Método de Bessey Lowry optimizado - Sustrato: paranitrofenilfosfato de sodio (PNPF)
Métodos utilizados en isoenzimas:
• Separación por electroforesis en distintos soportes: acetato de celulosa, poliacrilamida, agarosa,
Inhibición química con lectinas, RIA o ELISA para fracción ósea
Muestra: .-Suero o plasma con heparina.
• Anticoagulantes que acomplejan el Ca inhiben la actividad de la FAL.
• Lipemia y hemólisis disminuyen los valores. • Sueros muy ictéricos, >15 mg/dL. Interfieren con la lectura fotométrica. • Condiciones de almacenamiento: refrigerar (4°C-8°C estable en suero por una semana). • A temperatura ambiente, disminuye la actividad en un 3% en tres días.
Condiciones de almacenamiento:
• Refrigerar (4°C-8°C estable en suero por una semana).
A temperatura ambiente, disminuye la actividad en un 3% en tres días.
• La fosfatasa alcalina (Ortofosfórico monoéster fosfohidrolasa, (EC 3.1.3.1) es una enzima
ampliamente distribuida que hidroliza (3) el enlace éster (1) fosfórico entre un grupo fosfato y un radical orgánico a pH básico (pH óptimo entre 9 y 10) liberando fosfato inorgánico. Está presente en riñón, hígado, intestino y hueso. Figura: PARTE DE UNa SUBUNIDIDAD DE FAL
• La fosfatasa alcalina es una enzima que cataliza la hidrólisis del enlace éster fosfórico entre un grupo orgánico y un grupo fosforilo a pH alcalino, lo que libera fosfato al medio.
• La medida de niveles anormales de fosfatasa alcalina en el suero indican la existencia de
enfermedades óseas degenerativas (raquitismo, osteomalacia, hiperparatiroidismo secundario, osteosarcoma) o bien daños hepáticos.
http://quimicosclinicosxalapa04.spaces.live.com/ 2 • El aumento fisiológico de los niveles plasmáticos de fosfatasa alcalina se produce en animales en fase de crecimiento (se está formando tejido óseo) o en hembras gestantes (fosfatasa alcalina de la placenta).
• Esta enzima, también se utiliza como control de la adecuada pasterización de la leche y crema, dado que la fosfatasa alcalina se inactiva por calentamiento.
SIGNIFICADO CLÍNICO:
La fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima hidrolasa responsable de eliminar grupos de fosfatos de varios tipos de moléculas como nucleótidos, proteínas y alcaloides. El proceso de eliminar el grupo fosfático se denomina desfosforilación. Como sugiere su nombre, las fosfatasas alcalinas son más efectivas en un entorno alcalino.
La fosfatasa alcalina recibe el nombre de orto-fosfórico-monoéster hidrolasa. Éstas enzimas proceden
de la ruptura normal de las células sanguíneas y de otros tejidos, muchas de ellas no tienen un papel metabólico en el plasma excepto las enzimas relacionadas con la coagulación y con el sistema del complemento
La fosfatasa alcalina es una hidrolasa con muy poca especificidad de sustrato. Se encuentra presente en casi todos los tejidos del cuerpo, especialmente, en epitelio intestinal, túbulos renales, hueso, hígado y placenta. Su localización celular es la membrana.
Los individuos de los grupos sanguíneos B y O secretores tienen la isoenzima intestinal aumentado en sus sueros.
Presenta en circulación isoenzimas: tejido inespecífico (constituida por las formas múltiples: hepática, ósea, renal, glóbulo blanco y otras), intestinal, placentaria.
La fracción hepática es termoestable, en cambio, la fracción que proviene del hueso, sistema reticuloendotelial y vesicular, es termolábil. Las isoenzimas se diferencian por su estructura molecular, propiedades físicoquímicas, antigénicas y catalíticas.
