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Plant Cell Rep (2008) 27: 411–424

DOI 10.1007 / s00299-007-0474-9

REVISIÓN

Enfoques transgénicos para la tolerancia al estrés abiótico en plantas:

retrospectiva y perspectivas

Pooja Bhatnagar-Mathur Æ V. Vadez Æ

Kiran K. Sharma

Recibido: 20 de agosto de 2007 / Revisado: 21 de octubre de 2007 / Aceptado: 22 de octubre de 2007 / Publicado en línea: 20 de noviembre de 2007
- Springer-Verlag 2007

Abstracto Las tensiones abióticas, incluida la sequía, son amenazas graves para la sostenibilidad de los rendimientos de los evaluación de la respuesta al estrés abiótico y los protocolos para
cultivos, lo que representa más pérdidas de productividad de los cultivos que cualquier otro factor en la agricultura de secano. probar la tolerancia de las plantas transgénicas en condiciones
El éxito en el mejoramiento de variedades mejor adaptadas al estrés abiótico depende de los esfuerzos concertados de varios cercanas al campo.
campos de investigación, incluida la fisiología vegetal y celular, la biología molecular, la genética y el mejoramiento. El uso de

herramientas modernas de biología molecular para dilucidar los mecanismos de control de la tolerancia al estrés abiótico y Palabras clave Estrés abiótico - Tolerancia a la sequía -
para la ingeniería de cultivos tolerantes al estrés se basa en la expresión de genes específicos relacionados con el estrés. Por lo Ingeniería genética - Factores de transcripción -
tanto, la ingeniería genética para desarrollar plantas tolerantes al estrés, basada en la introgresión de genes que se sabe que Eficiencia de transpiración
están involucrados en la respuesta al estrés y la supuesta tolerancia, podría resultar un camino más rápido hacia la mejora de

las variedades de cultivos. Mucho más allá de los intentos iniciales de insertar genes de "acción única", la ingeniería de la

maquinaria reguladora que involucra factores de transcripción ha surgido como una nueva herramienta ahora para controlar Introducción
la expresión de muchos genes sensibles al estrés. Sin embargo, la tarea de generar cultivares transgénicos no solo se limita al

éxito en el proceso de transformación, sino también a la adecuada incorporación de la tolerancia al estrés. La evaluación de las El estrés abiótico afecta negativamente al crecimiento y la
plantas transgénicas en condiciones de estrés y la comprensión del efecto fisiológico de los genes insertados a nivel de toda la productividad y desencadena una serie de cambios
planta siguen siendo los principales desafíos a superar. Esta revisión se centra en el progreso reciente en el uso de tecnología morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares en las
transgénica para mejorar la tolerancia al estrés abiótico en las plantas. Esto incluye una discusión sobre el La ingeniería de la plantas. La sequía, las temperaturas extremas y los suelos
maquinaria reguladora que involucra factores de transcripción ha surgido como una nueva herramienta ahora para controlar salinos son los estreses abióticos más comunes que enfrentan
la expresión de muchos genes sensibles al estrés. Sin embargo, la tarea de generar cultivares transgénicos no solo se limita al las plantas. A nivel mundial, aproximadamente el 22% de la
éxito en el proceso de transformación, sino también a la adecuada incorporación de la tolerancia al estrés. La evaluación de las tierra agrícola es salina (FAO2004), y las áreas bajo sequía ya se
plantas transgénicas en condiciones de estrés y la comprensión del efecto fisiológico de los genes insertados a nivel de toda la están expandiendo y se espera que esto aumente aún más
planta siguen siendo los principales desafíos a superar. Esta revisión se centra en el progreso reciente en el uso de tecnología (Burke et al. 2006). A menudo, los cultivos están expuestos a
transgénica para mejorar la tolerancia al estrés abiótico en las plantas. Esto incluye una discusión sobre el La ingeniería de la múltiples tensiones, y la forma en que una planta detecta y
maquinaria reguladora que involucra factores de transcripción ha surgido como una nueva herramienta ahora para controlar responde a diferentes factores ambientales parece
la expresión de muchos genes sensibles al estrés. Sin embargo, la tarea de generar cultivares transgénicos no solo se limita al superponerse. Los perfiles de expresión génica de las plantas
éxito en el proceso de transformación, sino también a la adecuada incorporación de la tolerancia al estrés. La evaluación de las de cebada estresadas por sequía o sal indicaron que, aunque
plantas transgénicas en condiciones de estrés y la comprensión del efecto fisiológico de los genes insertados a nivel de toda la varios genes estaban regulados diferencialmente en respuesta
planta siguen siendo los principales desafíos a superar. Esta revisión se centra en el progreso reciente en el uso de tecnología a diferentes estreses, posiblemente inducen una respuesta de
transgénica para mejorar la tolerancia al estrés abiótico en las plantas. Esto incluye una discusión sobre el La tarea de generar defensa similar (Ozturk et al.2002).
Cuando una planta está sujeta a estrés abiótico, se activan varios
cultivares transgénicos no solo se limita al éxito en el proceso de transformación, sino también a la adecuada incorporación de la tolerancia al estrés. La evaluación de las plantas transgénicas en condiciones de estrés y la comprensión del efecto fisiológico de los genes insertados a nivel de t

