PRÁCTICA 4:

FOTOSÍNTESIS: REACCIÓN DE HILL Y PRODUCCIÓN DE O2

Laura Macías Serrano

Ángela Melero Martínez

Fiorella Patricia Nanetti Scaccabarrozzi

Raúl Pérez Millán

ÍNDICE
1. Introducción.......................................................................................................................... 3
2. Material. ............................................................................................................................... 3
3. Procedimiento. ..................................................................................................................... 4
Primera fase: aislamiento de cloroplastos ................................................................................ 4
Segunda fase: reacción de Hill .................................................................................................. 4
Tercera fase: Resultados ........................................................................................................... 5
Cuarta fase: Explicar los resultados........................................................................................... 7

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1. Introducción.
El proceso fotosintético en plantas verdes consiste básicamente en una oxido-reducción, en la
que los electrones del agua pasan al carbono del CO2 en una reacción ayudada por la luz y en la
que se libera oxígeno.

Robin Hill descubrió que, en presencia de luz y de un aceptor de electrones adecuado, no

necesariamente el CO2, los cloroplastos aislados producen oxígeno procedente de la hidrólisis
de moléculas de H2O.

En la hoja intacta, los principales aceptores de electrones de la fotosíntesis son la ferredoxina

(Fd) y el NADP+ , y en última instancia el ácido 3-fosfoglicérico. Debido a que estos aceptores
naturales se inactivan durante el proceso de aislamiento de los cloroplastos deben ser
sustituidos, en las reacciones in vitro, por otros compuestos con igual efectividad como, por
ejemplo, complejos de iones férricos, benzoquinona y colorantes derivados del indolfenol. Un
compuesto muy utilizado es el 2,6-diclorofenol indolfenol, más conocido por su abreviatura,
DCPIP. El DCPIP, en estado oxidado (forma quinona), es de color azul, y cuando se reduce (forma
fenólica), se decolora lentamente.

2. Material.
• Hojas frescas de espinacas
• Mortero
• Probeta
• Embudo
• Gasa
• Matraz Erlenmeyer
• Tubos de centrifuga
• Gradilla
• Sacarosa 0,5 M; propilenglicol al 10%; DCPIP 0,2 mM; tampón fosfato 0,1M pH 6,5 con
ClK 0,02M
• 7 tubos de ensayo
• Pipetas de 10 ml y 2 ml
• Cubeta espectrofotométrica
• Papel de aluminio
• Parafilm
• Lámpara incandescente
• Tres vasos de precipitado con agua a 30, 60 y 90 cm
• Centrífuga y espectrofotómetro.

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3. Procedimiento.
Primera fase: aislamiento de cloroplastos
1) Homogenizar el tejido vegetal (≈ 20 g), limpio de nervios y troceado, en un mortero frío
con 10 ml de sacarosa 0,5 M fría, completando paulatinamente hasta 50 ml con la misma
sacarosa. La extracción debe ser muy suave, aunque la recuperación de cloroplastos sea
baja.
2) Filtrar a través de gasa en un embudo y recogerlo en un Erlenmeyer.
3) Centrifugar durante 10 min a 1000 r.p.m. Eliminar el precipitado que contiene células
enteras, restos celulares y paredes.
4) Centrifugar el sobrenadante 10 min a 2500 r.p.m. En este caso, desechar el
sobrenadante y resuspender el precipitado, que contiene los cloroplastos aislados, en
30 ml de propilenglicol al 10%.

Segunda fase: reacción de Hill

1) Preparar 7 tubos de ensayo y añadir a cada uno los siguientes reactivos, excepto el DCPIP
que se añadirá cuando se indique:
Suspensión
Tubo Tratamiento Tampón fosfato DCPIP
cloroplastos
1 DCPI control* 6.5 0 0.3
2 Luz 30 cm 6 0.5 0.3
3 Oscuridad 30 cm 6 0.5 0.3
4 Luz 60 cm 6 0.5 0.3
5 Oscuridad 60 cm 6 0.5 0.3
6 Luz 90 cm 6 0.5 0.3
7 Oscuridad 90 cm 6 0.5 0.3