Aparte de estas formas moleculares, la fosfatasa alcalina puede presentar algunas formas atípicas: como las macroenzimas: de migración rápida, fracción biliar (fracción hepática rápida o alfa rápida) y formas de migración lenta (complejos moleculares constituidos por la enzima y una molécula de IgG).
La fosfatasa alcalina (ALP) tiene identificadas por lo menos 9 isoenzimas. Cada una tiene varias propiedades de estabilidad al calor, inhibición química, y mobilidad electroforética. Entre ellas están la rápida (pre-hepática), la hepática, la ALP del hueso, placentaria, Regan, Nagao, renal, intestinal y PA.
http://quimicosclinicosxalapa04.spaces.live.com/ 3 El principal interés de los laboratorios es la diferenciación de la ALP del hueso y la hepática, y para tal fin, el mejor método es la inactivación al calor. El interés secundario es la presencia de isoenzimas de "tumor" más estables al calor: Regan, Nagao y renal.
La actividad sérica de la fosfatasa alcalina hepática está inducida por una síntesis “de novo” en el hepatocito, vinculada al proceso hepatobiliar y su separación de la membrana celular del hepatocito por medio de una fosfolipasa D, produce el aumento en circulación. En los ductos biliares esta liberación es llevada a cabo por complejos macromoleculares (lipoproteína X), que se detectan por electroforesis de las isoenzimas en los casos de colestasis (fracción biliar).
La actividad sérica de fosfatasa alcalina ósea, en condiciones normales, alcanza su mayor actividad en los niños en edad de crecimiento (llegando a triplicar los niveles del adulto) debido a que esta isoenzima se localiza en los osteoblastos (relacionados con la calcificación y formación de estructuras óseas).
También es fisiológico el aumento que se produce al final del primer trimestre del embarazo, a expensas de la isoenzima placentaria, que en este período alcanza niveles máximos (aproximadamente el doble de los valores normales), manteniéndose durante todo el embarazo y decayendo a partir del parto, encontrándose los valores basales alrededor de un mes post-parto.
UTILIDAD CLÍNICA:
Tiene dos aplicaciones clínicas muy útiles:
• Enfermedad obstructiva hepática
• Enfermedad metabólica ósea, asociada a incremento de la actividad osteoblástica, es considerada un marcador bioquímico de recambio óseo.
Monitoreo del tratamiento con hormona de crecimiento en niños con escasa estatura. Es importante ante un aumento de FAL, hacer la determinación más específica por el estudio de sus isoenzimas y otras enzimas como GGT- LAP .
http://quimicosclinicosxalapa04.spaces.live.com/ 4 Variables por enfermedad:
Aumentado:
• Obesidad. Heroína. • Enfermedades renales (raquitismo renal), • Enfermedades metabólicas óseas, enfermedades óseas (carcinoma metastásico óseo, sarcoma, mieloma, enfermedad de Paget). Osteomalacia, síndrome de malabsorción, enfermedad de Crohn. Fracturas óseas en curación. Osteodistrofia renal. Acromegalia. • Enfermedades hepáticas que cursen con algún grado de obstrucción biliar, hepatitis virales agudas crónicas, tóxicas o autoinmunes; cirrosis, cirrosis biliar primaria, colestasis intrahepática, hígado graso, carcinoma primitivo de hígado, amiloidosis hepática, enfermedad de Gaucher, septicemia, colangitis bacteriana, metástasis hepáticas, abcesos purulentos en hígado. • Colitis ulcerosa • Tirotoxicosis • Hiperparatiroidismo • malabsorción intestinal (déficit de vitamina D) • infarto agudo de miocardio • infarto pulmonar • infarto renal • Enfermedad de Hodgkin • linfoma no Hodgkin.
Disminuido:
• Hipotiroidismo • Escorbuto • Cretinismo
http://quimicosclinicosxalapa04.spaces.live.com/ 5 • Acondroplasia. Déficit calórico proteico • Deficiencia de Mg. • Enfermedad de Wilson. • Hipofosfatasia familiar.
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