genes, lo que da como resultado un aumento de los niveles de

varios metabolitos y proteínas, algunos de los cuales pueden ser
Comunicado por P. Kumar. responsables de conferir cierto grado de protección a estos
estreses. Una clave para avanzar hacia la obtención de mejores
P. Bhatnagar-Mathur - V. Vadez - KK Sharma (Y) Instituto Internacional
cultivos bajo estrés ha sido comprender los cambios en la
de Investigación de Cultivos para los Trópicos Semiáridos (ICRISAT),
Patancheru, Andhra Pradesh 502 324, India correo electrónico: maquinaria celular, bioquímica y molecular que se producen en
k.sharma@cgiar.org respuesta al estrés. Las técnicas moleculares modernas implican

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la identificación y el uso de marcadores moleculares que pueden
mejorar los programas de mejoramiento. Sin embargo, la
introgresión de porciones genómicas (QTL) implicadas en la
tolerancia al estrés a menudo trae consigo características
agronómicas indeseables de los padres donantes. Esto se debe a la
falta de un conocimiento preciso de los genes clave que subyacen a
los QTL. Por lo tanto, el desarrollo de plantas modificadas
genéticamente mediante la introducción y / o sobreexpresión de
genes seleccionados parece ser una opción viable para acelerar la
reproducción de plantas "mejoradas". Intuitivamente, la ingeniería
genética sería una forma más rápida de insertar genes beneficiosos
que a través de la reproducción convencional o molecular. Además,
sería la única opción cuando los genes de interés se originen a
partir de especies de barreras cruzadas, parientes lejanos o de
fuentes no vegetales. En efecto, hay varios rasgos cuya asociación
correlativa con la resistencia se ha probado en plantas
transgénicas. Siguiendo estos pasos lógicos, se han utilizado
diversas tecnologías transgénicas para mejorar la tolerancia al
estrés en las plantas (Allen1995).
La expresión génica inducida por estrés puede clasificarse ampliamente en tres grupos: (1)
genes que codifican proteínas con funciones enzimáticas o estructurales conocidas, (2) proteínas con
funciones aún desconocidas y (3) proteínas reguladoras. Los intentos iniciales de desarrollar
transgénicos (principalmente tabaco) para la tolerancia al estrés abiótico involucraron '' genes de
acción única '', es decir, genes responsables de la modificación de un metabolito único que conferiría
una mayor tolerancia al estrés por sal o sequía Proteínas inducidas por estrés con funciones
conocidas como Las proteínas del canal de agua, enzimas clave para la biosíntesis de osmolitos
(prolina, betaína, azúcares como trehalosa y poliaminas), enzimas de desintoxicación y proteínas de
transporte fueron los objetivos iniciales de la transformación de las plantas. De hecho, los rasgos
metabólicos, especialmente las vías con relativamente pocas enzimas, se han caracterizado
genéticamente y parecen más susceptibles a manipulaciones que los rasgos estructurales y de
desarrollo. Sin embargo, ese enfoque ha pasado por alto el hecho de que es probable que la
tolerancia al estrés abiótico involucre muchos genes a la vez, y que es poco probable que la tolerancia
a un solo gen sea sostenible. Por lo tanto, ha surgido una segunda "ola" de intentos de
transformación de plantas con la tercera categoría de genes inducidos por estrés, a saber, proteínas
reguladoras. A través de estas proteínas, muchos genes implicados en la respuesta al estrés pueden
ser regulados simultáneamente por un solo gen que codifica el factor de transcripción inducible por
estrés (Kasuga et al. y que es poco probable que la tolerancia a un solo gen sea sostenible. Por lo
