PRACTICA Nº 2

PROTEINAS I

RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Separación de proteínas por diálisis del suero.
2. Estudio de la solubilidad de la caseína a diferentes pH.
3. Reacción de la ninhidrina.

INTRODUCCION

Dada la compleja estructura proteica y por lo tanto su elevado peso molecular, las
proteínas son consideradas como macromoléculas, esto determina una serie de propiedades
que posibilitan su aislamiento y análisis.

Debido a su gran tamaño las proteínas son incapaces de atravesar membranas

semipermeables, lo que posibilita que en una solución en donde existen proteínas y otros
constituyentes de menor peso molecular (aminoácidos, monosacáridos, urea, creatinina,
sales, iones, etc.), las primeras puedan ser separadas al no poder pasar a través de los poros
de las membranas semipermeables, en tanto que los otros constituyentes, de menor peso
molecular, pasarán sin problema alguno.

Las proteínas tienen un rol muy destacado en el control del pH celular y

extracelular. Esta acción amortiguadora se explica por la presencia de grupos ionizables en
las cadenas laterales de los aminoácidos, los cuales son capaces de fijar protones y evitar
que el pH baje; o ceder protones al medio para neutralizar los oxidrilos y evitar de este
modo que el pH aumente.

La concentración de hidrogeniones en el medio en que se encuentra disuelta una

proteína, determina importantes variaciones en la carga eléctrica de la misma. En general
una proteína se carga positivamente cuando se encuentra disuelta en un medio de pH
inferior al de su punto isoeléctrico (pI), en tanto que se carga negativamente cuando el pH
del medio en que encuentra es superior al valor de su pI. El punto isoeléctrico de las
proteínas con un alto contenido en aminoácidos básicos (histidina, lisina y arginina), es
alto, como el caso del citocromo c, que tiene un valor de pI de 10,7. Cuando una proteína
tiene un alto contenido en aminoácidos dicarboxílicos (aspártico y glutámico), tendrán un
pI bajo, como el caso de la pepsina que tiene un pI cercano a 1. En general la mayor parte
de las proteínas globulares tiene un pI que varía entre 5,0 y 9,0.

Cuando la proteína está en un medio de pH que coincide con su valor de pI, no solo
es incapaz de migrar en un campo eléctrico sino que su solubilidad llega al mínimo,
incluso algunas llegan a precipitar.

EXPERIMENTO 1

SEPARACION DE PROTEINAS ( DIALISIS DEL SUERO ).

Objetivos
1. En base al carácter macromolecular de las proteínas utilizar un método para
separarlas de otros componentes de menor peso molecular.
2. Estudiar el efecto de la fuerza iónica sobre la solubilidad de las proteínas del
suero sanguíneo.
3. Constatar la acción del ácido tricloroacético (TCA) como agente precipitante de
las proteínas.

Método: ( Diálisis del suero sanguíneo utilizando como membrana semipermeable una
bolsa de celofán o colodión ).

Procedimiento:
a) Medir en el interior de una bolsa de celofán, 5 ml de suero sanguíneo y cerrar la
bolsa.
b) Colocar la bolsa de celofán en el interior de un beaker conteniendo agua destilada,
la misma que debe ser renovada cada cierto tiempo (20 minutos).
c) Al notar algo de precipitado en el interior de la bolsa, vaciar su contenido a un
tubo de centrifuga y centrifugar por 5 minutos a 2500 r.p.m.
d) Separar el sobrenadante en un tubo de ensayo y añadirle 5 ml de ácido
tricloroacético al 10%. Observar lo que sucede.
e) Trate de disolver el precipitado que quedó en el tubo de centrifuga utilizando agua
destilada, de no ser posible, añada unas gotas de NaCl al 10% y observe si se
solubiliza.
Resultados:

1. Escriba si observó precipitado en el interior de la bolsa y a que puede corresponder.

Si se observó precipitado y corresponde a la Albumina.

2. ¿Qué observó al añadir el ácido tricloroacético al 10%?