2) Anotar el tiempo cero (la hora en la que se añade el reactivo**), añadir 0,3 ml de la
solución de DCPIP al 0,1% al tubo 1 y agitar. Medir la absorbancia a 590 nm y colocar el
tubo a unos 30, 60 o 90 cm* del foco luminoso en un vaso de precipitado lleno de agua.
Volver a medir la absorbancia a los 10 y 20 minutos.
3) Añadir 0,3 ml de la solución de DCPIP a los tubos 2, 4 y 6, de forma secuencial, agitar y
medir la absorbancia a 590 nm. Colocar los tubos a 30, 60 o 90 cm del foco, según
corresponda, y volver a medir la absorbancia a los 10 y 20 min.
4) Envolver cuidadosamente con papel de aluminio los tubos 3, 5 y 7(**) . Añadir 0,3 ml de
la solución de DCPIP a cada tubo, de forma secuencial, agitar y medir la absorbancia a
590 nm. Colocar los tubos a 30, 60 o 90 cm del foco, según corresponda, y volver a medir
la absorbancia a los 10 y 20 min. Por tanto, de cada tubo habrá tres medidas, a 0 minutos
y a los 10 y 20’.

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Tercera fase: Resultados
1) Recoger los resultados de la práctica en las siguientes tablas

Abs

Tubos 0´ 10´ 20´

1 0.044 -0.017 -0.039

2 0.142 -0.026 0.052

3 0.104 0.169 0.169

4 0.522 -0.02 -0.019

5 0.219 0.196 0.191

6 0.196 0.027 -0.031

7 0.530 0.177 0.182

Distancia al foco Intensidad luminosa (IL)

100
D1 (30 cm) 𝐼𝐿 = = 100
12

100
D2 (60 cm) 𝐼𝐿 = = 25
22
100
D3 (90 cm) 𝐼𝐿 = 2 = 11.11
3

5
 2) Representación gráfica de la reducción del DCPIP y/o la producción de oxígeno que se
produce a lo largo del tiempo (la producción de oxígeno es proporcional a la reducción
del compuesto), en relación con la distancia de los tubos al foco de luz.

Resultados
0' 10' 20'

0,6
0,5
0,4
0,3
ABS

0,2
0,1
0
-0,1
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
TUBOS

Luz Oscuridad
0' 10' 20' 0' 10' 20'

0,6 0,6
0,4 0,4
ABS

ABS

0,2 0,2
0 0
-0,2 -0,2
T1 T2 T4 T6 T1 T3 T5 T7
TUBOS TUBOS

3) Representación gráfica del efecto de la intensidad luminosa (IL) sobre la reducción del
DCPIP de los tubos colocados a las distintas distancias.

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Cuarta fase: Explicar los resultados
1) ¿Por qué se utiliza sacarosa 0,5 M como medio de extracción? Explicar.
Durante el proceso de extracción de cloroplastos se utiliza la sacarosa 0,5 M para
facilitar la separación de estos de los demás restos celulares. Esta solución posee mayor
densidad que los cloroplastos, pero menor que los otros componentes celulares; por
esta razón, al finalizar la centrifugación la solución de sacarosa estará sobre los restos
celulares, pero por debajo de los cloroplastos, facilitando de esta manera su separación
y, con ello, la extracción.

2) ¿Por qué se requiere la presencia de un aceptor de electrones para el desprendimiento

de O2 observado en la reacción de Hill?
Para que una suspensión de cloroplastos pueda desprender O2 en presencia de luz se
debe suministrar un compuesto oxidado capaz de aceptar los electrones procedentes
de la fotólisis del agua, debido a que los aceptores de electrones de las plantas,
ferredoxina y NADP+, durante el proceso de extracción se inactivan.
De esta manera, el proceso desprendimiento de O2 durante la fotosíntesis se puede
separar de la fijación de CO2.

3) ¿Qué ha ocurrido en los tubos envueltos en papel de aluminio? ¿Con qué objeto se
utilizan?
Podemos observar que los tubos que se encontraban envueltos en papel de aluminio
tienen una mayor absorbancia que los que no están cubiertos por el papel. Con esto
llegamos a la conclusión de que, en ausencia de luz, la actividad fotosintética de los
cloroplastos disminuye considerablemente.
El objeto por el que utilizamos los tubos envueltos en papel de aluminio es para ver si
en ausencia de luz pueden realizar la fotosíntesis.

4) Según los resultados obtenidos ¿qué efecto tiene la intensidad luminosa sobre la
actividad de los cloroplastos? Explicar a partir de las gráficas elaboradas.
A pesar de que nuestros datos no son concluyentes se debería llegar a la conclusión de
que la luz con intensidad elevada daña a los cloroplastos, por tanto, también el proceso
de la fotosíntesis.
La fotoinhibición tiene lugar cuando la intensidad de la luz excede la capacidad del ciclo
del carbono en la planta. por lo que la saturación de la iluminación destruye los
pigmentos de las plantas, impidiendo la conversión suficiente de energía.