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Revista de biotecnología 145 (2010) 273–280

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Revista de biotecnología
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La vacuna oral a base de algas termoestable protege a los ratones de Staphylococcus aureus
infección

Imke AJ Dreesen a, Ghislaine Charpin-El Hamri B, Martín Fussenegger a,∗

a Departamento de Ciencia e Ingeniería de Biosistemas, ETH Zurich, Mattenstrasse 26, CH-4058 Basilea, Suiza
B Université de Lyon, 43 Boulevard du 11 Novembre 1918, F-69622 Villeurbanne, Francia

información del artículo abstracto

Historia del artículo: Si bien 15 millones de muertes por año son causadas por patógenos transmisibles en todo el mundo, las autoridades
Recibido el 16 de septiembre de 2009 sanitarias enfatizan el impacto considerable de la pobreza en la incidencia de enfermedades infecciosas. La aparición de
Recibido en forma revisada el 25 de
tejidos vegetales que expresan antígenos (por ejemplo, arroz, tomate, papa) ha indicado el potencial de las plantas terrestres
noviembre de 2009
para vacunas de bajo costo en los programas de inmunización oral. En este estudio, diseñamos los cloroplastos del alga verde
Aceptado el 1 de diciembre de 2009
unicelular.Chlamydomonas reinhardtii para la expresión estable del dominio de unión a fibronectina D2 de Staphylococcus
aureus fusionada con la subunidad B de la toxina del cólera (CTB), bajo el control de rbcLUTR. Análisis de sueros y heces de
ratones, alimentados durante 5 semanas con algas transgénicas cultivadas en Wave Bioreactor confinadoTM, reveló la
Palabras clave:
inducción de respuestas inmunitarias sistémicas y mucosas específicas. La vacunación a base de algas redujo
Chlamydomonas reinhardtii
Subunidad B de la toxina del cólera significativamente la carga de patógenos en el bazo y el intestino de los ratones tratados y protegió al 80% de ellos contra
Farmacéutica molecular dosis letales deS. aureus. Es importante destacar que la vacuna de algas se mantuvo estable durante más de 1,5 años a
Inmunización oral temperatura ambiente. Estos resultados indican queC. reinhardtii puede desempeñar un papel importante en la farmacología
Staphylococcus aureus molecular, ya que combina las características beneficiosas de las vacunas de plantas terrestres, al tiempo que ofrece una
Desarrollo de vacunas facilidad de crecimiento incomparable en comparación con otros miembros del reino vegetal.
© 2010 Elsevier BV Todos los derechos reservados.

1. Introducción formulaciones sin agujas para eliminar el riesgo de contaminaciones

Aunque las vacunas actuales son confiables para prevenir la mayoría de
las enfermedades infecciosas, una quinta parte de todas las muertes en el
mundo son causadas por patógenos transmisibles. Esto se explica
principalmente por la alta correlación entre la incidencia de enfermedades y
los niveles de desarrollo local. Hoy en día, las enfermedades infecciosas
representan aproximadamente el 50% de las muertes en los países de bajos
ingresos y el 1% de todas las muertes en los países desarrollados (http://
www.who.int/topics/enfermedades infecciosas). Este desequilibrio es una
prueba de la brecha cada vez mayor entre los recursos de las autoridades
nacionales e internacionales, responsables de promover los programas
mundiales de inmunización, y los costos reales de las campañas de
vacunación a gran escala. Por lo tanto, la Organización Mundial de la Salud,
los Institutos Nacionales de Salud, la UNESCO y varias otras agencias han
enfatizado la necesidad de una nueva generación de vacunas de bajo costo
para promover programas de vacunación en las regiones más pobres del
mundo (Arntzen y col., 2005; Jodar et al., 2001). Destacaron especialmente la
necesidad de (i) vacunas termoestables para evitar el gasto considerable de
mantener la cadena de frío durante la producción y distribución y (ii)
∗ Autor para correspondencia en: ETH Institute of Chemical and Bio-Engineering, ETH
Hoenggerberg, HCI F115, Wolfgang-Pauli-Strasse 10, 8093 Zurich, Suiza. Tel .: +41 61 387
31 69; fax: +41 61 387 39 88.
Dirección de correo electrónico: fussenegger@bsse.ethz.ch (M. Fussenegger).
oportunistas, así como la necesidad de personal calificado (Giudice y
Campbell, 2006; Jodar et al., 2001).
Durante los últimos 15 años, la farmacia molecular ha revelado avances
interesantes en la investigación de vacunas. A través de la ingeniería molecular de
células vegetales, la biotecnología vegetal se ha convertido en una alternativa
rentable a las fábricas de células microbianas y animales para la producción de
proteínas clínicamente útiles (Gitzinger y col., 2009; Hellwig y col., 2004; Ma et al.,
2003). Además de la investigación en profundidad, destinada a aumentar las tasas
de expresión que ya son altas, las plantas pueden sufrir modificaciones
postraduccionales cruciales (Gomord y Faye, 2004; Shimoda y col., 2007). La
producción industrial de proteínas complejas, como las inmunoglobulinas
funcionales (cuerpos vegetales), es relativamente económica (Ma y col., 1995;
Mayfield y col., 2003). Hace años, la administración oral de tejidos vegetales que
contienen antígenos demostró ser eficaz para provocar respuestas inmunitarias
específicas.en vivo (Haq y col., 1995; Nochi y col., 2007). Además de reducir los
costos y aumentar la facilidad de administración de vacunas sin agujas, no es
necesario que los antígenos de las plantas se sometan a una costosa purificación y
procesamiento posterior. La pared celular rígida de la planta protege al antígeno
de la rápida degradación en el ambiente ácido del estómago. Como resultado, los
tejidos vegetales son portadores efectivos de antígenos (Streatfield, 2005). Esta es
una gran ventaja porque la bioproducción de productos farmacéuticos en plantas
reduce considerablemente el riesgo de contaminación con patógenos de
mamíferos, endotoxinas intrínsecas o subproductos tóxicos. Esto significa que las
buenas prácticas de fabricación aprobadas (GMP)

0168-1656 / $ - ver el documento preliminar © 2010 Elsevier BV Todos los derechos

