Seminario n° 4

(Primera Parte)

Cromatografía

Química Orgánica I
 Seminario n°4
Cromatografía

es Cromatografía posee

Conjunto de técnicas de separación

Fase fija o estacionaria Fase móvil
es es

Sólido o líquido denso soportado Líquido o gas

en un sólido
Por ej. Por ej.

Sílica gel (polar) Solventes orgánicos

Sílica C18 (no polar) (hexano, acetato de etilo,
Alúmina (ácida, básica, neutra) acetonitrilo, etc) o mezcla
Cromatografía de capa fina Papel de los mismos
(thin-layer chromatography, TLC)
1. A. Boba, A. Kulma, K. Kostyn, M. Resina (catiónica, aniónica) Nitrógeno
Starzycki, E. Starzycka, J. Szopa,
PHYSIOL MOL PLANT P, 76, 2011, 39-47.
Agarosa (polisacárido) Helio
2. http://www.ncbe.reading.ac.uk/PRACTICA
LS/PDF/TLCmethod.pdf
Vidrio Agua
Polímeros plásticos
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Cromatografía

es Cromatografía posee

Conjunto de técnicas de separación

basado en
Fase fija o estacionaria Fase móvil
Interacción de los con
componentes de una
muestra (A, B, C…) a través de a través de

Retención Desplazamiento

Adsorción Desorción
(Fuerzas (solubilización,
intermoleculares) partición)
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Cromatografía

Mecanismo general de la separación cromatográfica

1. https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Organic_Chemistry/Book%3A_Organic_Chemistry_Lab_Techniques_(Nichols)
/02%3A_Chromatography/2.02%3A_Chromatography_Generalities/2.2B%3A_General_Separation_Theory
2. Técnicas experimentales en Química Orgánica, Martínez.
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Cromatografía

Cromatografía
Cromatografía de capa fina (thin- Cromatografía gaseosa (gas
layer chromatography, TLC) chromatography, GC)

Cromatografía líquida
de alta resolución
Cromatografía en columna (column
(high-performance
chromatography, CC)
liquid
chromatography,
HPLC)
Cromatografía
líquida de alta
resolución
preparative
(prepHPLC)

CC: https://twitter.com/beth_elacqua/status/1103477693092376576/photo/1 ,HPLC: https://www.indiamart.com/proddetail/hplc-instrument-10784692297.html, prepHPLC:

https://sites.udel.edu/mslab/instruments/autopur/, GC: https://www.uwo.ca/sci/research/biotron/analytical_services/equipment_and_services/gc.html
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Cromatografía

Cromatografía de capa fina

Fase estacionaria

Sílica gel (SiO2.x H2O), el adsorbente más común

Sólido blanco con partículas finas depositado sobre una superficie plana (placa de aluminio, plástico o vidrio)
Alta superficie específica con elevada cantidad de sitios activos

Placas listas para usar Estructura de la silica

gel
http://jlindus-chem.com/Thin-layer-chromatography-silica-gel_1328.html
https://medium.com/@swambechemicals/silica-gel-mesh-important-for-effective-thin-layer-flash-chromatography-2d5a309826ea
https://www.biotage.com/product-page/tlc-plates
Polar
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Cromatografía de capa fina Cromatografía

Fase móvil

Solventes orgánicos o mezclas de los mismos (eluyentes) >>> Serie elutrópica

Menos polar Solventes más comúnmente utilizados

Hexano
DCM
Tolueno
Acetato de etilo
Metanol

Combinaciones usuales

Hexano/Acetato de etilo
Más polar
MeOH/DCM

Guía de TP
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Cromatografía de capa fina Cromatografía

Procedimiento

A B C D E F
Placa de Se Cuba/cámara La placa se El sv asciende por La placa resuelta
sílica gel. deposita cromatográfica deposita capilaridad a se retira de la
Se marca cada saturada con el dentro de la través de la placa cuba, se marca el
el punto muestra en sv elegido cámara para moviendo de frente del
de una calle o su desarrollo distinta manera solvente y se
siembra línea los componentes deja secar
diferente de las muestras
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Cromatografía de capa fina Cromatografía

