BACTERIOLOGÍA DETERMINATIVA (24981)

PRACTICA No.3.
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN GÉNERO Listeria y Corynebacterium

INTRODUCCIÓN

Reino: Bacteria, filo: Firmicutes, clase: Bacilli,

orden: Bacillales, familia: Listeriaceae, género:
Listeria

Reino: Bacteria, filo: Actinobacteria, clase:

Actinobacteria, orden: Corynebacteriales, familia:
Corynebacteriaceae, género: Corynebacterium.

Tomado de:
https://www.lecturio.com/es/concepts/corynebacterium/https://www.lecturio.com/
es/concepts/corynebacterium/

Los bacilos Gram-positivos no esporulados pueden clasificarse, según la morfología observada, en

bacilos regulares: incluyen los géneros Listeria, Erysipelothrix y Lactobacillus; y bacilos irregulares o
corineiformes que incluye el género Corynebacterium. Entre el género Listeria se encuentran las
especies: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, L. innocua, L. grayi y L. denitrificans,
de las cuales L. monocytogenes es la especie de mayor importancia clínica en humanos1,2.
Morfológicamente las bacterias pertenecientes a este género son bacilos cortos o cocobacilos Gram
positivos rectos que se pueden agrupar en cadenas cortas o formar empalizadas. Son anaerobios
facultativos, móviles a 22°C y 4°C, pero su capacidad motil disminuye significativamente a una
temperatura >35°C. Las Listeria spp. contaminan con frecuencia alimentos de origen animal (aves,
carnes y pescados), lácteos crudos (queso, leche), vegetales y se aíslan de muestras de ambiente
diversas. Esta amplia distribución en la naturaleza facilita su transmisión al hombre y otros animales,
particularmente la del patógeno L. monocytogenes1,2.

El género Corynebacterium incluye las especies: C. diphtheriae, C. pilosum, C. pseudodiphtheriticum, C.

ulcerans, C. auris, C. pseudotuberculosis, C. propinquum, C. afermentans, C. jeikeium, C. xerosis, C.
renale, C. pneumoniae, C. trachomatis, entre otras. Las bacterias pertenecientes al género
Corynebacterium son bacilos inmóviles, rectos o ligeramente curvos y delgados1,2. Algunos bacilos son
delgados en un extremo y gruesos en el otro, morfología que asemeja un mazo o bastón. Su forma
de división celular hace que se formen empalizadas en disposición de letras chinas. Los
Corynebacterium producen gránulos de polimetafosfatos o cuerpos de Babes Ernst también llamados
como gránulos metacromáticos, que pueden ser evidenciados con la tinción de Van Stoltemberg
(Albert). Los Corynebacterium se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza (suelo, agua)
y hacen parte de la flora normal de la piel de animales y el hombre, en quienes pueden causar
infecciones oportunistas. C. diphtheriae es el género de mayor importancia clínica en humanos en
quienes desarrolla difteria, una infección contagiosa1,2.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA

- Observar y describir las características macroscópicas y microscópicas de las especies de

Listeria y Corynebacterium.
- Seleccionar y realizar pruebas microbiológicas que permitan la identificación de los géneros
Listeria y Corynebacterium, y sus especies.
- Diferenciar las especies bacterianas según las características bioquímicas.

CONTENIDO DE LA PRÁCTICA

Materiales y reactivos:

- Asa recta y curva - Solución salina estéril

- Gradilla - Coloración de Gram
- Elementos de protección personal - Coloración de Albert (Van Stoltemberg)
- Láminas portaobjetos - H2O2 al 3%
- Encendedor - Reactivo A y B Nitritos
- Microscopio - Zinc
- Aceite de inmersión

- Medios de cultivo: caldo BHI, agar motilidad, agar sangre, agar chocolate, agar TSI, agar chocolate-telurito
0,4%, agar urea, caldo nitratos, agar EBM (agar bilis esculina), caldo RM, medio de gelatina, caldo de
fermentación base rojo fenol (base, glucosa, maltosa, ramnosa, arabinosa, maltosa, lactosa, manitol,
xilosa).