reservados.doi:10.1016 / j.jbiotec.2009.12.006
274 IAJ Dreesen y col. / Revista de Biotecnología145 (2010) 273–280
se puede implementar en todo el proceso de producción (Doran, 2000).
Además, a diferencia de las actuales vacunas inyectadas con jeringa, la
administración oral de tejidos vegetales provoca respuestas inmunitarias
sistémicas y mucosas (Brennan y col., 1999; Czerkinsky y col., 1999). Debido
al hecho de que la mucosa representa la vía de entrada más importante para
las bacterias y virus patógenos humanos, los efectores inmunitarios de la
mucosa son cruciales en la primera línea de defensa. La inducción de esta
inmunidad específica de dos niveles se ha convertido, por tanto, en una
estrategia ideal en la lucha contra las enfermedades infecciosas emergentes
y reemergentes (Neutra y Kozlowski, 2006).
El alga fotosintética unicelular Chlamydomonas reinhardtii,miembro del reino
vegetal, combina las características beneficiosas de los sistemas vegetales
terrestres clásicos y se cultiva fácilmente en biorreactores controlados y
confinados (Franklin y Mayfield, 2005; Walker y col., 2005). En comparación con las
plantas terrestres,C. reinhardtii crece a un ritmo mucho más rápido, duplicando su
número de células en aproximadamente 8 h en un régimen de 12 h de luz / 12 h
de oscuridad. A través de la ingeniería molecular de los cloroplastos, se acumulan
cantidades relativamente altas de proteínas recombinantes en el orgánulo
protector cerrado que puede representar aproximadamente el 60% del volumen
celular (Franklin y Mayfield, 2005). Siempre queC. reinhardtii generalmente se
considera seguro (GRAS), este organismo es el candidato ideal para una nueva
formulación de vacuna oral. Además, el antígeno se puede concentrar y estabilizar
para su almacenamiento a largo plazo mediante liofilización y es sencillo envasar
el polvo de algas secadas libremente que cumple con las GMP en cápsulas de
gelatina estándar que abordan cuestiones como la dosificación y el sabor (Arntzen
y col., 2005). Para proporcionar una prueba de concepto, diseñamosC. reinhardtii
cloroplastos para la producción estable de Staphylococcus aureusdominio de
unión a fibronectina D2, fusionado con el adyuvante mucoso de la subunidad B de
la toxina del cólera (CTB) (Rappuoli y col., 1999). La producción a gran escala de
biomasa de algas se realizó en un biorreactor de olas.TM, y los ratones fueron
sometidos a un programa de inmunización oral de 5 semanas con algas
liofilizadas. La proteccion deS. aureus La infección, conferida por las algas, se
determinó cuantificando las respuestas inmunitarias específicas de la mucosa (IgA
fecal) y sistémica (IgG en suero) y por en vivo evaluación de la diseminación
bacteriana en órganos clave como el intestino y el bazo después de una infección
subletal. La tasa de supervivencia de los ratones alimentados con algas
transgénicas también se controló después de la exposición a dosis letales deS.
aureus.
2. Materiales y métodos
2.1. Diseño de vector de expresión
Los vectores de expresión p463 (5′rbcL-aadA-3′rbcL; rbcL,región no
traducida [UTR] derivada de la subunidad grande de ribulosa-1,5-
bisfosfatcarboxilasa; aadA, espectinomicina adenililtransferasa) y p464
(5′atpA-aadA-3′rbcL; atpA,UTR derivada de la ATP sintasa -), que confiere
resistencia constitutiva a la espectinomicina (aadA) en C. reinhardtii,
fueron obtenidos de la Chlamydomonas Stock Center (Universidad de
Duke, Durham, NC, EE. UU.). pID25 (5′rbcL-aadA-3′rbcL—5′rbcL-CTB-D2-
3′rbcL),expresando constitutivamente aadA y CTB-D2 (subunidad de la
toxina B del cólera [CTB] fusionada a la S. aureus-epítopo específico
D2), que había sido optimizado por codones para la máxima expresión
en C. reinhardtii cloroplastos (Geneart, Regensburg, Alemania), se
construyó siguiendo un procedimiento de dos pasos: (i) CTB-D2 se
escindió de pID32 (Geneart) usando NcoI / PstI y se clonó en los sitios
correspondientes (NcoI / PstI) de p463 para dar como resultado en
pID22 (5′rbcL – CTB-D2–3′rbcL). (ii) 5′rbcL – CTB-D2–3′rbcL se amplificó
por PCR a partir de pID22 utilizando oligonucleótidos OID25 (directo, 5′
-gtgatccgcggccgcatgggtttataggtattttgagacc-3′) y OID26 (reverso, 5′
-gtgatccgagctcgtatgttactatttcttttattacttataaaatataatac-3′), restringido
con NotI / SacI e insertado en los sitios correspondientes (NotI / SacI)
de p463. pID26, que es isogénico para pID25
pero alberga 5′atpA en lugar de 5′rbcL delante de CTB-D2, se construyó
(i) escindiendo CTB-D2 de pID32 usando NcoI / PstI y clonándolo en los
sitios correspondientes (NcoI / PstI) de p464, reemplazando así el aadA
gen flanqueado por el 5′ atpA y 3′ rbcLUTR y resultando en pID24 (5′
atpA-CTB-D2-3′rbcL). (ii) El casete de expresión resultante 5′atpA-CTB-
D2-3′rbcL fue escindido de pID24 por ClaI / SpeI, despuntado e
insertado en el sentido de las agujas del reloj en p463 digerido y
despuntado con NotI para dar como resultado pID26 (5′rbcLaadA-3′rbcL
—5′atpA-CTB-D2-3′rbcL). Para la construcción de pID31 (PT7-D2-Su6; PAG
T7, promotor del fago T7; Su6, etiqueta de hexahistidina), el S. aureus El
epítopo D2 se amplificó por PCR a partir de pID32 usando
OID50 (adelante; 5′-cggaattcccaccatgcatatgggtcaaaataatggtaaccag-3′) y
OID51 (reverso; 5′-gctctaggatccaagcttttaatgg-
tgatggtgatgatgtgaggaagaatcaatatcaataatgttaccac-3′), restringido con
HindIII / NdeI e insertado en los sitios correspondientes (HindIII / NdeI)
de pWW312 (Weber y col., 2005).
2.2. Cepas de C. reinhardtii
El tipo salvaje C. reinhardtii cepa CC-125 (mt +) se obtuvo de la
