UNIVERSIDAD NACIONAL SAN CRISTÓBAL DE

HUAMANGA
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y METALURGIA
ESGUELA DE FORMACIÓN PROFESIONAL DE INGENIERÍA EN

INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

PRACTICA Nº07

“HIDRÓLISIS TOTAL DEL ALMIDON”

ASIGNATURA : INGENIERIA DE BIOPROCESOS
PROFESOR : Ing. REINOSO ALBARRACIN, Tiburcio

ALUMNOS COYLLO AGUILAR, Noé

: CCONOC ROCA, Jhon.
: PALOMINO RAYME, Mark. Santiago
: ZAMORA NAJARRO, Oriol.
: HUAMANI RUIZ,Maricruz.
GRUPO : Martes 07 – 10 am

AYACUCHO PERÚ
2015
 INTRODUCCIÓN

La Cinética Enzimática, se refiere a los procesos en los cuales participan

exclusivamente las enzimas con la finalidad de acelerar la velocidad de reacción.

Ésta acción enzimática es denominada catalizadores y específicamente es un

biocatalizador, las enzimas o fermentos son sustancias proteicas con actividad
catalítica producido por organismos vivos.

Las sustancias sobre las cuales actúan se llaman substratos y estas enzimas
pueden actuar tanto en substratos homogéneos como heterogéneos.

La característica fundamental de un proceso catalizado por enzimas, es de

disminuir la energía de activación. Dentro de las reacciones catalizadas por
enzimas, tenemos a la Invertasa, Diastasa, Maltasa, pepsina, tripsina, etc.

La Acción Enzimática de las enzimas, se produce con la unión de éstas con una
molécula de substrato, para luego formar el complejo enzima-substrato y
después del proceso se forma inmediatamente el producto quedando libre la
enzima, para unirse con el nuevo substrato.
I. OBJETIVOS:

 Determinar la acción Enzimática de ᾳ- Amilasa y amiloglucosidasa sobre

la solución del almidón.
 Observar el desarrollo de hidrólisis del almidón utilizando solución de
yodo cada 10 minutos.
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. ALMIDÓN
Los almidones son polisacáridos vegetales. Fisiológicamente son sustancias de
reserva, análogas al glucógeno animal y no a los constituyentes de estructura
del tipo de celulosa o pectinas. Los almidones se encuentran principalmente en
los granos de los tubérculos como la patata, mandioca, etc. La función
nutricional de los almidones es muy importante porque constituye, después de
la hidrólisis digestiva en glucosa, la principal fuente de calorías en la
alimentación humana.
Los gránulos de almidón se rompen por el calor y una parte del contenido de
almidón es soluble en agua caliente. El almidón soluble es la amilosa y
constituye del 10-20% de la mayoría de los almidones naturales. El resto,
insolubles, es la amilopectina. La amilosa da en soluciones de yodo una
reacción bien conocida: color rojo o azul intenso; la amilopectina se vuelve roja
en contacto con el yodo.
Estructuralmente, la amilosa es una cadena recta de unidades de D-Glucosa,
cada una enlazada a la siguiente: Por su lado, la amilopectina está constituida
también por unidades de D-Glucosa, pero su estructura está compuesta de
cadenas ramificadas de unidades, y sus pesos moleculares en general son más
altos que los de la amilosa.

La Hidrólisis Parcial de la amilopectina da mezclas llamadas Dextrinas.

Naturalmente la hidrólisis completa da D-Glucosa. Se usa las Dextrinas como
aditivos de alimentos, mucílagos, pastas y en acabados de papel y tejidos.

De igual manera, cuando los gránulos de almidón se exponen al mismo tiempo

al calor y a la humedad, hay una gelatinización, por encima de 55-70°C. Si se
prolonga el tratamiento hidrotérmico, puede surgir una ruptura de los granos,
hidrólisis parcial y disolución más o menos completas de las moléculas
constituyentes.

La Diastasa es una enzima de la familia de las amilasas que existen en

diferentes fuentes vegetales, animales y microbianas. Ésta enzima cataliza las
reacciones de hidrólisis del almidón, para convertirlo en unidades de D-glucosa y
dextrinas. Ésta fracción se puede determinar con el reactivo de Fehling, para
determinar la respectiva acción enzimática.

El almidón como polisacárido puede ser hidrolizado por sustancias que rompen
los enlaces -1,4-glucosídico y -1,6-glucosídico, con el objetivo de producir
moléculas más pequeñas como las dextrinas. La determinación del grado de
hidrólisis, se debe a la cantidad de azúcares reductores que se han formado;
específicamente glucosas llamadas también dextrinas y se mide por las
unidades de dextrosa equivalente, determinada mediante el licor de Fehling.

