PRÁCTICA 09

ENZIMAS 1: Determinación de
Fosfatasa Alcalina, Lipasa y
Amilasa
Docente: Dr. César Alberto Guzmán Vigo

Curso : Bioquímica
Capacidades

1. Conoce el método enzimático colorimétrico para la determinación de Fosfatasa alcalina (ALP).

2. Determina los valores de Fosfatasa alcalina (ALP) en sangre y la relación con patologías
3. Conoce el método colorimétrico pata la determinación de Amilasa y Lipasa
4. Determina valores de Amilasa y su relación con patologías

Contenidos

Fosfatasa alcalina, importancia, fundamentos del método para su determinación, valores de referencia.
Amilasa y Lipasa, importancia, fundamentos del método para su determinación, valores de referencia.
 Introducción

Las enzimas son catalizadores de las reacciones bioquímicas. La medida de la actividad de una enzima
y la comprensión de las variables que la afectan es importante no sólo para entender la biología de la
célula sino también para el diagnóstico clínico.
Cuando se producen lesiones celulares como inflamación o necrosis de los tejidos, ciertas enzimas
pasan al plasma y sus niveles en él aumentan. Estos niveles enzimáticos en plasma se analizan para
detectar la enfermedad y llegar al diagnóstico diferencial. Una concentración normalmente alta de
una enzima en la sangre (reflejada en una alta actividad enzimática) puede ser debida a la
destrucción de células de un tejido rico en dicha enzima o al aumento del número de células , como
ocurre en los tumores. Por el contrario una baja actividad enzimática puede indicar un trastorno del
tejido en cuestión. Los niveles enzimáticos también son útiles para vigilar el curso del tratamiento.
Por tanto, la enzimología clínica es un aspecto fundamental del laboratorio clínico

Clases: 1 Oxidorreductasas. Son las enzimas que catalizan reacciones de óxido-reducción, 2.-
Transferasas. Transfieren un grupo funcional (por ejemplo, un metilo o un grupo fosfato) de un
compuesto a otro 3.- Hidrolasas, catalizan reacciones de hidrólisis, 4.- Liasas, responsables de las
reacciones de ruptura y formación de dobles enlaces, 5. Isomerasas 6. - Ligasas.
 Introducción: Fosfatasas

La medición de la actividad de la fosfatasa alcalina se

Las Fosfatasas Alcalinas son metaloenzimas emplea para el diagnóstico, monitorización y control
homodiméricas que hidrolizan fosfatos unidos a
terapéutico de enfermedades hepáticas, óseas,
nucleótidos, proteínas, y muchos otros sustratos,
a pH entre 8 y 11 y en presencia de iones Zn+2 y paratiroideas e intestinales
Mg+2 y ocasionalmente de Co+2 (Cationes Nitrofenil fosfato Nitrofenol fosfato Ión fosfato
divalentes). Tanto las fosfatasas ácidas (FAc) como
las fosfatasas alcalinas (Fal), catalizan la hidrólisis
del pnitrofenil-fosfato, a un compuesto (p-
nitrofenol) que absorbe a los 405 nm de longitud
de onda. Esta reacción generalmente ha sido
explotada con fines analíticos.
La fosfatasa alcalina sérica tiene varios
orígenes: riñón, placenta, intestino, huesos,
leucocitos. Siendo las fuentes más importantes
el hígado, los huesos e intestino
Reacción de catálisis del p-nitrofenol-
fosfato por la fosfatasa alcalina
 Introducción: Fosfatasas

Generalmente, un paciente que presenta fosfatasa alcalina alta

corre el riesgo de desarrollar principalmente trastornos en los
huesos y en el hígado, pues son las áreas en las que suele
concentrarse la mayor cantidad de esta enzima. Además, su
incremento exagerado puede desencadenar agotamiento,
fatiga, pérdida del apetito, náuseas y vómitos, hormigueo, dolor
abdominal, decoloración de la piel y fiebre.
Asimismo, esta condición puede asociarse a problemas de
salud, tales como:
Obstrucción biliar.
Afecciones y tumores óseos.
Enfermedad hepática o hepatitis.
Hiperparatiroidismo
Enfermedad de Paget.
Leucemia
Linfoma
Sarcoidosis
 Introducción: Fosfatasas