Chlamydomonas Stock Center (Universidad de Duke, Durham, NC, EE.
UU.). losC. reinhardtii El clon CR-463/4 se generó mediante la
transformación estable de CC-125 (ver más abajo) con p463 (5′rbcL-
aadA-3′rbcL)seguido de selección clonal usando espectinomicina 100
µg / ml. El estable que expresa CTB-D2C. reinhardtii las cepas CR-25 /
1-6 y CR-26 / 1-6 se generaron transformando establemente CC-125 con
pID25 o pID26, respectivamente, seguido de selección clonal usando
espectinomicina 100 µg / ml.
2.3. Transformación estable de C. reinhardtii
Las algas se cultivaron a los 25 ◦C en matraces Erlenmeyer de 500 ml que
contienen 100 ml de medio Tris-acetato-fosfato (TAP; Harris, 1989) mientras
se agita a 100 rpm en una incubadora de planta de agitación orbital (ISF-1-W;
Kuehner Shaker, Birsfelden, Suiza) establecido en 12 h ciclos de luz (4000
lux) / 12 h de oscuridad. Las algas se recolectaron de 50 ml de un cultivo de
fase logarítmica media (8× 106 células / ml) y se recolectan por centrifugación
a 4000 × gramo durante 5 min a temperatura ambiente. El sedimento de
algas se resuspendió en 4 ml de medio TAP y se vertió en una placa de agar
TAP (30 ml de medio TAP, agar al 4% (p / v)) para su posterior
transformación. La transformación se llevó a cabo utilizando un dispositivo
de bombardeo de partículas PDS-1000 / He (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.;
Kindle et al., 1991) y las algas transgénicas se seleccionaron en placas de
agar TAP que contenían espectinomicina 100 g / ml (Sigma, St. Louis, MO,
EE.UU., nº de cat. S4014). HomoplásmicoC. reinhardtii Las líneas se
generaron sembrando secuencialmente los clones diez veces en placas de
agar TAP selectivas para espectinomicina.
2.4. Cultivo a pequeña y gran escala de C. reinhardtii
Para el cultivo a pequeña escala de hasta 1 l, las algas se cultivaron en
matraces Erlenmeyer que contenían medio TAP incubados a 25ºC. ◦C y 100
rpm en una incubadora de planta de agitación orbital ajustada a ciclos de 12
h (4000 lux) / 12 h luz / oscuridad. Para la producción a gran escala de
biomasa de algas,C. reinhardtii se cultivó hasta la fase de registro temprano
(3 × 106 células / ml) y 1 l de cultivo se transfirió a una Cellbag de 20 lTM que
contiene 13 l de medio TAP suplementado con 100 mg / l de espectinomicina
e incubado durante 7 días en un Wave BioreactorTM ajustado a los siguientes
ajustes: 25 ◦C (el enfriamiento fue proporcionado por un sistema Multitemp
II [Pharmacia, Uppsala, Suecia] establecido en 6 ◦C y se coloca debajo de la
CellbagTM), velocidad de oscilación 30 min−1, ángulo de oscilación de 6
grados y una tasa de aireación de 450 ml / min.
Las algas se recolectaron por centrifugación (3000 × gramo, 4 ◦C, 15
min), resuspendido en 10 ml de medio TAP que contiene metanol al 3%,
congelado a -80 ◦C en un baño de isopropanol y se liofilizó durante la
noche en un Lyovac GT3 (Leybold-Heraeus, Orsay, Francia).
 IAJ Dreesen y col. / Revista de Biotecnología145 (2010) 273–280
2.5. Preparación de extractos de algas
Para in vitro análisis, el polvo de alga liofilizada se resuspendió en
PBS esterilizado y filtrado (solución salina tamponada con fosfato;
Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU., nº de cat. 21600-069) a una
concentración de 20 mg / ml y se rompió con una prensa francesa
( Polytec, Waldbronn, Alemania). El lisado resultante se centrifugó a
13.000× gramo durante 5 min para eliminar los restos celulares y el
sobrenadante se almacenó a -20 ◦C.
2.6. Cuantificación de la expresión de CTB-D2
Expresión estable de CTB-D2 por transgénicos C. reinhardtii se cuantificó
mediante análisis de transferencia Western. En resumen, las algas se
contaron con un hemacitómetro y se ajustaron a 107 células / ml en PBS. Las
muestras (100 l) se hirvieron durante 10 min en tampón de carga de SDS
(SDS al 10%, Tris 1 M pH 6,8, glicerol al 37,5%, azul de bromofenol al 0,025%,
beta-mercaptoetanol al 12,5%), se centrifugaron durante 5 min a 13.000×
gramo, y el lisado de proteína se resolvió en un gel de poliacrilamida SDS al
16%. Las proteínas se sometieron a electrotransferencia (celda de
transferencia semiseca Trans-blot SD; Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) En una
membrana de fluoruro de polivinilideno (Immobilon-P, Millipore, Billerica,
MA, EE. UU., Nº de cat. IPVH00010), y CTB-D2 se visualizó usando un
anticuerpo policlonal de conejo específico de CTB (Abcam, Cambridge, Reino
Unido, nº de cat. 34992-500, nº de lote 399017), un anticuerpo secundario
anticonejo acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP) (AbD Serotec,
Oxford, Reino Unido, n.o de catálogo STAR54, n.o de lote 010607) y reactivos
de transferencia Western ECL Plus (AmershamTM, GE Healthcare,
Buckinghamshire, Reino Unido, cat. no. RPN2132). Las bandas específicas de
CTB-D2 resultantes se registraron en un generador de imágenes ChemiLux
(Intas Science Imaging Instruments GmbH, Göttingen, Alemania) y se
cuantificaron mediante densitometría (software Gel-Pro Analyzer, versión
4.5; Media Cybernetics Inc., Silver Spring, MD, EE. UU.) utilizando CTB
purificado como estándar (Biomol International Inc., PA, EE.UU., nº de cat.
G-125, nº de lote H1148b). Todas las muestras se estandarizaron a la
proteína de alga soluble total utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad
(Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania, cat. No. 05479).
2.7. Producción D2
Escherichia coli Se transformó BL21 * (DE3) pLys (Invitrogen, Carlsbad,