Mancha menos retenida

Viajó MAYOR distancia a través de la placa
Interaccionó MENOS con la FE
=
MENOS POLAR

Mancha más retenida

Viajó MENOR distancia a través de la placa
Interaccionó MÁS con la FE
=
MÁS POLAR
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Cromatografía de capa fina Cromatografía

FM3 FM1 FM2

MENOS
MENOS POLAR
POLAR MÁS
POLAR

MENOS MÁS
POLAR POLAR
MÁS
POLAR

FM3 menos polar FM2 más polar

que FM1 que Sv1
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Cromatografía de capa fina Cromatografía

Mecanismo

Muestra sobre la FE La FM comienza a atravesar la FE La FM vence la atracción entre la

muestra y la FE
https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Organic_Chemistry/Book%3A_Organic_Chemistry_Lab_Techniques_(Nichols)/02%3A_Chromatography/2.03%3A_Thin_Layer_Chromatography_(TLC)/2.3D%3A_Separation_
Theory
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Cromatografía de capa fina Cromatografía

Cálculo de Rf
(factor de retención, ratio to the front/retention factor)

• Independiente del tamaño de

placa
• Una forma de identificar la
mancha
• Solo depende del sv. Si el sv
cambia, las distancias
también

Técnicas experimentales en Química Orgánica, Martínez.

Mohrig, J. R., et al, Laboratory techniques in organic chemistry.
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Cromatografía de capa fina Cromatografía

Reveladores

• No destructivos • Destructivos (solución+calor)

1. Luz UV 254 nm (aromáticos y sistemas conjugados) 3. H2SO4/MeOH o EtOH (compuestos orgánicos, casi
2. I2 (compuestos orgánicos, especialmente aquellos universal)
con dobles enlaces) 4. p-anisaldehído (aldehídos, cetonas, alcoholes, etc)
5. Permanganato (alquenos, alquinos, alcoholes, etc)
1

https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Organic_Chemist
ry/Book%3A_Organic_Chemistry_Lab_Techniques_(Nichol
s)/02%3A_Chromatography/2.03%3A_Thin_Layer_Chroma
tography_(TLC) 2 4 5
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Cromatografía de capa fina Cromatografía

Aplicaciones

• Criterio de pureza negativo

Puedo dilucidar si una muestra se encuentra IMPURA pero NO puedo asegurar si la misma está PURA

Si se observan 2 o más manchas, la muestra NO ESTA PURA

Si se observa 1 mancha, NO puedo asegurar que la muestra se encuentre pura
(Enantiómeros, otros isómeros, sustancias similares con varios grupos funcionales y de elevado peso
molecular)
https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Organic_Chemistry/Book%3A_Organic_Chemistry_Lab_Techniques_(Nichols)/02%3A_Chromatography/2.03%3A_Thin_Layer_Chromatography_(TLC)/2.3D%3A_Separation_Theo
ry
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Cromatografía de capa fina Cromatografía

Aplicaciones

• Seguimiento de una reacción

Desaparición de reactivo/aparición de producto

A. Reactivo
• Elección de solvente para cromatografía en
B. Patrón de producto
columna y seguimiento de la misma
C. Reacción

http://lcwu.edu.pk/ocd/cfiles/Chemistry/Maj%20/%20Chem-203/TLC.pdf
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Cromatografía

Cromatografía en columna
• Separa mg - gr de muestra
• El principio de separación es el mismo que para TLC, pero el solvente no eluye por capilaridad de abajo
hacia arriba como en el caso anterior, sino de arriba hacia abajo por gravedad o por aplicación de
presión

MENOS
POLAR MÁS
POLAR

MÁS
POLAR MENOS
POLAR
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Cromatografía

Condiciones para una separación eficiente

• Se recomienda que la diferencia entre los Rfs de las muestras a separar sea 0,2 como mínimo ΔRf = 0,2

• Al ensayar en TLC el solvente o mezcla de solventes a utilizar, se recomienda que los Rf de las muestras
a separar se encuentren entre 0,2 < Rf < 0,8

• Pueden emplearse condiciones No-isocráticas: distintos solventes en una misma columna. Primero se
emplea el sv de menor polaridad hasta eluír el compuesto menos polar y luego se agrega un solvente de
mayor polaridad para eluír el compuesto más polar. Especialmente útil cuando se tiene un compuesto muy
polar para acelerar su elución.

