INDICE

1. INICIO
2. HISTORIA
3. TEORIA DE LA SEPARACION
4. COLUMNAS
5. CLASES DE COLUMNAS
6. EQUIPO
7. TEORIA DE LA SEPARACION
8. EJEMPLOS DE SEPARACION
9. DESARROLLO DE METODOS
10. VALIDACION
TEORIA

CROMATOGRAFÍA : método físico en el cual uno o más

componentes se distribuyen entre dos fases, una de
ellas sólida, la fase estacionaria.
TEORIA

A A
A A A
A
A

PARTICION LIQUIDO - LIQUIDO EN DOS FASES INMISIBLES

HISTORIA

EL INICIO DE LA CROMATOGRAFIA ESTA

MUY LIGADA CON LAS INVESTIGACIONES
BOTANICAS
HISTORIA

En 1906, Martin Tswett publico el primer artículo

sobre la Cromatografía. Tswett separo los
componentes de la Clorofila utilizando Carbonato
de Calcio como Absorbente y Eter de Petroleo
como eluyente.

En 1931, Kuhn y sus colaboradores aislaron α y β

carotenos de la zanahoria, empleando el mismo
método de Tsweet.

Columna de yeso pulverizado

HISTORIA

EN 1938 M.S.SHRAIBER DESCRIBE

POR PRIMERA VEZ LA CROMATOGRAFIA
DE PLACA FINA
HISTORIA

EN 1952 SE SIO A CONOCER LA BASE DE LA

CROMATOGRAFIA DE REPARTO GAS- LIQUIDO

HASTA 1960-1970 SE DESARROLLA LA CROMATOGRAFIA

LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA O HPLC

Pa
ge
9
TIPOS DE CROMATOGRAFIA:

HPTLC?
• TLC TLC? SFC? GC?
• HPTLC HPLC? CE?

• Cromatografía de Columna

• GC

• HPLC

• SFC

• Electroforesis Capilar
DIFERENCIAS ENTRE CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA Y GAS.

Only about 20% of known organic compounds

can be analyzed by gas chromatography.
Water
Differences
Liquid Liquid
Gas
Polarity of Mobile Phase

LC

Gas

Hexane

0 2 4 6 8
10 10 10 10 10

Solute Molecular Weight

Pa
ge
11
Ventajas de la Cromatografía Líquida – HPLC

• Solo 20% de los compuestos orgánicos

pueden ser analizados por
cromatografía de gases sin tratamiento
inicial

• Fácil de fraccionar y purificar la

muestra.

• Muy Buena Repetibilidad (Coeficiente de

Variación menor al 1 %).
TEORIA DE LA SEPARACION

1. FASE ESTACIONARIA

Es un sólido poroso, inerte con

características conocidas.
Inicialmente fue solamente silica .

2. FASE MÓVIL

Solvente de alto grado

de pureza
o una mezcla de ellos.
TEORIA DE LA SEPARACION

Fase Estacionaria

Fase Móvil
TEORIA DE LA SEPARACION
INSTRUMENTACIÓN

Inyector

Mixer

Bombas
Cromatograma

Columna
Detector

Solventes
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

t
R(B)
t R(A)

t R = tiempo de retención
to = tiempo de elusión de un compuesto no retenido
W = (peak width)
t ancho de pico
0
A B
Inject
Detector Response

W W
A B
Time

Pa
ge
17
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

`Selección de la fase estacionaria de la

columna.
`Diametro y longitud de la columna.
`Composición de la fase Móvil.
`Temperatura.
`Velocidad de Flujo.
`Tamaño de muestra.