CA, EE. UU.) Con pID31 y se cultivó en medio líquido Luria-Bertani (Becton
Dickinson, NJ, EE. UU.) Suplementado con 100 g / ml de ampicilina. que
contiene pID31E. coli se cultivaron a un OD600 de 1.2 antes de Su6La
producción de D2 marcada se indujo durante 4 h mediante la adición de
isopropil 1 mM.D-tiogalactopiranósido (IPTG). 300 ml
E. coli fueron recolectados por centrifugación (6000 × gramo, 15 min, 4 ◦C) y
el sedimento se resuspendió en 20 ml de tampón de resuspensión (Tris-HCl
20 mM, pH 7,9, imidazol 5 mM, NaCl 0,5 mM, 4 ◦C) y procesado tres veces por
una prensa francesa. Su6-etiquetado D2 se purificó usando un Ni2+-columna
de cromatografía de afinidad (Qiagen, Hilden, Alemania) según las
instrucciones del fabricante.
2.8. Ensayo de pepsina
100 l de ddH2O, que contiene algas enteras que expresan CTB-D2, ajustadas a
un contenido intracelular total de CTB-D2 de 200 ng, o 200 ng de CTB purificada
(control), se mezclaron con 100 l de tampón de acetato de sodio 0,2 M (pH 1,7) que
contenía 0,5 mg / ml de pepsina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU., nº de cat. P7000).
Después de la incubación durante 20 min a 37ºC.◦C, se agregaron 25 l de tampón
de carga SDS y las muestras se incubaron durante 10 min en un baño de agua a
95ºC. ◦C.Después de centrifugación durante 3 min a 14.000 × gramo, Se resolvieron
30 l del sobrenadante en un gel de SDS al 16% y se analizó la degradación de CTB-
D2 / CTB mediante transferencia Western (véase más arriba).
275
2.9. Validación de la actividad CTB-D2
(i) Ensayo morfológico basado en células de mamífero.
Células de ovario de hámster chino de tipo salvaje (CHO-K1; ATCC CCL-
61) se sembraron a una densidad de 105 células / ml por pocillo de
una placa de 12 pocillos y cultivado en medio ChoMaster HTS (1
ml / pocillo; Cell Culture Technologies GmbH, Gravesano, Suiza)
suplementado con suero de ternero fetal al 5% (v / v) (FCS, PAN
Biotech GmbH , Aidenbach, Alemania, cat. No. 3302-P251110, lote
no. P251110) y solución de penicilina / estreptomicina al 1% (v / v)
(Sigma, St. Louis, MO, EE. UU., Cat. No. 4458) y cultivada en 37 ◦C en
atmósfera húmeda con 5% de CO2. Se añadieron 300 l de extractos
de algas derivados de CR-25/2 o CR-463/4 o 200 ng de CTB
purificada en 300 l de PBS al pocillo de ensayo y se puntuaron los
cambios morfológicos bajo un microscopio Leica invertido (Leica
Microsystems, Suiza, DMI 600B) después de 12 h. En presencia de
CTB activa o CTB-D2, CHO-K1 adoptó una forma de celda alargada.
(ii) Ensayo de unión a gangliósido GM1.
La unión funcional de las proteínas de fusión CTB-D2, producidas en
algas, al gangliósido GM1 se evaluó mediante ELISA. Placas de 96
pocillos (CostarTM, Corning Inc., NY, EE. UU., Cat. no. 3590) se revistieron
con 5 g / ml de monosialogangliósidos GM1 (Sigma, St. Louis, MO,
EE.UU., nº de cat. G7641) diluidos en metanol. Las placas se sellaron y se
incubaron durante la noche a 4ºC.◦C mientras gira en un agitador orbital
(Polymax 2040; Heidolph Instruments GmbH, Schwabach, Alemania) a
30 rpm. Todas las incubaciones posteriores se realizaron a temperatura
ambiente mientras se giraba en un agitador orbital a 30 rpm. Después
del bloqueo durante 1 h con leche TBS (leche salina tamponada con Tris;
Tris-Base 20 mM, NaCl 150 mM, leche en polvo al 2% (p / v), pH 7,6
ajustado con HCl), las placas se lavaron tres veces con TBS-T (TBS
suplementado con 0,01% (v / v) Tween-20). A continuación, se aplicaron
por pocillo 100 l de extractos de algas puros (20 mg / ml de peso seco) o
diluidos en PBS y se incubaron durante 1 h. Después de lavar tres veces
con TBS-T, se añadieron por pocillo 100 µl de anticuerpo policlonal anti-
CTB de conejo, diluido en PBS a 4,5 µg / ml, y se incubaron durante 1 h.
Luego, los pocillos se lavaron tres veces con TBS-T, y se aplicaron 100 µl
de una solución de anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a HRP
de 5 µg / ml por pocillo y se incubaron durante otra hora. Finalmente,
los pocillos se lavaron cinco veces con TBS-T y se cuantificó la unión de
las proteínas de fusión del alga CTB-D2 a los gangliósidos GM1
añadiendo 100-1,3,5,5′- tetrametilbencidina (TMB, Interchim, Montluçon,
Francia, nº de cat. UP664781) por pocillo. La reacción colorimétrica se
detuvo añadiendo 50 µl de 1 MH2ASI QUE4 por pocillo, y la absorbancia
se midió a 450 nm mediante un espectrofotómetro (Genios Pro, TECAN
AG, Männedorf, Suiza).
2.10. Inmunización oral de ratones
La inmunización se llevó a cabo utilizando ratones hembra OF1 (Charles
River Laboratories, Lyon, Francia). Cada semana durante 5 semanas, los
ratones fueron alimentados con polvo liofilizado de CR-25/2 que expresa
CTB-D2 o el alga de control isogénica CR-463/4 (ver arriba), que se había
almacenado a 4ºC.◦C o a temperatura ambiente durante 20 meses y se
resuspendieron a las concentraciones deseadas en PBS esterilizado filtrado.
Las dosis de algas aplicadas correspondieron a 160 g (refuerzo principal), 40
g, 60 g, 80 gy 160 g de CTB-D2. La sangre se recogió retroorbitalmente y el
suero se aisló en tubos de SST microtainer (Beckton Dickinson, Plymouth,
Reino Unido). Además, los gránulos fecales se recolectaron semanalmente el
día anterior a la alimentación de las algas y se almacenaron en
- 20 ◦C hasta el análisis (ver más abajo). Todos los experimentos con
animales se realizaron de acuerdo con la directiva del Consejo de la
Comunidad Europea (86/609 / EEC), aprobada por la República Francesa
(No. 69266310) y realizada por GC-E. en la Université de Lyon, F-69622
Villeurbanne, Francia.
276