2.2. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN

ENZIMÁTICA
Los principios de cinética enzimática, puede usarse para escribir a ecuación de
la velocidad para un modelo de enzima – substrato y enzima – producto, que fue
estudiado por Michailes Menten, es el llamado sistema unireactivo sencillo con
la aproximación al equilibrio rápido deducido por M. Menten. La reacción más
sencilla catalizada enzimáticamente implica que un único substrato da lugar a un
único producto. El sistema se llama uni-uni en la nomenclatura de Cleland,
usando la siguiente reacción:

E + S ES EP P + E

El complejo ES y EP es demasiado rápido por lo tanto, la reacción queda

expresada como:

E + S ES P + E
Realizando los cálculos matemático respectivo, la velocidad de una reacción
enzimática será igual a:

V = Vmax + (S)
Ks + (S)

Donde:

V = Velocidad enzimática
Vmax = Velocidad Máxima
(S) = Concentración del Substrato
Ks = Constante de Michailes

2.3. FORMA INTEGRADA DE LA ECUACIÓN DE MICHAILES

Está dada por la siguiente relación, determinada después de una serie
de cálculos de integraciones matemáticas:

1 Ln So = Vmax - So – Si
T Si Km TKm

La representación gráfica es la siguiente:

1 Ln So
T Si Vmax/Km

m = - (1/Km)

So-Si
T
2.4. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE REACCIONE
ENZIMÁTICAS
La velocidad de las reacciones enzimáticas, están influenciadas por diversos
factores, dentro de los principales se tiene:
a. Concentración del substrato
b. Presencia de activadores o inhibidores
c. pH óptimos para cada enzima
d. Temperaturas.

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas

por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del
mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad del enzima. La
velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa
facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima.
La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura,
presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de
sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la
velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la
aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato)

en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o
simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la
velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va
consumiendo el sustrato de la reacción (Figura de la derecha). Para evitar esta
complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La
velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a
tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v 0 se realiza
antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda
considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento.
Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa,
ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa
apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de
velocidad.

Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración

inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la
cantidad de enzima constante. Si representamos v 0 frente a [S]0 obtenemos una
gráfica como la de la Figura de la derecha. Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad
inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la
reacción es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el
sustrato, y la velocidad ya no depende de [S] 0. En este punto, la reacción es de
orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

2.5. CONCEPTO DE ENZIMA

Las enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son
proteínas Como catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan
indefinidamente.No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, no
modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución.

2.6. CATALIZADOR:
Un catalizador es una sustancia que acelera una reacción química, hasta hacerla
instantánea o casi instantánea. Un catalizador acelera la reacción al disminuir la
energía de activación.

En una transformación dada de "A" a "P" , "A" representa las moléculas

reaccionantes, que constituyen el estado inicial. "P" representa los productos o
estado final. La reacción química de A a P es un proceso posible si la energía de
P es menor que la de A. Pero hay una barrera de energía que los separa; si no
es por ella, A no existiría, puesto que no sería estable y se habría transformado
en P. Este escollo es una barrera energética, la energía de activación (Ea), que
corresponde al estado de transición.

2.7. CARACTERÍSTICAS DE LA ACCIÓN ENZIMÁTICA

La característica más sobresaliente de los enzimas es su elevada especificidad.

Esta es doble y explica que no se formen subproductos:
1.Especificidad de sustrato. El sustrato (S) es la molécula sobre la que el
enzima ejerce su acción catalítica.
2.Especificidad de acción. Cada reacción está catalizada por un enzima
específico.

La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que

representa el estado de transición.

El sustrato se une al enzima a través de numerosas interacciones débiles como

son: puentes de hidrógeno, electrostáticas, hidrófobas, etc, en un lugar
específico , el centro activo. Este centro es una pequeña porción del enzima,
constituído por una serie de aminoácidos que interaccionan con el sustrato.
Algunas enzimas actúan con la ayuda de estructuras no proteícas. En función
de su naturaleza se denominan:
1.Cofactor. Cuando se trata de iones o moléculas inorgánicas.
2.Coenzima. Cuando es una molécula orgánica. Aquí se puede señalar, que muchas
vitaminas funcionan como coenzimas; y realmente las deficiencias producidas por
la falta de vitaminas responde más bien a que no se puede sintetizar un
determinado enzima en el que la vitamina es el coenzima.
III. MATERIALES Y EQUIPOS