TRABAJO DE LABORATORIO

Día # 1:

1. Limpiar, desinfectar y preparar el área de trabajo. Poner un retaso de papel Kraft en el mesón para
trabajar en él.
2. A partir de la muestra entregada realizar frotis directo, colorear con Gram, coloración de Albert y
observar al microscopio: morfología, agrupación y presencia de gránulos metacromáticos. Describa
lo que observa y realice el reporte.
3. Sembrar en los medios agar chocolate y agar sangre utilizando el método de estrías por agotamiento.
4. Incubar los medios inoculados a 35°C por 24 horas en aerobiosis.
Coloración de Albert: Permite teñir los gránulos metacromáticos característicos de Corynebacterium spp.

Procedimiento:

1. Colocar un poco de colonia en la lamina a partir de la caja de cultivo o del caldo

2. Fijar pasando la placa una o dos veces sobre el mechero, con cuidado de no sobre calentar la muestra.
 3. Agregar Colorante de Albert cubriendo la
preparación.
4. Dejar que el colorante se incorpore durante 10
minutos.
5. (Opcional) flamear hasta iniciar observar la emisión
de vapores, posteriormente dejar enfriar durante
dos minutos. Si el colorante se seca, se debe agregar
más.
6. Lavar con agua corriente con cuidado de no
impactar el chorro de agua directamente sobre la
preparación.
7. Agregar Lugol para Albert.
8. Dejar actuar por 5 minutos.
9. Lavar con agua corriente con cuidado de no
impactar el chorro de agua directamente sobre la preparación.
10. Dejar secar al aire.

Resultados: Si la preparación se hizo empleando cepas del Corynebacterium sp. Teñido con Albert.
género Corynebacterium, podrá observarse en los extremos Obtenido de: https://www.diapath.com/product/albert-s-
stain-010317-2637
de los bacilos las formaciones de gránulos metacromáticos
teñidas de azul oscuro, en contraste con el verde claro del citoplasma celular.

1. Luego de 24 horas de incubación, analizar e interpretar el crecimiento microbiano observado:

describir las características macroscópicas, microscópicas y cambios bioquímicos en el medio.
2. Realice coloración de Gram para observar morfología y agrupación de los bacilos, así como
coloración de Albert.
3. Realice las pruebas de identificación de especies de Listeria y Corynebacterium.

Pruebas de identificación de Listeria y Corynebacterium:

A. Catalasa: Listeria y Corynebacterium producen catalasa por ende las especies de estos géneros son
catalasa-positiva (H2O2 al 3%).

B. Motilidad a 22 °C
Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada y sembrar por punción centrada con un asa recta a una profundidad de 1
cm de un agar de motilidad en tubo.
 2. Incubar de 18-24 horas a 22°C.

Resultados:
Positivo: motilidad en forma de sombrilla, típico de Listeria (Figura 1).
Negativo: solo crecimiento en la siembra

C. CAMP: al igual que los Streptococcus del grupo B, algunas especies

de Listeria como L. monocytogenes y L. seeligeri presentan una
prueba de CAMP positiva4.

Procedimiento:
1. Tomar con un asa de argolla una colonia de S. aureus subsp. aureus
productor de β-lisina y sembrar una estría horizontal en la mitad de
Prueba de motilidad a 22°C
un agar sangre. positiva3
2. Tomar una colonia del aislamiento a evaluar y sembrarlo en una
estría recta perpendicular a la siembra de S. aureus, sin unir las dos estrías.
3. Usar control positivo (cepa de S. agalactiae productora de factor CAMP) y negativo (cepa no
productora de factor CAMP).
4. Incubar a 35°C de 18 a 24 horas.

D. TSI (triple sugar iron - triple azúcar hierro): es un medio de cultivo diferencial en tubo que
permite evaluar si un microorganismo fermenta determinados carbohidratos, así como si produce
o no H2S. Los carbohidratos que pueden ser fermentados en este medio son glucosa (fondo del
tubo), sacarosa (parte media) y lactosa (parte superior). El cambio de color de rojo a amarillo
(indicador rojo fenol) indica fermentación de alguno de los carbohidratos ya sea en el fondo o la
parte superior4.
Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada y sembrar el medio TSI por punción centrada con un asa recta hasta tocar
el fondo del tubo y por estría en el pico de flauta (tendido).
2. Incubar 24 horas a 35°C.
3. Analizar los resultados.