Al añadir el TCA se observó un precipitado.

4. ¿Fue posible disolver el precipitado del tubo con agua destilada?

No fue posible disolver el precipitado.

4.- ¿Qué ocurrió al añadir el NaCl al 10%?

Al añadir el NaCl al precipitado se logró solubilizar
INTERROGANTES

1. ¿Por qué es necesario renovar el agua destilada del beaker cada cierto tiempo?
Para que las moléculas pequeñas
2. ¿Cuál es el fundamento de la precipitación de las proteínas por el ácido tricloroacético?

3. ¿Con qué experimento(s) podría Ud. demostrar que las proteínas no difundieron a través
de la bolsa de celofán?

Complete la siguiente tabla:

ALBUMINA GLOBULINAS

Solubilidad en el agua
Solubilidad en soluciones salinas diluidas

EXPERIMENTO 2.

ESTUDIO DE LA SOLUBILIDAD DE LA CASEINA A DIFERENTES pH

Objetivos
1. Demostrar como varía la solubilidad de una proteína en función del pH.
2. Precisar las alteraciones que ocurren en la solubilidad de la caseína cuando se
encuentra en un medio de pH cercano al valor de su pI.
3. Determinar experimentalmente el pI de la caseína.
Método
A través de la turbidez, apreciar la solubilidad de la caseína en medios de diferentes pH.

Procedimiento.

Utilizar el simulador para el siguiente experimento

Expresión de resultados.

Anote sus resultados en la siguiente tabla.

TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Relación SAL / ACIDO
PH (teórico)
pH estimado con papel indicador
Precipitación o insolubilidad a 15’

INTERROGANTES
1. ¿Cuál es el pI de la caseína? Fundamente su respuesta.
4.6

2. ¿Se altera la estructura primaria de las proteínas, cuando se encuentran a un pH que

coincide con el valor de su pI? Fundamente su respuesta.
3. ¿Por qué precipita la caseína en su pI? Es este proceso reversible?
4. El pI de la ureasa es de 5.0 será mayor su solubilidad si se encuentra disuelta en un
tampón acetato 4.7 o si se encuentra disuelta en un tampón fosfato 7.8. Por qué?

EXPERIMENTO 3.

REACCION DE LA NINHIDRINA

Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina ( hidrato de triceto hidrindeno ), en

caliente, y rinden CO2, amonio y un aldehído de un átomo de carbono menos que el
aminoácido original. La reacción rinde una coloración azul púrpura, que resulta muy útil
para la identificación de los aminoácidos.

Objetivo:
Realizar e interpretar la reacción de color de la ninhidrina para la identificación de
aminoácidos
Método: Colorimétrico Cualitativo.

Procedimiento:

a) En un tubo de ensayo medir 2 ml de la solución del aminoácido al 2%

b) Agregar 0,5 ml de la solución de ninhidrina y colocar el tubo en baño maría
hirviente por 3 minutos. Observar

INTERROGANTES
1. Utilizando el espacio que sigue, escriba con palabras los elementos del complejo de
color que se constituye en esta reacción

2. Cite dos procedimientos para cuantificar los aminoácidos usando la reacción de la

ninhidrina
3. ¿Porque algunas muestras dan positiva (ejemplo Reacción de Millon) solo después de
ser sometidas al calor?

INTERROGANTES

1. ¿Cuántos grupos ionizables tiene el hexapeptido H-K-M-A-D-E?

2. ¿Qué carga eléctrica predominante tiene a pH 7,4?
3. ¿Cuál es su pI?
5. ¿Qué puede decir de la composición de aminoácidos de una proteína cuya acción
buffer esta en las proximidades del pH 4.0?

6. Una proteína se encuentra a una concentración de 7 g %. Si al tomar 5 ml de esta

solución, gastamos1,12 ml de NaOH 0.1 N para hacer variar su pH de 3 a 5, estime con
aproximación cuantos residuos de aspártico y glutámico que debe tener dicha proteína,
considerando que su peso molecular es de 25, 000.

___________________ Residuos