

El valor de la pendiente 0,0494 corresponde al coeficiente de extincin [mL/g] . A partir de

este valor y el valor obtenido del espectrofotmetro, se estima la concentracin de la
muestra problema y de su duplicado con la ecuacin (2) (longitud de la cubeta 1 cm),
15,96 [ g/mL] y 17, 44 [g/mL] en 0,5 mL respectivamente. Por lo tanto, la muestra
problema tiene una concentracin de aproximadamente 1,67 [mg] de BSA por 100 [mL] de
solucin, 16,7 [g/mL], o bien 2,53 107 . El factor de calibracin corresponde al valor
recproco de la pendiente, en este caso 20,24 [gcm/mL].

Curva de calibracin para experimento 1.2

Figura 2. Grfico de absorbancia en relacin a la concentracin de ONF [mol]

En la figura 2. Se observa que la absorbancia es directamente proporcional a la
concentracin de ONF. El valor cercano a 1 del coeficiente de extincin explica un ajuste
lineal casi perfecto. El factor de calibracin corresponde a 0,416 [gcm/mL].

Discusin

Para la construccin de las curvas de calibracin, a cada valor de absorbancia obtenido, se

le resta el valor de las absorbancias de los tubos blancos para as, obtener nicamente la
absorbancia de las sustancias de inters, de la concentracin de BSA y de ONF. De esta
manera en las figura 1 y 2 obtenemos una lnea que parte desde el origen.
Para el experimento 1.1, el reactivo de bradford en presencia de una protena se torna de
color azl, segn sea la concentracin de la protena en la solucin se observan distintas
intensidades de coloracin, lo que nos permite medir la absorbancia de la solucin con una
luz monocromtica a una frecuencia de 595 [nm].
Al graficar la absorbancia en funcin de la concentracin de BSA en [g/mL], como indica la
figura 1, para distintas concentraciones y sus duplicados, expuestos en la tabla II,
obtenemos valores por sobre y bajo la lnea de tendencia. Segn la ley de Lambert Beer, el
cuociente entre la absorbancia y la concentracin debiera ser un valor constante, siempre y
cuando el espesor del medio transparente y su coeficiente de extincin, se mantengan
iguales para todas las mediciones, (2). Por lo que debiramos haber obtenido valores que
se encontrarn nicamente sobre la lnea de tendencia, los tubos de concentraciones
tericas de 2 [g/mL] y de 10 [g/mL] son los que presentan una mayor desviacin con
respecto a los valores tericos esperados. Segn el factor de calibracin, para una
concentracin de 2 [g] por [mL] se esperara un valor de 0,098 de absorbancia, valor que
se aleja por 0,084 unidades del valor obtenido y para 10 [g] por [mL] se esperaba 0,494 de
absorbancia, 0,074 unidades de diferencia con el valor obtenido. Por lo que al momento de
preparar las soluciones no se logr de manera precisa las concentraciones deseadas, esto
es debido a errores experimentales ligados a la precisin al momento de tomar ciertos
volmenes con la pipeta. A pesar de que los valores obtenidos no se encuentran alineados,
se toma la pendiente de la lnea de tendencia como coeficiente de extincin, y su recproco
como factor de calibracin 20,24 [gcm/mL], que al multiplicarlo por la absorbancia
obtenida de la muestra problema se obtiene un valor aproximado de su concentracin, 1,67
[mg] de BSA por 100 [mL] de solucin o bien, 2,53 107 , estos valores se obtienen al
promediar la muestra problema y su duplicado.
Al comparar la concentracin de la muestra problema obtenida de 16,7 [g/mL] con el valor
real de la muestra problema de 14,2 [g/mL], se observa un error del 17,6 %, sta diferencia
se debe, en parte, a los errores experimentales asociados.
Para el experimento 1.2, se observa una relacin directa entre los valores de absorbancia
medidos a 420 [nm] y la concentracin de ONF [mol/ml]. los valores obtenidos son muy
cercanos a los valores tericos esperados. Para este caso el factor de calibracin
corresponde a 0,416 [gcm/mL] y el coeficiente de extincin a 2,41 [mL/g].
 Cuestionario
1. En trminos de absorcin de la luz Cmo se explica que un vidrio tenga color
verde?
La luz es absorbida por una molcula cuando la frecuencia de oscilacin de los electrones
coincide o se asemeja con el de la luz incidente. Se dice que un material es opaco a la
frecuencia luminosa que absorbe y transparente a la que reemite. En el vidrio comn, es
transparente a la luz visible, por tanto, transmite todas las frecuencias de la luz visible. En el
caso del vidrio color verde, ste estara compuesto de algn compuesto que absorbe la luz
visible, y que emita una radiacin electromagntica con una frecuencia correspondiente al
verde.
2. Qu se entiende por coeficiente de extincin molar?
Es un parmetro propio de cada especie que define cuan fuerte una sustancia absorbe la
luz a una longitud de onda dada por concentracin molar. [3]

3. Qu se entiende por absorbancia? D la frmula que la define, indicando

claramente el significado de los trminos.
Se define como la relacin entre la intensidad de la luz que incide sobre una muestra y la
intensidad de esa misma luz que es transmitida a travs de esa muestra.

=

Donde:
= Intensidad de luz incidente
= Intensidad de luz saliente

4. Represente grficamente la relacin entre la transmitancia y la concentracin de una

sustancia.

Figura 3. Porcentaje de transmitancia versus concentracin de una sustancia

5. Represente grficamente la relacin entre absorbancia y la concentracin de una

sustancia

Figura 4. Absorbancia vs concentracin de una sustancia

 6. Se quiere determinar la concentracin de una sustancia midiendo la absorbancia en
una longitud de onda en que tambin absorbe el solvente. Cmo poda descartar la
absorcin de este?

Se necesita realizar una muestra blanco, o sea, que contenga todos los componentes,
menos la sustancia a estudiar. Posteriormente, se mide la absorbancia de sta muestra y
ste valor se resta a la muestra que contiene la sustancia y todos los compuestos, de esta
forma se obtendr la absorbancia solamente de la sustancia a estudiar y no la de otros
componentes que tambin absorben.

Conclusiones

La espectrofotometra fue mtodo apropiado para determinar cantidad de sustancia,

relacionndolo con la cantidad de luz que absorbe sta.
La creacin de una muestra blanco es necesaria para excluir la absorbancia de
compuestos que no son de inters.
Las curvas de calibracin permitieron determinar la concentracin de una muestra
problema de BSA a travs de la concentracin y absorbancia de muestras
conocidas.
La absorbancia de una solucin y su concentracin se relacionan linealmente. A
mayor nmero de molculas (mayor concentracin), mayor interaccin de la luz con
ellas (mayor absorbancia).
La muestra de BSA al ser incolora necesita un mtodo colorimtrico para medir su
absorbancia y determinar su concentracin, no as la muestra de ONF que es
coloreada (amarillo).
 Bibliografa

[1] Day R. A & Underwood A.L (1985). Capitula 14: Espectrofotometra. En: Qumica
analtica Cuantitativa. 5th ed. Pp 459-469
[2] Daz, N. A., Ruiz, J. A. B.,et al. (2000). Espectrofometra: Espectros de absorcin y
cuantificacin colorimtrica de biomolculas. Universidad de Crdoba.8: 4-7
[3] Nelson, D., & Cox, M. (2013). Absorption of Light by Molecules: The Lambert-Beer Law.
In D. Nelson, & M. Cox, Principles of Biochemistry (p. 80). W. H. Freeman and Company