Resultados:
Se debe leer el tubo siempre superficie/fondo. El cambio de color
o reacción positiva se indica con la letra A (ácido). Reacción
negativa o no cambio de color se indica con la letra K (alcalino).

A/A: pico de flauta amarillo o ácido y fondo amarillo o ácido.

Fermentación de los tres azucares.
K/K: pico de flauta rojo o alcalino y fondo rojo o alcalino. No hay
fermentación de azucares, usa las peptonas.
K/A: pico de flauta rojo o alcalino y fondo amarillo o ácido.
Fermentación de glucosa. Lactosa o sacarosa no fermentada.
K/A y producción de H2S: pico de flauta rojo o alcalino y fondo
ácido negro: fermentación de glucosa, no fermentación de latosa
y producción de H2S.
Prueba TSI. De izquierda a derecha: Control negativo. A/A
Producción de gas: formación de burbujas o desplazamiento del con producción de H2S. K/A. A/A.
medio Obtenido de: https://www.condalab.com/int/en/dehydrated-
Producción de H2S: ennegrecimiento del medio. culture-media/50-14937-triple-sugar-iron-agar-tsi.html
 E. Ureasa: en esta prueba se determina la presencia de la enzima ureasa4.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia e inocular con estría única en el pico de flauta de un agar urea de Christensen
(peptona, glucosa, rojo de fenol, urea al 40%).
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas.
3. Analizar los resultados.
Resultados:
Positivos: crecimiento bacteriano y cambio de color en el medio a rosa-rojo o rojo-violeta intenso en el pico
de flauta a causa de la alcalinidad.
-La extensión del color hacia la profundidad del medio indica la velocidad de hidrólisis de la urea y puede
llegar hasta el interior del agar.
Negativo: crecimiento bacteriano, sin cambio de color (amarillo-naranja).

F. Reducción del telurito: La presencia de telurito de potasio en el medio permite la diferenciación

de microorganismos capaces de reducir el telurito de potasio en teluro. El teluro producido colorea
las colonias de negro.

Procedimiento:
Para esta prueba se utiliza un agar chocolate suplementado con telurito de potasio al 0,4% en tubo.
1. Tomar una colonia con el asa y sembrar con estría única en el pico de flauta del agar.
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas.

Resultados:
Positivo: colonias negras (Listeria).
Negativo: ausencia de colonias o colonias blancas.

G. Caldo nitratos: en esta prueba se determina la capacidad de un microorganismo de reducir los

nitratos a nitritos o gas nitrógeno libre por la presencia de la enzima nitrato reductasa. La reducción
del nitrato se manifiesta por la presencia de un producto final catabólico o la ausencia de nitrato
en el medio4.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada e inocular en caldo nitratos.
2. Incubar a 35°C por 24 horas en aerobiosis.
3. Luego de observar crecimiento, revelar adicionando 6 gotas del reactivo de nitratos A (α-
naftilamina 0,5%) y 6 gotas de reactivo B (ácido sulfanílico 0,8%).
4. Agitar con suavidad para mezclar los reactivos. Los resultados se observan de 1 a dos minutos.

Resultados:
Positivo: se genera un color rosa a rojo oscuro en 1-2 minutos indicando que el nitrato fue reducido a nitrito.
Negativo: no hay cambio de color, el nitrito no está presente.

Nota: en el caso de tener un resultado negativo se debe continuar con el siguiente procedimiento:

1. Adicionar al tubo con reacción negativa que tiene los reactivos A y B, una pizca de polvo de zinc (Zn,
aproximadamente 20 mg).
2. Esperar por 5-10 minutos y leer la prueba.
Positivo: ausencia de color, confirma reducción de nitrato a nitrito, este último fue reducido a productos no
gaseosos, desnitrificación (N2).
Negativo: aparición de color rosa a rojo oscuro en 5-10 minutos. Confirma el resultado negativo obtenido
en con la adición de los reactivos A y B ya que se detecta la presencia de Nitrato en el medio. El color rojo
es producido por la reducción de nitratos presentes en el medio por la adición del Zn.