La hipofosfatasia es una enfermedad genética debida a mutaciones del gen ALPL,

que codifica la isoenzima fosfatasa alcalina. El espectro clínico de la hipofosfatasia
es muy variable. Además de las formas graves con anomalías esqueléticas que
pueden manifestarse en la infancia, existen formas adultas que se descubren
casualmente por la presencia de niveles bajos de fosfatasa alcalina. A menudo esa
alteración pasa desapercibida en un análisis efectuado por otro motivo. Sin embargo,
esos individuos pueden ser portadores de mutaciones en el gen ALPL y se
desconocía si ello se relaciona con alteraciones esqueléticas subclínicas. Puede
también estar relacionada a hipotiroidismo, escorbuto, intoxicación por vitamina D,
desnutrición grave.
 Introducción: Fosfatasas

Por causas Fisiológicas: Embarazo y

crecimiento
Por causas patológicas: colestasis,
cirrosis, tumores hepáticos, hepatitis,
hiperparatiroidismo, tumores óseos,
metástasis óseas, fracturas en
cicatrizacion, osteomalacia,
raquitismo, insuficiencia cardiaca
congestiva, mononucleosis infecciosa, FOSFATASA ALCALINA
metástasis hepática, obstrucción hipofosfatasia congénita,
intrahepática y extrahepática como hipotiroidismo, escorbuto,
cálculos biliares y cáncer de páncreas intoxicación por vitamina D,
Por uso de medicamentos: desnutrición grave.
antibióticos, antiinflamatorios,
anticonceptivos.
 Fosfatasa: Significación Clínica

La fosfatasa alcalina es una enzima ampliamente distribuida en el organismo. Hidroliza los monoésteres del
ácido ortofosfórico en medio alcalino.
En el adulto proviene en parte del hígado (fracción termoestable) y en parte del hueso, sistema
reticuloendotelial y vascular (fracción termolábil), dando lugar a distintas isoenzimas.
La actividad sérica de fosfatasa alcalina ósea, en condiciones normales, alcanza su mayor actividad en los
niños en edad de crecimiento (llegando a triplicar los niveles del adulto) debido a que esta isoenzima se
localiza en los osteoblastos (relacionados con la calcificación y formación de estructuras óseas). También es
fisiológico el aumento que se produce al final del primer trimestre del embarazo, a expensas de la
isoenzima placentaria que en este período alcanza niveles máximos aproximadamente el doble de los
valores normales).
Entre las patologías que afectan la actividad sérica de fosfatasa alcalina, se pueden citar: carcinomas
metastásicos en hígado y en hueso (productores de enzima), colestasis biliar, fenómenos osteoblásticos,
trastornos de malabsorción acompañados de lesiones ulcerosas (donde la deficiencia de vitamina D
produce osteomalacia con el consecuente aumento de fosfatasa alcalina ósea) e incluso lesiones en vías de
reparación tales como infarto agudo de miocardio, infarto pulmonar o renal.
 Fosfatasa Alcalina: Fundamento
Laboratorial

La fosfatasa alcalina (ALP) o monoéster ortofosfórico fosfohidrolasa,

hidroliza al p-nitrofenilfosfato (p-NFF), que es incoloro, produciendo
fosfato y p-nitrofenol a pH 9,8.
La velocidad de aparición del anión p-nitrofenolato (amarillo) a 405 nm,
es proporcional a la actividad enzimática de la muestra
Introducción Lipasa y Amilasa

Glicerol-éster
Proteasa Lipasa Amilasa hidrolasas

Glucagon Insulina Somatostatina Polipéptidos

pancreáticos
Introducción Lipasa y Amilasa
 Amilasa: Fundamento Clínico

La amilasa, producida principalmente en el páncreas exócrino y en las glándulas

salivales, escinde los enlaces α-1-4 glucosídicos de los polisacáridos (almidón y
glucógeno).
Se encuentra elevada en el suero de pacientes con pancreatitis aguda alcanzando
los valores más elevados entre las 24 y 30 horas posteriores al ataque, declinando
luego para volver a los niveles normales entre las 24 y 48 horas siguientes.
También se ve aumentada en este caso la excreción urinaria de la enzima,
persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 días, luego de que la actividad sérica ha
alcanzado los niveles normales.
También es posible encontrar valores aumentados en cualquier caso de "abdomen
agudo" o intervención quirúrgica en regiones próximas al páncreas.
La parotiditis bacteriana y paperas se asocian también con elevaciones en los
niveles de amilasa sérica.
 Lipasa: Fundamento Clínico