Figura 1. Plásmidos clave utilizados en este estudio. pID25 y pID26 codifican el antígeno CTB-D2, ensamblado fusionando la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) con el dominio de fibronectina D2
optimizado por codón deStaphylococcus aureus, que es constitutivamente impulsado por los 5′rbcL o 5′regiones no traducidas de atpA (UTR). Además, pID25 y pID26 contienen un rbcLdrivenaadA casete
que confiere resistencia a la espectinomicina y al tscA gen que permite la recombinación homóloga específica del cloroplasto de estos vectores después de la transformación en C. reinhardtii. p463 y
p464 son vectores de control isogénicos que carecen de la unidad de expresión CTB-D2.

2.11. Cuantificación de las respuestas inmunitarias sistémicas y UFC deseadas y posteriormente inyectadas por vía intraperitoneal en
mucosas ratones.

Las respuestas inmunitarias de las mucosas a CTB y D2 se evaluaron

2.13. Diseminación de la infección por S. aureus en ratones
resuspendiendo los sedimentos fecales a 100 mg / ml en PBS-T (PBS
suplementado con 0,01% (v / v) Tween-20 al 0,01% (v / v)) que contenía un
Una semana después de la alimentación final de algas (CR-25/2 o
cóctel de inhibidores de proteasa (Roche, Mannheim , Alemania, nº de
CR-463/4), los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de 1 ml de
catálogo 04693132001) utilizando un homogeneizador Ultra-Turrax T8 (IKA-
PBS que contenía una dosis subletal (6 × 106 CFU) de virulento S. aureus (
Labortechnik, Staufen, Alemania). Los homogeneizados se aclararon dos
ATCC 33592). Tres días después, los ratones fueron sacrificados y losS.
veces centrifugando durante 10 min a 13.000× gramo y 4 ◦C y se diluyó 10
aureusla infección fue perfilada por PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-
veces en PBS-T helado. Esta suspensión fecal se almacenó en
PCR) en el intestino y el bazo. Por lo tanto, los órganos se recolectaron, se
- 20 ◦C.Las respuestas inmunitarias de las mucosas específicas para CTB y D2
lavaron una vez en PBS, se hirvieron durante 1 h para inactivarS. aureusy
se cuantificaron mediante ELISA de acuerdo con el protocolo utilizado para
almacenado a -20 ◦C hasta su uso posterior. Se extrajo ADN total (bacteriano
el ensayo de unión al gangliósido GM1, con la excepción de que las placas se
y de mamífero) de muestras de tejido utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue
recubrieron durante la noche a 4ºC. ◦C con CTB purificada de 5 g / ml o His6-
(Qiagen, Hilden, Alemania, nº de cat. 69504) de acuerdo con las instrucciones
Se añadieron D2 purificado con etiqueta y 100 l de las suspensiones fecales a
del fabricante. Las muestras se sometieron a qRT-PCR utilizando el Power
cada pocillo después del bloqueo. Se detectó IgA fecal unida a CTB o D2
SYBRTM Green PCR Master Mix (AB Applied Biosystems, Warrington, Reino
usando una IgG de cabra específica de IgA anti-ratón acoplada a HRP (1 g /
Unido, nº de catálogo 4367659) y un dispositivo de PCR en tiempo real 7500
ml; Bethyl Laboratories Inc., TX, EE. UU., Cat. No. A90-103P) y un TMB
(AB Applied Biosystems). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen
-Reacción colorimétrica basada en cuantificación por absorbancia a 450 nm
total de 20 l que contenían 10 l de Syber GreenTM mezclar 2×, Cebadores
como se describe anteriormente. El ELISA se calibró revistiendo las placas
directos e inversos de 900 nM, así como 100 ng de ADN de muestra. La
durante la noche con diluciones en serie de IgA de ratón purificada (Bethyl
cantidad relativa de
Laboratories Inc., TX, EE.UU., nº de cat. MI10-101). La respuesta inmune
S. aureus en cada órgano se determinó mediante amplificación cuantitativa
sistémica (IgG sérica) se cuantificó de acuerdo con el mismo protocolo pero
del gen bacteriano de copia única nuc utilizando los cebadores OID52
usando sueros de ratón (en lugar de muestras fecales) diluidos dos veces en
(adelante; 5′-gcgattgatggtgatacggtt-3′) y OID53 (reverso; 5′
PBS helado suplementado con inhibidores de proteasa e IgG anti-ratón
-agccaagccttgacgaactaaagc-3′). El control interno y la estandarización de la
acoplado a HRP a 1 g / ml ( Sigma, St. Louis, MO, EE. UU., Nº de catálogo
carga de la muestra se realizaron amplificando un promotor de ARN
A2554).
ribosómico de ratón usando 5′-gaccagttgttcctttgagg-3′ (adelante) y 5′
-acctatctccaggtccaatag-3′ (marcha atrás).