H. Hidrolisis de la esculina (prueba de bilis esculina): se basa en la capacidad de algunas especies

bacterianas para hidrolizar esculina en presencia de bilis (1% al 4%), produciendo glucosa y
esculetina. La esculetina reaccionan con las sales de hierro presentes en el medio para formar un
complejo fenólico de color café/negro4.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada del microorganismo a evaluar con asa recta.
2. Sembrar en medio agar bilis esculina (EBM) por estría en el pico de flauta del medio.
3. Incubar a 35°C de 24 – 48 horas.

Resultado:
Positivo: se observa ennegrecimiento difuso en el pico del agar (tubo) o un halo marrón o negro alrededor
de la colonia en la prueba realizada en caja.
Negativo: no hay cambio de color.

I. Prueba de rojo metilo: Determinar la capacidad de los microorganismos para generar y

mantener estables, a partir de la fermentación de la glucosa, productos finales ácido: ácido acético,
ácido fórmico, ácido láctico4.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada e inocular el caldo rojo de metilo.
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas en aerobiosis.
3. Luego de observar el crecimiento, revelar adicionando 10 gotas de indicador rojo metilo y
mezclar suavemente.

Resultados:
Positivo: color rojo en el medio.
Negativo: color amarillo en el medio.

J. Prueba de Voges/Proskauer: Determinar la capacidad de los microorganismos de fermentar la

glucosa con producción de ácido por vía ácido-mixta o con generación de productos neutros
(acetoína) por vía butanodiólica.

Procedimiento:
4. Tomar una colonia aislada e inocular el caldo rojo de metilo.
5. Incubar a 35°C por 18-24 horas en aerobiosis.
6. Luego de observar el crecimiento, revelar adicionando 12 gotas de α-naftol al 5% y 4 de KOH
al 40% y mezclar suavemente.

K. Crecimiento a 4°C: Evaluar la capacidad de un microorganismo de crecer a bajas temperaturas.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada del microorganismo a evaluar con asa recta.
2. Sembrar en agar sangre por agotamiento.
 3. Incubar a 4°C de 24 – 48 horas.
Resultados:
Positivo: presencia de colonias. Si no se observan colonias verificar su presencia tomando una muestra de la
superficie del medio para tinción de Gram, en el cual se deben observar bacilos Gram positivos.
Negativo: ausencia de colonias en el medio. Tampoco se observan microorganismos al realizar tinción de
Gram
L. Caldo de fermentación para carbohidratos (base rojo fenol): Mide la capacidad de la bacteria
evaluada para utilizar hidratos de carbonos (glucosa, maltosa, ramnosa, arabinosa, maltosa, lactosa,
manitol, xilosa).

Procedimiento:
1. Tomar una colonia a partir de un cultivo puro e inocular el caldo de fermentación. Mezclar
suavemente.
2. Incubar a 35°C por 18 – 24 horas.

Resultados:
Positivo: fermentación de la azúcar evidenciada por el cambio de color de rojo a amarillo.
Negativo: no fermentación del azúcar, sin cambio en el color.

M. Agar PALCAM: Agar selectivo para la detección de L. monocytogenes y otras especies del género
Listeria. La identificación de especies se basa en la hidrólisis de esculina y fermentación del manitol.
Listeria sp. Puede hidrolizar esculina, evidenciado en la formación de complejos férricos de
esculetina con coloración marrón a negra. Algunas especies de estafilococos o enterococos que
hidrolizan esculina pueden crecer en el medio, y son diferenciadas por su capacidad de fermentar
manitol, en contraposición al género Listeria.

Resultados: Se observan colonias características pertenecientes al género Listeria con una coloración
verde a gris, rodeadas de halos marrón oscuro a negros.

N. Agar cromogénico: Agar selectivo que permite la

identificación de L. monocytogenes y otras especies
del género Listeria. El sustrato perteneciente en el
medio reacciona con la enzima β-glucosidasa
perteneciente Listeria spp, virando sus colonias a
azul. La especie L. monocytogenes es identificada
debido a la formación de un halo blanco alrededor
de las colonias ocasionado por la acción sobre el
sustrato Lipasa C.