La lipasa producida principalmente en el páncreas exócrino y en

pequeñas cantidades por las glándulas salivales y mucosas gástricas,
intestinales y pulmonares, escinde las uniones de los ésteres de
glicerol de los ácidos grasos.
La determinación de la lipasa es útil para el diagnóstico y tratamiento
de las patologías del páncreas como pancreatitis aguda y obstrucción
del conducto pancreático.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta la anamnesis
del paciente, su historia clínica y otros hallazgos de laboratorio.
 Lipasa y Amilasa: Fundamento
Laboratorial

LIPASA. La lipasa hidroliza el sustrato definido 1,2-O-dilauril-racglicerol-3-glutárico-

(6’-metilresorufina)-éster para liberar ácido glutárico-metilresorufina éster,
compuesto inestable que se descompone espontáneamente liberando un
compuesto coloreado (metilresorufina) que se mide a 570 nm. La velocidad de
aparición de color es directamente proporcional a la actividad enzimática.

AMILASA
La α-amilasa hidroliza el sustrato definido 2-cloro-p-nitrofenil-α-D-maltotriósido
(CNP-G3) para liberar 2-cloro-p-nitrofenol (CNP), formándose 2-cloro-nitrofenil-
α-D-maltósido (CNP- G2), maltotriosa (G3) y glucosa. El CNP absorbe a 405 nm y
la velocidad de aparición del color es directamente proporcional
a la actividad enzimática
 Materiales y Métodos
1. FOSFATASA ALCALINA (ALP 405 AA líquida)

REACTIVOS PROVISTOS
A. Reactivo A: comprimidos para determinaciones individuales, conteniendo cada uno p-NFF suficiente para determinar
una concentración final de 10 mmol/l. 3. LIPASA AA líquida)
2. AMILASA 405 AA líquidasales de magnesio 0,5 mmol/l.
B. C), conteniendo
REACTIVOS PROVISTOS
REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: buffer de Goods
A. Reactivo A: solución 50 mmol/l, pH 8,0, con colipasa
conteniendo CNP-G3 2,25 y sales biliares.
mmol/l, cloruro de calcio 5 B. Reactivo B: solución de 1,2-O-
mmol/l, cloruro de sodio 70 dilauril-rac-glicerol-3-glutárico-
mmol/l, tiocianato de potasio (6’-metilresorufina)-éster
900 mmol/l y buffer MES pH 6, (sustrato de la lipasa) en buffer
100 mmol/l. tartrato 10 mmol/l.
 Fosfatasa: Procedimientos y Resultado

CALCULO DE LOS RESULTADOS

Fosfatasa alcalina (U/l) a 405 nm = ∆A/min x 6,812

Longitud de onda: 405 nm

 Lipasa: Procedimiento y Resultado

VALORES DE REFERENCIA
Adultos: 13 - 60 U/l (37º C)
Se recomienda que cada laboratorio establezca
sus propios
La s muy variable. Además de las formas graves con anomalías esqueléticas que pueden manifestarse en la infancia, existen
formas adultas que se descubren casualmente por la presencia de niveles bajos de
valores de referencia.
fosfatasa alcalina. A menudo esa alteración
pasa desapercibida en un análisis efectuado por otro motivo. Sin embargo, esos individuos pueden ser portadores de mutaciones
en el gen ALPL y se desconocía si ello se relaciona con alteraciones esqueléticas subclínicas.
Amilasa Procedimiento y Resultado
 BIBLIOGRAFÍA

1. Gonzales Hernández A. Principios de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. España: Elsevier; 2010.
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http://www.wiener-lab.com.ar/wienerw/corp/vademecum.vsp