2.12. Cultivo de S. aureus

Virulento S. aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC 33592) se cultivaron
a 37 ◦C a fase logarítmica media en matraces Erlenmeyer con deflectores de
1 l que contienen 300 ml de medio Luria-Bertani. Las bacterias se
cuantificaron como unidades formadoras de colonias (UFC) utilizando
diluciones seriadas seguidas de sembrado en placas de agar LB incubadas
durante la noche a 37ºC.◦C. El S. aureus suspensión (almacenado a 4 ◦C
durante el procedimiento de cuantificación) se centrifugó durante 15 min a
3000 × gramo y el sedimento se resuspendió en PBS estéril a la
2.14. Protección de ratones contra el desafío letal de S. aureus
2 × 109 UFC de S. aureus (ATCC 33592) se determinó como dosis letal para
ratones no tratados. Siete días después de la alimentación final con algas CR-25/2
que expresan CTB-D2 liofilizadas (o CR-463/4 como control isogénico) almacenadas
durante 20 meses a 4ºC.◦C oa temperatura ambiente, los ratones recibieron
inyecciones intraperitoneales letales de 1 ml de PBS que contenía 2 × 109 UFC de S.
aureus y se puntuó diariamente la supervivencia de los animales durante hasta 3
días.

Figura 2. (A) Variación clonal de los niveles de expresión de CTB-D2 en transgénicos C. reinhardtii
transformado con pID25 (CR-25 / 1-6) o pID26 (CR-26 / 1-6). Se utilizó CTB purificada como control
de carga y dosis positiva. (B) Niveles de expresión de CTB-D2 de clones de algas individuales
CR-25 / 1-6 y CR-26 / 1-6.
3. Resultados
3.1. Diseño de C. reinhardtii transgénico diseñado para la
expresión constitutiva del antígeno CTB-D2 en cloroplastos
Para la expresión constitutiva del antigénico CTB-D2, una fusión de la
toxina del cólera B (CTB) y el S. aureus-epítopo específico D2, pID25 (5′rbcL-
aadA-3′rbcL – 5′rbcL-CTB-D2-3′rbcL) y pID26(5′rbcL-aadA-3′rbcL – 5′atpA-CTB-
D2-3′rbcL) (Figura 1) se transformaron de forma independiente en el C.
reinhardtii Cepa de tipo salvaje CC-125 y seleccionada para perfiles de
expresión de CTB-D2 específicos de cloroplasto constitutivos. El análisis de
transferencia Western específico de CTB-D2 de clones de células
homoplásmicas CR-25 y CR-26 reveló una variación significativa en los
niveles de expresión de antígeno con una tendencia de pID25- transgénicoC.
reinhardtii para producir niveles más altos de CTB-D2 (Figura 2A y B).
CR-25/2, que contiene 1,6 mg de CTB-D2 (0,7% de proteína soluble total) por
1 g (23% de proteína soluble total) de algas liofilizadas, se eligió para todos
los experimentos posteriores.
3.2. Producción a gran escala de biomasa de algas que contiene CTB-D2
Para producir suficiente material de algas para un programa de inmunización,
se llevó a cabo una producción a escala de litros de algas transgénicas utilizando
un biorreactor de ondas estándar.TM equipado con un sistema de iluminación a
medida. Comenzando con un inóculo de CR-25/2 de fase logarítmica al 7% (o
CR-463/4 de control)
producción de la cultura sion
CTB-D2 para CR-25 /
Fig. 3. Las algas protegen a CTB-D2 de la degradación en un entorno de pH bajo que contiene
pepsina similar al estómago. CTB, CR-25/2 y CR-463/4 purificados se incubaron durante 20 min a
37ºC.◦C, pH 1,7 en presencia (+) o ausencia (-) de pepsina y CTB-D2 se detectó mediante Western
blot.
nología 145 (2010) 273–280 277
BiorreactorTMEl sistema de producción basado en la producción proporcionó típicamente hasta un 20%
más de biomasa y rendimientos de producción de antígeno en comparación con los cultivos clásicos en
matraz de agitación de 1 l (datos no mostrados).
3.3. C. reinhardtii productora de CTB-D2 resiste la acidez similar al
estómago
Para evaluar la idoneidad de las algas que expresan CTB-D2 para la
vacunación oral, expusimos CR-25/2 a un entorno que simulaba el estómago
(37 ◦C, pH 1,7, 0,5 mg / ml de pepsina, 20 min). El análisis de transferencia
Western reveló que CTB-D2 estaba significativamente protegido dentro de
CR-25/2 del entorno proteolítico, mientras que CTB purificado era más
sensible a la degradación mediada por pepsina (Fig. 3). Esto sugiere que las
algas podrían proteger a los antígenos intracelulares de la proteólisis en el
estómago y retrasar su liberación hasta llegar a los tejidos linfoides
asociados al intestino.
3.4. CTB-D2 derivado de algas se une al receptor de gangliósido GM1
La subunidad B de la toxina del cólera se fusionó con la S. aureusEpítopo
D2 para mejorar la respuesta inmune por internalización mediada por el
receptor del gangliósido GM1 en los tejidos linfoides asociados al intestino.
Antes de comenzar el programa de inmunización, se evaluó el adyuvante de
CTB puro y CTB-D2 derivado de CR-25/2.in vitro utilizando un ensayo de
receptor de gangliósido GM1 de tipo ELISA. CTB-D2 derivado de CR-25/2 se
unió específica y eficientemente al receptor de gangliósido GM1 (Figura 4A).
Además, cuando las células de ovario de hámster chino (CHO-K1), que
expresan receptores de gangliósido GM1 en su superficie celular, se
incubaron con CTB-D2 producida por algas, adoptaron una forma de célula
alargada específica de CTB que indica que CTB-D2 era funcional y podía
unirse a los receptores GM1 (Figura 4B).
3.5. La vacunación oral de ratones con CR-25/2 provoca respuestas
inmunitarias sistémicas y mucosas específicas contra S. aureus
Dos grupos de ratones fueron sometidos a un programa de vacunación
de 5 semanas, durante el cual fueron alimentados con algas CR-25/2 que
expresan CTB-D2 o con algas control isogénicas CR-463/4 que carecen de
expresión de antígenos. Para evaluar la inducción de una respuesta inmune
mucosa, se cuantificó la IgA en gránulos fecales recolectados cada semana
durante el programa de vacunación. Dos semanas después de la primera
administración de CR-25/2, IgA específica para CTB (249± 100 ng / g) y D2
(265 ± 91 ng / g) se detectaron en las heces de ratones. Los títulos de IgA
aumentaron constantemente durante todo el programa de vacunación y
alcanzaron un máximo de 2303± 547 (CTB) y 2250 ± 652 ng / g (D2) el día 27 (
Figura 5A). Del mismo modo, los títulos de IgG de la respuesta sistémica
aumentaron de 0,8± 0.3 (CTB) y 0.8 ± 0,2 g / ml (D2) del día 6 al 14 ± 5 (CTB) y
15 ± 4 -g / ml (D2) el día 27 del programa de vacunación (Figura 5B).
3.6. Vacunación oral de ratones con CR-25/2 liofilizado almacenado durante
20 meses a temperatura ambiente
Mantener una cadena de frío ininterrumpida entre el productor y el
paciente es un factor de costo importante y un desafío en el negocio de las
vacunas, en particular cuando se dirige a los mercados de los países en vías
de industrialización. Por lo tanto, hemos evaluado la calidad de la
inmunización de CR-25/2S. aureus vacuna que se almacenó a temperatura
ambiente durante 20 meses. El análisis de las respuestas inmunitarias
sistémicas y mucosas reveló que la vacuna derivada de algas desencadenó la
producción de niveles similares de IgA / IgG en ratones alimentados con
CR-25/2 almacenado durante 20 meses a 4ºC.◦C oa temperatura ambiente (
Figura 5A y B).
278