O. Determinación de la susceptibilidad a
antibióticos: permite la determinación del perfil de
susceptibilidad de un microorganismo identificado.
L. monocytogenes en agar cromogénico.
Obtenido de:
Para L. monocytogenes los agentes antimicrobianos considerados https://www.fishersci.es/shop/products/oxoid-
para evaluación primaria según el consenso publicado por CLSI* brilliance-listeria-agar-base/10770714
son: penicilina o ampicilina y trimetropin-sulfametoxazole (ver
Tabla 1)5. La evaluación de estos antibióticos se debe realizar por el método de determinación de sensibilidad
antimicrobiana por dilución.
Para Corynebacterium spp. incluido C. diphtheriae los agentes antimicrobianos considerados para evaluación
primaria según el consenso publicado por CLSI* son: penicilina, vancomicina, gentamicina y eritromicina (ver
Tabla 2). Se evalúan por el método de determinación de sensibilidad antimicrobiana por dilución5.

*
CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute.
Tabla 1. Listeria monocytogenes - Información y criterios de interpretación para el método de determinación de sensibilidad antimicrobiana por dilución†5.

Nota:
MIC: Concentración mínima inhibitoria
Para trimethoprim-sulfamethoxazole los valores indicados corresponden a la MIC de trimetropin/sulfametoxazole (ejemplo: 0.5/9.5)

†
Tabla tomada del CLSI M45-A24
Tabla 2. Corynebacterium spp. (incluido C. diphtheriae) - Información y criterios de interpretación para el método de determinación de sensibilidad
antimicrobiana por dilución‡5.

‡
Tabla tomada del CLSI M45-A24
Investigue y complete las tablas 3, 4 y 5 como apoyo para los laboratorios de montaje y lectura de pruebas de identificación: Listria y
Corynebacterium. El desarrollo de esta actividad puede ser evaluada como quiz.

Tabla 3. Pruebas de identificación para especies género Listeria.

Hidrólisis Fermentación de azucares

Reducción Motilidad
Especie Hemólisis Catalasa de CAMP
NO3 a 22°C Glucosa Ramnosa Manitol Maltosa Xilosa
Hipurato

L. monocytogenes

L. ivanovii sub
londoniensis

L. innocua

L. grayi

L. seeligeri

L. welshimeri
Tabla 4. Pruebas que permiten diferenciar bacilos Gram positivos no esporulados regulares: Listeria, Erysipelothrix y Lactobacillus.

Crecimiento a Producció Ácido a partir de

Especie Relación O2 Catalasa Motilidad
35°C n H2S Glucosa

Listeria Facultativo

Erysipelothrix Facultativo

Lactobacillus Facultativo

Tabla 5. Pruebas de identificación para especies género Listeria

 Requerimiento
Especie Hemólisis Reducción NO3 Fosfatasa alcalina Esculina Urea Hidrólisis CAMP
lípidos
gelatina

C. diphtheriae var
gravis

C. diphtheriae var mitis

C. diphtheriae var
intermedius

C. diphtheriae var
belfanti

C. accolens

C. jeikeium

C. minutissimum

C. ulcerans

C. pseudotuberculosis
Continuación tabla 5.

Fermentación de azucares
Especie
Gránulos metacromáticos Glucosa Xilosa Manitol Lactosa Sacarosa Maltosa Salicina

C. diphtheriae var gravis

C. diphtheriae var mitis

C. diphtheriae var intermedius

C. diphtheriae var belfanti

C. accolens

C. jeikeium

C. minutissimum

C. ulcerans
BIBLIOGRAFA

1. Brooks, G. F.; Butel, J. S.; Carroll, K. C.; Morse, S. A.; Mietzner, T. A. (2014) Microbiología médica.
McGraw-Hill. Edición 26, capítulo 12.
2. Ryan, K., Ray, C. y Sherris, J. (2017). Microbiología médica Sherris. Nueva York: McGraw Hill
Medical. Edición 6, capítulo 26.
3. Benadof, Dona. (2008). Listeria monocytogenes. Revista chilena de infectología, 25(5), 350.
https://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182008000500005.
4. MacFaddin J.F. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica.
3era Edición. Médica Panamericana. Capítulo 2, 4, 18, 27, 30, 39.
5. CLSI, (2016). M45: Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently
isolated or fastidious bacteria; approved guideline.