Pa
ge
18
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

Fase normal y fase reversa

Modo Fase Estacionaria Fase Móvil

Normal Polar No polar
Reversa No polar Polar

Isocratico vs. Gradiente de elusión

Isocratico La composición de la fase

- móvil es constantes a través de la corrida

Gradiente: La composición
La composición de lade la fase
fase móvilmóvil cambia
cambia con
con el el tiempo
tiempo

Pa
ge
20
COLUMNAS
 OH
OH OH
O Si O OH
Si Si Si Si

O O O O

Silica Gel
Surface
Chemically Modified
Silica Gel
Pores
Si CH 3
Si
Si-O-Si-(CH2)17CH3
Si

CH3
Si

Si
Pa
ge
24
 FASE NORMAL

FUERON LAS PRIMERAS COLUMNAS DESARROLLADAS EN LOS PRIMEROS

INICIOS DE LA CROMATOGRAFIA.

MECANISMO
Retención por interacción de la superficie polar de la
fase estacionaria con la parte polar de la molecula. O
H
FASE ESTACIONARIA O
Si O
SiO2, Al2O3, -NH2, -CN, -Diol, -NO2 O H
FASES MOVILES O
Si O O
Heptano, hexano, cyclohexano, CHCl3, CH2Cl2, O CH
2
dioxano, metanol H
O
METODO APROPIADO PARA: Si O
O
•Compuestos de polaridad mediana a alta H

•Separación de isomeros posicionales con

sustitutentes polares
 (SiO)x
polimero
H+

Solución Gelación y Maduración Secado

separación de
inicial fases

HPLC
Encapsulado
 FASE REVERSA

Llamadas así porque se invertía la polaridad de la fase movil y la fase estacionaria.

MECANISMO
Retención por interacción de la fase movil no O CH
3 H2O
polar con partes no polares de las molecular O CH3OH
Si O Si
FASES ESTACIONARIAS
O CH
3
n-octadecyl (RP-18), n-octyl (RP-8), ethyl (RP-
2), phenyl, -NH2, -CN, -Diol, polimeros O Si O H
H2O
hidrofobicos CH OH
O CH
3 2
FASE MOVIL
O Si O Si
metanol o acetonitrilo / agua o buffer(muchas
veces con aditivos como tetrahidrofurano o O CH
3
dioxano) regla de thumb; si se incrementa un
10% el contenido de agua en la fase movil da H2O
como resultado un aumento en el doble del CH3OH
valosr de k´
METODO APROPIADO PARA:
Compuestos no ionicos, ionicos e ionizables
Pa
ge
27
Pa
ge
28
PRIMERA GENERACIÓN (1970): LiChrosorb®
-Silica irregular de 10 µm, Eficiencia en separación

SEGUNDA GENERACION (1980): LiChrospher®

- Particulas esfericas 5 µm Optimización de la selectividad

TERCERA GENERACION (1990): Purospher®

- Columnas hechas basadas en base de simetria, reproducibilidad y robustez

CUARTA GENERACIÓN (2000): Chromolith®

- Separaciones rapidas con altos flujos y minima sobrepresión
10 µ
LiChrosorb ® 1µ

10 µ
LiChrospher ® 1µ

Pa
ge
30
 LiChrosorb®
irregular

LiChrospher®
Superspher®
Purospher® spherical
Purospher®
STAR

Chromolith® monolithic
 DIRECCION DE
FLUJO

LUZ DEL DETECTOR

INYECCIÓN ANCHO DE FUENTE DE LUZ

PICO
CROMATOGRAMA

A AD C
AC C CD AA C CC
C AABC B
B B D DD
A AA B BB CC DD D
B BD ABBB A B CC D
DC

SEÑAL
DETECTOR
0
0 Tiempo de retención (min) 20
Que características presenta un Cromatograma?

Para obtener Picos bien

ƒ Un “Cromatograma” debe de definido deben de controlarse
presentar Picos de forma simétrica una serie de factores, en caso
y bien definidos. contrario ocurrirán los
ƒ Debe de presentar alturas de Pico ensanchamientos de bandas.
dentro de la escala de registro.
ƒ Debe de tener una línea base
consistente.
ƒ No debe de presentar bandas
anchas.
 Que Factores causan el ensanchamiento de
Bandas?