1° Tolueno (eluyo A)
A 2° Diclorometano (eluyo B en menor tiempo que
utilizando solo tolueno)
B
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Cromatografía en columna Cromatografía

Preparación de una columna cromatográfica

1. Elegir un tamaño de columna de vidrio adecuado 1 g____30 g de silica. De ser necesario, agregar un
tapón de algodón para que la sílica no eluya junto al solvente
2. Pesar la cantidad de sílica calculada en un vaso/Erlenmeyer y agregar el primer sv que va a utilizarse,
haciendo una “papilla” (suspensión)
3. Depositar la misma dentro de la columna
4. Arrastrar con el sv la silica depositada en las paredes y compactar la columna (golpearla suavemente)
para liberar las burbujas alojadas en la silica (medio homogéneo)

https://www.amazon.com/Chemglass-CG-1189-19-Chromatography-Stopcock-Effective/dp/B005WX1PVS
https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Organic_Chemistry/Book%3A_Organic_Chemistry_Lab_Techniques_(Nichols)/02%3A_Chromatography/2.04%3A_Column_Chromatography/2.4A%3A_Macroscale_Columns
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Cromatografía en columna Cromatografía

Preparación de una columna cromatográfica

Siembra líquida (para líquidos y sólidos solubles en la fase móvil)

5. Bajar el nivel de solvente hasta la superficie de la sílica dentro de la columna
6. Se deposita cuidadosamente la solución saturada conteniendo la muestra (muestra disuelta en 2-3 veces
el peso en el sv) en forma homogénea y cuidando de no levantar la silica en el proceso
7. Se deja eluír la fase móvil hasta que la siembra ingrese en la fase estacionaria
8. Se agrega cuidadosamente más solvente hasta llenar la columna

6 8

Columna en
desarrollo

https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Organic_Chemistry/Book%3A_Organic_Chemistry_Lab_Techniques_(Nichols)/02%3A_Chromatography/2.04%3A_Column_Chromatography/2.4A%3A_Macroscale_Columns
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Cromatografía en columna Cromatografía

Preparación de una columna cromatográfica

Siembra seca (muestras no solubles en la fase móvil)

La muestra se disuelve en un solvente en el que sea altamente
soluble. A esta solución se agrega 3-4 veces el peso de muestra
en silica o celite (Ej. para 1 g de muestra agrego 3-4 g). El
solvente de esta suspensión es evaporado completamente para
obtener un sólido que posee la muestra adsorbida en su
superficie

5. Bajar el nivel de solvente hasta la superficie de la sílica

dentro de la columna
6. Se deposita cuidadosamente el sólido con la muestra
previamente adsorbida en su superficie
7. Se agrega cuidadosamente el solvente hasta llenar la
columna
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Cromatografía en columna Cromatografía

Desarrollo y seguimiento de una columna cromatográfica

Para saber en qué fracción comienza a eluír la muestra de interés>>> Pequeña alícuota de cada fracción en
una TLC y revelado (sin necesidad de correr la TLC)

Para verificar la identidad de la muestra >>> TLC a cada fracción activa

Recoger las fracciones de

interés en un mismo balón,
evaporar el solvente y secar
al vacío

https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Organic_Chemistry/Book%3A_Organic_Chemistry_Lab_Techniques_(Nichols)/02%3A_Chromatography/2.04%3A_Column_Chromatography/2.4A%3A_Macroscale_Columns
 Seminario n°4
Cromatografía

Material de consulta

• Guía de TP (en las últimas páginas se detallan los aspectos más importantes de todas las técnicas)

• Fundamentos Teóricos Prácticos para Laboratorio – Galagovsky

• Técnicas experimentales en Síntesis Orgánica – Martinez

• chem.libretexts.org/Bookshelves/Organic_Chemistry/Book%3A_Organic_Chemistry_Lab_Techniques_(Ni
chols)/02%3A_Chromatography

¡Muchas gracias por su atención!