 Materiales:
 1 matraz de 500ml
 2 vasos de 250ml
 2 Matraces de 250mL
 Fiolas 100 mL.
 Termostato.
 Termómetro.
 Cronómetro.
 Pipetas de 10mL.
 Probetas de 100 mL.
 1 soporte universal
 1 baño mari
 1 termometro
 1 luna de reloj
 Ph metro
 Reactivos:
 Ácido cítrico
 Yodo
 Feing A
 Feling B
 Azul de metileno
  Procedimiento:

 Preparar 200mL de solución de almidón 5% en un matraz de 500

mL, ajuste el pH de esta solución con ácido cítrico a 5.8 – 6.0 y lleve
todo esta solución a un baño maría de 60 ºC durante una hora, pero
antes añadir 5 ml de ᾳ- Amilasa y después de 30 minutos
transcurridos agregue 5ml de amiloglucosidasa y deje que el tiempo
transcurra30 minutos más. Cada 10 minutos saque con pipeta y
haga gotear en la luna de reloj 2 a 3 gotas y añada gotas de yodo
anote el color luego a los 30 minutos que ha transcurrido saque con
la pipeta 10 ml de hidrolizado ponga en bureta añadiendo 90 de
agua y titule con feling A y B que ya se conoce, luego a los 30
minutos finales saque igual muestra con pipeta y titule con feling A
yB como ya se conoce anote los gastos.

 Proceder a titulación en caliente hasta aparición de un color rojo

cobrizo (cobre reducido). Anotar los gastos.

Diagrama:

10gr almidón 20mL.

5 ml de ᾳ- Amilasa 200mL
Agua destilada

T = 60°C
pH = 5.7

5mL (c/u) de Fheling A y B + 45mL H2O(d) + gotas indic.

IV. DATOS EXPERIMENTALES:
Después de un tiempo de 60 minutos, se obtuvieron los siguientes gastos
de azúcar reductor como dextrosa, glucosa, dextrina.

Cuadro N° 01: Datos obtenidos en la práctica.

Muestr Tiempo Gasto
a (min.) V(mL)
1 10 22.2
2 20 20
3 30 15.8
4 40 13
5 50 10
6 60 9

N (C6H12O6) k Maltosa + glucosa

α - amilasa
0 Ahora, será necesario el cálculo de Azúcar Reductor equivalente a
Dextrosa en las diferentes muestras a diferentes tiempos. Para lo cual se
emplea el método volumétrico de LANE y EYRON, utilizando un factor en
relación al gasto en la siguiente expresión:
1
A.R. mg/100 mL disolución = Factor x 100
Título (mL)
volumen diluido
F .C 
volumen de gasto

F .C
azúcar reductor  x100
vol. de gasto

azúcar reductor
azuc. reductor ( g ) 
dilución
El factor es obtenido a partir de las tablas de PEARSON usando 10 mL de
reactivo de Fehling. En la tabla (02) se presentan los valores de los factores
respectivos para cada gasto de titulación, así como los respectivos resultados
en g/100 mL de disolución de azúcar reductor.

Cuadro N° 02: Resultado de los cálculos.

 Azucar
Tiempo Azucar
Muestra Gasto (mL) F.C Reductor
(min.) Reductor (g)

1 10 22.2 9.0 40.54 0.2027

2 20 20 10 50 0.25

3 30 15.8 12.66 80.13 0.4007

4 40 13 15.38 118.31 0.5916
5 50 10 20 200 1.0

6 60 9 22.22 246.67 1.2334

volumen diluido
F .C 
volumen de gasto

F .C
azúcar reductor  x100
vol. de gasto

azúcar reductor
azuc. reductor ( g ) 
dilución
Para la muestra 1 se tiene:
200mL
F .C   9.0
22.2mL
9
Azúcar reductor  x100  40.54
22.2
40.54
Azúcar reductor ( g )   0.2027 g
200
Cuadro N° 03: Datos calculados para el gráfico.
V gasto Az. Red. (S)
n 1/V 1/S S/V
(mL) (g)
1 22.2 0.2027 0.045 4.933 0.0091
2 20 0.25 0.05 4 0.0125
3 15.8 0.4007 0.0633 2.496 0.0254
4 13 0.5916 0.0769 1.69 0.0455
5 10 1 0.1 1 0.1
6 9 1.2334 0.1111 0.811 0.137
GRAFICO 01. Linealizacion de S/V Vs Az. Red. (S) (g)
 Método Michails-Menten para obtener valores de Km y Vmax

0.16
S/V

0.14

0.12

0.1

y = 0.1239x - 0.021
0.08

0.06

0.04

0.02

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
S

Entonces se tiene:

1
 0.1239
V max
V max  8.07

Km
 0.021
V max
Km  0.021x8.07  0.1695

V. CALCULOS Y RESULTADOS:
La reacción de hidrólisis enzimática que se produce en el almidón, es la
siguiente:

N (C6H12O6) k Maltosa + glucosa + dextrosa

α - amilasa

Almidón + H2O Hidrólisis Parcial: D – Glucosa

Almidón + H2O Hidrólisis Total: Lactosa + D – Glucosa
Azúcares Reductores
Y en la titulación por acción del reactivo de Fehling, se produce lo
siguiente:
Cu2+ + 2e Cu0 (s) Color ladrillo

Figura Nº 01: solución de fehling A y B+ muestra+ azul de metileno+

45ml de agua

Figura Nº02: prueba de yodo (coloración azul marino)

Figura Nº03: titulación de la solución amiloglucosida cada 10 minutos.

1. Determinación de las Constantes Cinéticas (Km y Vmax):

Los cálculos serán realizados empleando la Ecuación Integrada de
Michaeiles, que dice:

1 Ln So = Vmax - So – Si
T Si Km T*Km

En la tabla (03), se presentan los cálculos respectivos para las

constantes Cinéticas: Km y Vmax, en base a los datos de la tabla (02) y
desarrollados en la última expresión; teniendo en cuenta que:

Si = S0 - %AR

Si = 10 - %AR

(1/T)
T (min) So Si Ln(So/Si) (So-Si)/T
10,0 16,0 15,4 0,003935 0,0617
20,0 16,0 15,3 0,002185 0,0342
30,0 16,0 15,2 0,001690 0,0264
40,0 16,0 15,0 0,001554 0,0241
50,0 16,0 14,7 0,001640 0,0252
60,0 16,0 14,0 0,002221 0,0333
 0,004500

0,004000

0,003500

0,003000

0,002500
zx mcxcn

0,002000

0,001500

0,001000

0,000500

0,000000
0,0000 0,0100 0,0200 0,0300 0,0400 0,0500 0,0600 0,0700
y = 0,0631x + 5E-05
,mbvmbvc
R2 = 0,9983

Aplicando ecuación integrada de Michailes, procedemos a elaborar

la gráfica (01): (1/T) Ln(So-Si) Vs.(So-Si)/T, a partir de los datos
presentados en la tabla (03), de donde obtenemos las constantes
cinéticas que equivalen a la pendiente (1/Km) y al punto de
prolongación (Vmax/Km):

Km = 15.85

Vmax = 7.92 * 10-4

VI. CONCLUSIONES Y DISCUSIONES:

 La α - amilasa es una enzima de la familia de las amilasas que existen en

diferentes fuentes vegetales, animales y microbianas. Ésta enzima cataliza las
reacciones de hidrólisis del almidón, para convertirlo en unidades de D-
glucosa y dextrinas. Ésta fracción se puede determinar con el reactivo de
Fehling, para determinar la respectiva acción enzimática.
 El almidón como polisacárido puede ser hidrolizado por sustancias que
rompen los enlaces -1,4-glucosídico y -1,6-glucosídico, con el objetivo de
producir moléculas más pequeñas como las dextrinas. La determinación del
grado de hidrólisis, se debe a la cantidad de azúcares reductores que se han
formado; específicamente glucosas llamadas también dextrinas y se mide
por las unidades de dextrosa equivalente.
 La Acción Enzimática de las enzimas, se produce con la unión de éstas con
una molécula de substrato, para luego formar el complejo enzima-substrato y
después del proceso se forma inmediatamente el producto quedando libre la
enzima, para unirse con el nuevo substrato.
 La coloración de muestra + azul de metileno en los vasos precipitados del
ensayo se va clarificando a la medida que el tiempo va avanzando es decir
cada 10 minutos va cambiando de color lo cual es un indicador de que hay
una reacción por efecto de la α -amilasa. mayor hidrolisis del almidón es
menor el volumen de gasto de la solución.

 La coloración de muestra con el yodo es un indicador se va clarificando a la

medida que el tiempo va avanzando es decir cada 10 minutos va cambiando
de color lo cual es un indicador de que el almidón esta degradándose.

VII. BIBLIOGRAFIA:
 CHEFTEL, J. C. 1999 “Introducción Bca. Alimentos”
Editorial Acribia España. Pag.120-129
 FIESER, Louis 1964 “Química Orgánica” Editorial Reverté
S.A. España Pag. 269-272
 JONES, Mark 1969 “Química” Editorial Interamericana S.A. México
D.F. Pag. 286-287