1. Difusión de Eddy (principal causa

ensanchamiento de Banda).
2. Distribución de Flujo (cuando el
flujo en el centro del canal es más
rápido que en el área de las
partículas).
Difusuón de Eddy Zona Post-columna Para reducir el ensanchamiento de
Zona Pre-columna
banda debido a estos dos factores,
el empaque de la columna debe de
tener un tamaño de partícula tan
cercano a la distribución de esta,
Fase Estacionaria Fase Móvil
tanto como sea posible.

Distribución de Flujo en un lecho Cromatografico

Que Factores causan el ensanchamiento de Bandas?

3 Difusión de la Muestra en la Fase Móvil.

Este factor es importante si:
ƒ El tamaño de la fase estacionaria es pequeña (< 10 µm).
ƒ La velocidad de la fase móvil es lenta.
(La velocidad de flujo de la fase móvil debe de escogerse de tal
forma que la difusión longitudinal no cause efectos adversos).
Que Factores causan el ensanchamiento de Bandas?

Difusión de la Muestra en la Fase Móvil.

Este ocurre cuando:
µ > 2Dm/dp
Donde:
µ = Velocidad Lineal
dp = Diametro de la Partícula.
Dm = Coeficiente de Difusión

Dm = 7.4 x 10-12 ψMT

η x Vs0.6
Que Factores causan el ensanchamiento de Bandas?

4 Transferencia de Masas entre la Fase Móvil (Fase Móvil

Extraña) y la Fase estacionaria
Para prevenir esto:
ƒ Deben de utilizarse partículas pequeñas (o de películas
delgadas) o superficies porosas como fase estacionaria.
ƒ Deben de utilizarse solventes de baja viscosidad.
ƒ Alta razon de análisis puede obtenerse a expensas de la
resolución y viceversa.

Estructura Porosa de una

Partícula de la fase estacionaria
Que información me da un Cromatograma?

1. Información Cualitativa: El “Tiempo de Retención”

casi siempre es constante bajo las mismas
condiciones cromatográficas. Esto nos sirve como un
parametro de identificación de sustancias.
2. Información Cuantitativa: El Area del Pico de cada
componente es proporcional a la concentración del
componente en la mezcla, y este valor es utilizado
para realizar calculos de concentración.
Que información me da un Cromatograma?

Un Cromatograma también puede utilizarse para evaluar la

eficiencia de separación y la performance de la columna.

Los Principales Parámetros de evaluación son:

ƒ Factor de Capacidad: k’.

ƒ Selectividad: α
ƒ Número de Platos Teóricos: N
ƒ Platos Teóricos Equivalentes: HETP
ƒ Resolución: Rs
Tiempo de retención

signal
t
R3
t
t R2
R1

t
0

0
time
t' t' t'
R1 R2 R3

t0 = Tiempo muerto de columna = Tiempo en el que un compuesto que no se

retiene gasta en pasar la columna
tR = Tiempo de retención
t´R = tR - t0
Capacidad y selectividad

signal
t
R3
t
t R2
R1

t
0

0
time
t' t' t'
R1 R2 R3

t´R tR - t0 Independiente del flujo o medidas de la

FACTOR DE k´ = =
CAPACIDAD t0 t0
columna K< 1 ; optimo 1 a 5
Factor de Capacidad (k’)

6 min (t1)
2 min (t0)
k' = 2

4.6 mm ID x 250 mm L. (1.2 mL/min)

12 min (t1)
4 min (t0)
k' = 2

4.6 mm ID x 250 mm L. (0.6 mL/min)

Selectividad (α)

“La Selectividad es un
t0
coeficiente que indica el
t1 grado de separación de
dos picos”.
t2
Injección

COEFICIENTE DE k´2 tR2 - t0

SELECTIVIDAD α= =
k´1 tR1 - t0

to 1 2 3 4
k´ = 0
El número de Platos Teóricos (N)

El Número de Platos Teóricos es un índice numérico que nos indica el

grado de eficiencia de la columna cromatográfica.