Figura 4. La CTB-D2 recombinante de t gliósido

GM1 se cuantificó mediante ELISA. Purifi funcional
CTB-D2 altera la forma de wild-typ

Figura 5. Respuesta inmune y almacenamiento a largo plazo de la vacuna contra las algas. (A) Respuesta inmune de las mucosas de ratones alimentados con el alga CR-25/2 que expresa CTB-D2. Heces
recolectadas en diferentes días durante el programa de vacunación con CR-25/2 liofilizado almacenado durante 20 meses a 4◦Se analizaron los niveles de IgA específica de CTB- (i) y D2- (ii) mediante
ELISA. (B) Respuesta inmune sistémica de ratones alimentados con CR-25/2 que expresa CTB-D2. Suero recolectado en diferentes días durante el programa de vacunación con CR-25/2 liofilizado
almacenado durante 20 meses a 4◦Se analizaron los niveles de IgG específicos de CTB- (i) y D2- (ii) mediante ELISA.

Figura 6. Reducción de S. aureus copias genómicas en órganos de ratón tratados. Una semana
después del final del programa de inmunización utilizando CR-25/2 liofilizado (o CR-463/4
isogénico como control) almacenado durante 20 meses a 4◦C o temperatura ambiente, los
ratones fueron desafiados con una dosis subletal de virulenta S. aureus (6 × 106 CFU). El intestino
y el bazo fueron explantados y la presencia deS. aureus El ADN genómico fue perfilado por qRT-
PCR.
3.7. La vacunación basada en CR-25/2 atenúa la infección subletal por S.
aureus en ratones
Con el fin de perfilar el nivel de protección conferido por la inmunización a
base de algas utilizando la cepa vacunal CR-25/2, infectamos ratones vacunados
con CR-25/2 almacenados durante 20 meses a 4 ◦C o temperatura ambiente con
una dosis subletal de S. aureus (6 × 106 CFU) y cuantificó la presencia del patógeno
en el bazo y el intestino de los animales mediante qRT-PCR. Figura 6 muestra la
disminución en el número de copias genómicas de S. aureus en diferentes
órganos de vacunados (alimentados con CR-25/2, almacenados durante 20 meses
a 4 ◦C o temperatura ambiente) en relación con los ratones de control
(alimentados con CR-463/4). Los animales tratados con CR-25/2 muestran cargas
patógenas significativamente más bajas en el bazo (reducción del 45%) y el
intestino (reducción del 65%), lo que sugiere que la vacuna basada en CR-25/2
(almacenada durante más de 20 meses a 4◦C o temperatura ambiente) prepara
con éxito el sistema inmunológico del ratón contra S. aureus Infecciones.
3.8. La vacuna comestible derivada de C. reinhardtii protege a los ratones
vacunados contra una dosis letal de S. aureus
Ratones alimentados con la cepa de vacuna CR-25/2 (o el alga de control
isogénica CR-463/4) o la cepa de control CR-463/4 almacenados durante 20 meses
a 4ºC. ◦C oa temperatura ambiente recibió una letal S. aureus dosis (2 × 109 UFC) 7
días después de la alimentación final de las algas. Mientras que todos los ratones
de control murieron dentro de las 48 h posterioresS. aureus inyección contra los
grupos de tratamiento estaban protegidos S. aureus y 8 de cada 10 ratones
vacunados sobrevivieron a la infección letal.
4. Discusión
Cada año, millones de personas mueren de enfermedades infecciosas,
más del 50% de las cuales son causadas por patógenos que invaden al
huésped a través de las superficies mucosas (Zeitlin y col., 2004). Se ha
aprendido mucho de los estudios en animales sobre los atributos de las
vacunas de mucosas eficaces y los efectores inmunitarios implicados en la
prevención y el control de las infecciones de las mucosas (Holmgren y
Czerkinsky, 2005). El desafío al que nos enfrentamos hoy es diseñar vacunas
innovadoras dirigidas a etapas clave de la infección, como la adhesión de
bacterias a las superficies mucosas o la colonización posterior del huésped,
que es la estrategia definitiva para prevenir enfermedades nuevas y
reemergentes (Burton, 2002; Parren y col., 2001; Scavone y col., 2004).
S. aureus es un patógeno oportunista que vive en la piel humana
y mucosa nasalLowy, 1998) que ocasionalmente causa bacterias
tecnología 145 (2010) 273–280 279
teremia que conduce a infecciones secundarias potencialmente mortales como
endocarditis (Moreillon y Que, 2004) en particular durante infecciones
nosocomiales que involucran patógenos multirresistentes (Lowy, 2003; Menzies,
2003). S. aureus expresa proteínas de unión a fibronectina (FnBP), que son críticas
en la patogénesis, ya que permiten que el patógeno se adhiera a la matriz
extracelular del huésped (Patti y Höök, 1994). Como antígeno de prueba de
concepto para el diseño de unC. reinhardtii-vacuna comestible a base de S. aureus,
Hemos utilizado un dominio D2 derivado de FnBP que se fusionó con el adyuvante
de la mucosa CTB, la subunidad B de la toxina del cólera, que promueve la
internalización mediada por el receptor del gangliósido GM1 en los tejidos
linfoides asociados al intestino y mejora las respuestas inmunitarias específicas de
antígeno (Sun et al., 1994). Antígeno de fusión CTB-D2 de codón optimizado,
expresado constitutivamente en cloroplastos homoplásmicos de transgénicos.C.
reinhardtii,era más resistente a los ataques proteolíticos de pH bajo en
condiciones que simulaban el estómago dentro de algas modificadas, pero era
capaz de unirse a GM1 y desencadenar respuestas inmunitarias sistémicas y
mucosas que producían IgA e IgG específicas de D2 que limitaban la diseminación
bacteriana en ratones alimentados con CTB-D2 liofilizado que expresaba gránulos
de algas y protegió a los animales contra inyecciones letales de S. aureus.
La vacunación, el proceso de preparar el sistema inmunológico para
luchar contra futuras infecciones, es la intervención médica más rentable y
eficiente que, a diferencia de la medicación clásica que proporciona
tratamiento después del inicio de la enfermedad, ofrece protección a largo
plazo sin ninguna acción terapéutica. . A pesar de estos activos, la
producción de vacunas es un proceso industrial que requiere conocimientos
e inversiones sustanciales (Ulmer y col., 2006; Sierpe, 2004) que a menudo
limita la disponibilidad de vacunas de última generación en los países en
desarrollo. La necesidad de mantener una cadena de frío estricta y la
disponibilidad de personal médico para la administración repetida con
agujas exacerba aún más la presión económica sobre los programas
mundiales de vacunación (Giudice y Campbell, 2006; Jodar et al., 2001).
Las vacunas comestibles que utilizan cultivos modificados que expresan
antígenos se han promocionado durante mucho tiempo como vacunas ideales, ya
que podrían producirse en el sitio con conocimientos agrícolas básicos y no
requieren ningún procedimiento costoso de purificación y procesamiento
posterior (Levine y Sztein, 2004; Mason y col., 1996; Rigano y col., 2004; Walmsey y
col., 2003; revisado enKhalsa et al., 2005). Sin embargo, la producción de cultivos
transgénicos a campo abierto a menudo genera preocupaciones sociales sobre los
riesgos ambientales, el uso excesivo de plaguicidas y el compromiso de la
seguridad alimentaria, que es una gran amenaza para la salud humana (Vasil,
2003). Además, debido a la superficie limitada, el cultivo de cultivos de vacunas
transgénicas enfrenta un problema de escala y dado que los antígenos se
expresan típicamente solo en órganos muy específicos de la planta, la mayor parte
de la biomasa de la planta no está disponible para vacunación ni como alimento (
Fischer y col., 2004; Schillberg y col., 2005).
Como planta GRAS no alimentaria, el alga verde C. reinhardtii reúne varias
características importantes para un hospedador de vacuna comestible ideal: (i)
facilidad de cultivo en un ambiente contenido a gran escala y bajo costo. Una
solución salina acuosa, luz del día y una plataforma de agitación son suficientes
para la producción a gran escala de este organismo. El biorreactor de olasTM
demostró ser particularmente adecuada ya que esta plataforma de producción es
escalable, no compite con la agricultura y resultó en un aumento general de la
biomasa del 20%. (ii) Una caja de herramientas de biología molecular básica
permite la construcción sencilla de homoplásmicosC. reinhardtii con expresión
constitutiva de antígeno de alto nivel en el cloroplasto de alga. (iii) Los antígenos
cloroplásticos parecen estar protegidos en gran medida del entorno proteolítico
de pH bajo que se encuentra en el estómago. (iv) Las algas modificadas
genéticamente que expresan antígenos se pueden producir, liofilizar, distribuir y
almacenar durante más de 1,5 años sin enfriamiento en ninguna etapa del
proceso, lo que ahorra hasta 300 millones de dólares por año (Giudice y Campbell,
2006). (v) Toda la biomasa de algas está disponible para vacunación. (vi) Las algas
liofilizadas pueden desencadenar una respuesta inmune protectora como se
ejemplifica paraS. aureusinfección en ratones.
280 IAJ Dreesen y col. / Revista de Biotecnología145 (2010) 273–280