 Seminario n° 4
(Segunda Parte)

Cromatografía

Química Orgánica I
 Seminario n°4
Resumen Cromatografía

TLC/CCD

FM: Sv orgánico o mezclas

FE: Sílica gel (SiO2.x H2O) >>> POLAR

Especie polar >> Mayor interacción con la sílica >> Más retenida >> Menor Rf
Muestra poco polar >> Interacción poco efectiva >> Menos retenida >> Mayor Rf

𝑫𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒑𝒐𝒓 𝒆𝒍 𝒄𝒐𝒎𝒑𝒖𝒆𝒔𝒕𝒐

Rf = 𝑫𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒑𝒐𝒓 𝒆𝒍 𝒔𝒐𝒍𝒗𝒆𝒏𝒕𝒆
MENOS
Reveladores (sustancias no visibles) POLAR
No destructivos (UV, I2)
Destructivos (pAd, H2SO4/MeOH, Ninhidrina…)
MÁS
Usos POLAR
Criterio de pureza negativo (2 o mas manchas, impura)
Seguimiento de una reacción
Elección de solvente para cromatografía en columna (CC) y seguimiento de la misma
 Seminario n°4
Resumen Cromatografía

CC

• Separación a escala preparativa

• Mecanismo de separación idéntico a TLC
• FM: Sv orgánico o mezclas
• FE: silica gel (con mayor diámetro de partícula)
• Diferencia entre las muestras a separar ΔRf = 0,2
• Rf de las muestras a separar se encuentren entre 0,2 < Rf
< 0,8
• Pueden emplearse condiciones No-isocráticas: distintos MÁS
solventes en una misma columna POLAR
• 1 g____30 g de silica
• Siembra convencional (muestras solubles en FM)
• Siembra seca (muestras no solubles)
MENOS
POLAR
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Ejercicios Cromatografía

Diclorometano
(DCM) Acetona

FE: silica gel

FM: ?
Muestra = 100 mg = 0,1 g >>> 3 g de silica
Revelador UV, 254 nm
3 compuestos como mínimo (Rf1, 2 y 3) Rf1 = 0,2 bajo Rf3 = 0,85 muy alto

1° DCM hasta elución del comp con Rf3 ΔRf1-2 = Rf2-Rf1 ΔRf2-3 = Rf3-Rf2 =
2° Acetona para eluír los comp de Rf2 y Rf1 = 0,15 < 0,2 0,13 < 0,2
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Ejercicios Cromatografía

Fracción 1, rango de Pf de 8°C Mezcla

Fracción 2, rango de Pf de 1°C Sustancia pura o eutéctico
Fracción 3, rango de Pf de 1°C Sustancia pura o eutéctico

CC
No efectiva para fracción 1
Aparentemente efectiva para fracción 2 y 3

Composición de la muestra
4 especies como mínimo
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Ejercicios Cromatografía

Más polar >> Rf1 = ác p-metil benzoico

Polaridad media >> Rf2 = acetofenona
Menos polar >> Rf3 = fenil etil éter
Dipolo-dipolo Puente de H Dipolo-dipolo
O más
disponible
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Ejercicios Cromatografía

Sv que genere Rfs mayores será el más polar >> B

UV (no destructivo)
I2 (no destructivo)
H2SO4/MeOH o EtOH (destructivo)
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Ejercicios Cromatografía

1° Tolueno (2-metil benzofenona)

2° H/A si quisiera obtener también la impureza más polar (reactivo/catalizador que podría ser reutilizado)
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Cromatografía

Material de consulta

• Guía de TP (en las últimas páginas se detallan los aspectos más importantes de todas las técnicas)

• Fundamentos Teóricos Prácticos para Laboratorio – Galagovsky

• Técnicas experimentales en Síntesis Orgánica – Martinez

• chem.libretexts.org/Bookshelves/Organic_Chemistry/Book%3A_Organic_Chemistry_Lab_Techniques_(Ni
chols)/02%3A_Chromatography

¡Muchas gracias por su atención!