N = 15000

N = 2500

Columna con buena eficiencia, Columna con pobre eficiencia,

alto valor de N bajo valor de N
 NUMERO DE PLATOS TEORICOS

2
tR
El número de platos teoricos es definida por:
N = 16
Se puede cometer error al calcular el ancho del pico
W
2
tR
La forma más usual para N es: N = 5.54
Donde tR es el tiempo de retencion y W½ es el ancho de banda al
50% de alto del pico
W1/2

2
tR h‘
N = 2¶
Otra ecuación relacionada es:
Donde h‘ es la altura del pico y A es el area del pico. Esta ecuación es
usada por los sistemas de datos de HPLC para determinar los valores A
de N

Se recomiendan valores mayores a 2000

N = 4.064
El número de Platos Teóricos (N)

Si los picos son de forma Asimétrica, la ecuación que

se utiliza es:

(tR/W0.1)2
N = 41.7 T + 1.25

Donde:
W0.1 = Es el Ancho del Pico al 10% de la altura
T = Factor de Cola del Pico.
Altura Equivalente a un Plato Teórico (HETP)

Una altura Equivalente a un Plato Teórico es otro indice

númerico que nos indica el grado de eficiencia de la
columna cromatográfica.
Matematicamente se expresa como:

HETP = L / N
L = Longitud de la Columna
N = Número de Platos Teóricos

El valor de una HETP se traduce como el Plato Teórico

mas corto que puede colocarse dentro de la longitud de
columna. Esto significa que mientras mas pequeño sea
una HETP, podemos colocar mas HETP y la eficiencia de
la columna sera mayor.
 Resolución (Rs)

1:1 1:4 1:16

R = 0.8

La Resolución es un índice numérico que

nos indica el grado de separación de dos
compuestos. Esta puede expresarse
utilizando los siguientes parámetros: R = 1.0

R = 1.25
Rs= C x tr1 - tr2
W1-W2

Si se dobla la longitud de la columna

Se doblan los platos teóricos
C= constante que varía según La resolución mejora
Pero se aumenta la presión
el criterio para medir ancho de pico
C= 1,18 anchura del pico a 1/2 altura
C= 2.0 ancho pico por tangentes(USP)
 t2 - t1
Rs = 2
twb2 - t2wb1
Resolución (Rs)

Cuando dos picos se superponen, no puede hacerse la determinación

utilizando la ecuación anterior. Para ello la ecuación se ha modificado
utilizando el ancho del pico a la mitad de la altura:

t2
t1
(W1)1/2 (W2)1/2 H1/2
H

W1 W2

(t2 – t1)
Rs= 1.18
(W1)1/2 – (W2)1/2
Resolución (Rs)

Cuando dos picos se superponen, no puede hacerse la determinación

utilizando la ecuación anterior. Para ello la ecuación se ha modificado
utilizando el ancho del pico a la mitad de la altura:

V2
V1
(W1)1/2 (W2)1/2 H1/2
H

W1 W2

(V2 – V2)
Rs= 1.18
(W1)1/2 – (W2)1/2
La Resolución mínima requerida para
realizar cualquier trabajo Cromatográfico
es de 1.5
Resolución

La Resolución es una función de:

• Selectividad de la Columna
• Eficiencia de separación de la Columna.
• El Factor de capacidad.
Resolución

Incrementando N

Inicial

Inyección
Inyección

Incrementando α

Incrementando k´
Inyección

Inyección
Resolución
Y ... Como llevo a cabo estos cambios?

Inicial

Para Incrementar N
Utilizar una columna más grande o una
columna de mejor performance.

Para incrementar k´
Disminuir el contenido de un solvente
orgánico para columnas C18.

Cambiando α
Cambiar el contenido orgánico, pH u
orden del solvente orgánico o cambiar
la temperatura de la columna.
Resolución

9 Ajustar la razón de flujo a un nivel óptimo.

9 Ajustar la Temperatura de la columna (debe
de tenerse en cuenta que el incremento de
la temperatura en la columna acorta el
tiempo de vida de la misma).
Factor de asimetría, Factor de coleo