Aunque hay un amplio margen de mejora, este estudio sugiere que el Ma, JK, Drake, PM, Christou, P., 2003. La producción de fármacos recombinantes
alga verde C. reinhardtii tiene lo que se necesita para convertirse en una ticos en plantas. Nat. Rev. Genet. 4, 794–805.
Ma, JK, Hiatt, A., Hein, M., Vine, ND, Wang, F., Stabila, P., van Dollewerd, C., Mostov,
plataforma principal de expresión de antígenos y desarrollo de vacunas para K., Lehner, T., 1995. Generación y ensamblaje de anticuerpos secretores en plantas.
la fabricación económica de vacunas orales que protegen contra Science 268, 716–719.
enfermedades infecciosas importantes. Mason, HS, Ball, JM, Shi, JJ, Jiang, X., Estes, MK, Arntzen, CJ, 1996. Expresión
de la proteína de la cápside del virus Norwalk en el tabaco y la papa transgénicos y su
inmunogenicidad oral en ratones. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5335–5340.
Expresiones de gratitud Mayfield, SP, Franklin, SE, Lerner, RA, 2003. Expresión y montaje de un
Anticuerpo activo en algas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 225–229. Menzies, BE,
2003. El papel de las proteínas de unión a fibronectina en la patogénesis de
Agradecemos a Marlène Vuillot por la asistencia técnica calificada y a Staphylococcus aureus Infecciones. Curr. Opin. Infectar. Dis. 16, 225-229. Moreillon,
Marcia Schoenberg por los comentarios críticos sobre el manuscrito. Este P., Que, YA, 2004. Endocarditis infecciosa. Lancet 363, 139-149. Neutra, MR, Kozlowski, PA,
trabajo fue financiado por la Swiss National Science Foundation (subvención 2006. Vacunas mucosas: la promesa y el desafío.
Nat. Rev. Immunol. 6, 148-158.
no. 31003A0-126022).
Nochi, T., Takagi, H., Yuki, Y., Yang, L., Masumura, T., Mejima, M., Nakanishi, U.,
Matsumura, A., Uozumi, A., Hiroi, T., Morita, S., Tanaka, K., Takaiwa, F., Kiyono, H.,
Referencias 2007. Vacuna mucosa a base de arroz como estrategia global para la cadena de frío y
vacunación sin agujas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 10986–10991.
Parren, PW, Marx, PA, Hessell, AJ, Luckay, A., Harous, J., Cheng-Mayer, C., Moore,
Arntzen, C., Plotkin, S., Dodet, B., 2005. Vacunas y anticuerpos derivados de plantas: potencial
JP, Burton, DR, 2001. El anticuerpo protege a los macacos contra la exposición vaginal
tial y limitaciones. Vaccine 23, 1753-1756.
con un virus de inmunodeficiencia humana / simio R5 patógeno a niveles séricos que
Brennan, FR, Bellaby, T., Helliwell, SM, Jones, TD, Kamstrup, S., Dalsgaard, K., Flock,
dan una neutralización completa in vitro. J. Virol. 75, 8340–8347.
JI, Hamilton, WD, 1999. Las partículas de virus de plantas quiméricas administradas por vía
Patti, JM, Höök, M., 1994. Adhesinas microbianas que reconocen la matriz extracelular.
nasal u oral inducen respuestas inmunitarias sistémicas y mucosas en ratones. J. Virol. 73,
macromoléculas. Curr. Opin. Celda. Biol. 6, 752–758.
930–938.
Rappuoli, R., Pizza, M., Douce, G., Dougan, G., 1999. Estructura y adju-
Burton, DR, 2002. Anticuerpos, virus y vacunas. Nat. Rev. Immunol. 2, 706–713.
vancidad del cólera y enterotoxinas termolábiles de Escherichia coli. Immunol. Hoy
Czerkinsky, C., Anjuere, F., McGhee, JR, George-Chandy, A., Holmgren, J., Kieny, MP,
20, 493–500.
Fujiyashi, K., Mestecky, JF, Pierrefite-Carle, V., Rask, C., Sun, JB, 1999. Inmunidad y
Rigano, MM, Alvarez, ML, Pinkhasov, J., Jin, Y., Sala, F., Arntzen, CJ, Walmsley, AM,
tolerancia de las mucosas: relevancia para el desarrollo de vacunas. Immunol. Rev.
2004. Producción de una proteína de fusión que consiste en el enterotoxigénico Escherichia
170, 197–222.
coli subunidad de la toxina B termolábil y un antígeno de tuberculosis en Arabidopsis
Doran, PM, 2000. Producción de proteínas extrañas en cultivos de tejidos vegetales. Curr. Opin.
thaliana.Plant Cell Rep. 22, 502–508.
Biotechnol. 11, 199-204.
Scavone, P., Sosa, V., Pellegrino, R., Galvalisi, U., Zunino, P., 2004. Vacunación mucosa
Fischer, R., Stoger, E., Schillberg, S., Christou, P., Twyman, RM, 2004. Basado en plantas
de ratones con recombinante Proteus mirabilis proteínas fimbriales estructurales. Los microbios
producción de biofarmacéuticos. Curr. Opin. Plant Biol. 7, 152-158. Franklin, SE,
infectan. 6, 853–860.
Mayfield, SP, 2005. Desarrollos recientes en la producción de humanos
Schillberg, S., Twyman, RM, Fischer, R., 2005. Oportunidades para anti-recombinantes
proteínas terapéuticas en algas eucariotas. Opinión de expertos. Biol. El r. 5, 225-235.
expresión de genes y anticuerpos en plantas transgénicas: evaluación de la tecnología.
Gitzinger, M., Parsons, J., Reski, R., Fussenegger, M., 2009. Functional cross-kingdom
Vaccine 23, 1764-1769.
conservación de mamíferos y musgosPhyscomitrella patens) maquinarias de
Shimoda, K., Kwon, S., Utsuki, A., Ohiwa, S., Katsuragi, H., Yonemoto, N., Hamada, H.,
transcripción, traducción y secreción. Plant Biotechnol. J. 7, 73–86.
2007. Glucosilación de capsaicina y 8-nordihidrocapsaicina por células cultivadas de
Giudice, EL, Campbell, JD, 2006. Entrega de vacunas sin aguja. Adv. Drug Deliv. Rvdo.
Catharanthus roseus. Phytochemistry 68, 1391-1396.
58, 68–89.
Streatfield, SJ, 2005. Entrega de vacunas derivadas de plantas. Opinión de expertos. Drug Deliv. 2,
Gomord, V., Faye, L., 2004. Modificación postraduccional de proteínas terapéuticas en
719–728.
plantas. Curr. Opin. Plant Biol. 7, 171-181.
Sun, JB, Holmgren, J., Czerkinsky, C., 1994. Subunidad B de la toxina del cólera: una
Haq, TA, Mason, HS, Clements, JD, Arntzen, CJ, 1995. Inmunización oral con
sistema de suministro de portador transmucoso para la inducción de tolerancia
un antígeno bacteriano recombinante producido en plantas transgénicas. Science 268, 714–
inmunológica periférica. Proc. Natl. Sci. USA 91, 10795–10799.
716.
Ulmer, JB, Valley, U., Rappuoli, R., 2006. Desafíos de fabricación de vacunas y
Hellwig, S., Drossard, J., Twyman, RM, Fisher, R., 2004. Cultivos de células vegetales para el
soluciones. Nat. Biotechnol. 24, 1377-1383.
producción de proteínas recombinantes. Nat. Biotechnol. 22, 1415-1422. Holmgren, J.,
Vasil, JK, 2003. La ciencia y la política de la biotecnología vegetal: una perspectiva personal
Czerkinsky, C., 2005. Inmunidad de las mucosas y vacunas. Nat. Medicina. 11,
tivo. Nat. Biotechnol. 21, 849–851.
45–53.
Walker, TL, Purton, S., Becker, DK, Collet, C., 2005. Microalgae as biorreactors. Planta
Jodar, L., Duclos, P., Milstien, JB, Griffiths, E., Aguado, MT, Clements, CJ, 2001.
Cell Rep. 24, 629–641.
Garantizar la seguridad de las vacunas en los programas de inmunización: una perspectiva de la OMS.
Walmsey, AM, Alvarez, ML, Jin, Y., Kirk, DD, Lee, SM, Pinkhasov, J., Rigano, MM,
Vaccine 19, 1594-1605.
Arntzen, CJ, Mason, HS, 2003. Expresión de la subunidad B de enterotoxina termolábil
Khalsa, G., Mason, HS, Arntzen, CJ, 2005. Vacunas derivadas de plantas: progreso y
de Escherichia coli como proteína de fusión en tomate transgénico. Plant Cell Rep. 21,
limitaciones. En: Fisher, R., Schillberg, S. (Eds.), Molecular Pharming. Wiley and Sons,
1020–1026.
Weinheim, págs. 135-154.
Weber, CC, Link, N., Fux, C., Zisch, AH, Weber, W., Fussenegger, M., 2005.
Kindle, KL, Richards, KL, Stern, DB, 1991. Ingeniería del genoma del cloroplasto:
Biosensores de proteínas de amplio espectro para la detección de antibióticos de clases específicas.
técnicas y capacidades para la transformación de cloroplasto en Chlamydomonas
Biotechnol. Bioeng. 89, 9-17.
reinhardtii. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1721-1725.
Wurm, F., 2004. Producción de terapias de proteínas recombinantes en mamíferos cultivados
Levine, MM, Sztein, MB, 2004. Estrategias de desarrollo de vacunas para mejorar
células malienses. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398.
inmunización: el papel de la inmunología moderna. Nat. Immunol. 5, 460–464. Lowy,
Zeitlin, N., Cone, RA, Whaley, KJ, 2004. Usando anticuerpos monoclonales para prevenir
FD, 1998.Staphylococcus aureus Infecciones. N. Engl. J. Med. 339, 520–532. Lowy, FD,
transmisión mucosa de enfermedades infecciosas epidémicas. Emerg. Infectar. Dis. 5, 54–64.
2003. Resistencia a los antimicrobianos: el ejemplo deStaphylococcus aureus. J.
Clin. Invertir. 111, 1265-1273.