tanto, ha surgido una segunda "ola" de intentos de transformación de plantas con la tercera
categoría de genes inducidos por estrés, a saber, proteínas reguladoras. A través de estas proteínas,
muchos genes implicados en la respuesta al estrés pueden ser regulados simultáneamente por un
solo gen que codifica el factor de transcripción inducible por estrés (Kasuga et al. y que es poco
probable que la tolerancia a un solo gen sea sostenible. Por lo tanto, ha surgido una segunda "ola" de
intentos de transformación de plantas con la tercera categoría de genes inducidos por estrés, a
saber, proteínas reguladoras. A través de estas proteínas, muchos genes implicados en la respuesta
al estrés pueden ser regulados simultáneamente por un solo gen que codifica el factor de
transcripción inducible por estrés (Kasuga et al.1999), lo que ofrece la posibilidad de mejorar la
tolerancia a múltiples estreses, incluidos la sequía, la salinidad y las heladas. Es interesante notar que
esta "segunda ola" también ha coincidido con una mejor integración de la ingeniería genética y la
fisiología vegetal.
Además, la ingeniería genética permite controlar el
tiempo, la especificidad del tejido y el nivel de expresión de
los genes introducidos para su función óptima. Esto es un
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Consideración importante si la acción de un gen o factor de
transcripción dado se desea solo en un momento específico, en un
órgano específico o bajo condiciones específicas de estrés. Los
hallazgos básicos sobre los promotores del estrés han llevado a un
cambio importante en el paradigma de la ingeniería genética de
cultivos tolerantes al estrés en los últimos años (Katiyar et al.1999).
Los promotores más utilizados en la generación de plantas
transgénicas se expresan constitutivamente, es decir, se activan
todo el tiempo y durante todo el ciclo de vida de la planta. Sin
embargo, en los casos en que la expresión génica debe adaptarse a
un órgano específico o un momento específico, dichos promotores
constitutivos pueden no ser una opción adecuada, especialmente
para los genes inducidos por estrés. Esto se debe a que la expresión
constitutiva de algunos genes inducidos por el estrés puede tener
efectos nocivos graves en la planta. En consecuencia, los esfuerzos
más recientes para generar plantas transgénicas hacen uso de
casetes de genes impulsados por promotores inducidos por
estrés. Con un número cada vez mayor de genes de estrés
disponibles y la transformación genética convirtiéndose en un
procedimiento más o menos rutinario, la caracterización de los
promotores inducidos por estrés (particularmente los inducidos por
anaeróbicos,1999).
Es importante examinar cómo se evalúan las plantas transgénicas y
cómo la prueba de concepto del efecto genético en plantas modelo
puede adaptarse a las especies de cultivos. Desafortunadamente, una
cantidad sustancial de trabajos publicados que involucran la evaluación
de plantas transgénicas bajo estrés abiótico ha mostrado el efecto del
transgén en ambientes de crecimiento que es poco probable que
ocurran en condiciones naturales. Por lo tanto, es necesario establecer
pautas básicas sobre los protocolos que se utilizarán para llevar a cabo
una evaluación rigurosa de la respuesta de las plantas transgénicas a los
estreses abióticos. Dado que la mayor parte del trabajo realizado hasta
ahora se ha centrado en unas pocas plantas modelo, también es
necesario documentar y resumir los principales logros en las plantas de
cultivo.
Esta revisión resume el progreso reciente en el uso de la
tecnología de plantas transgénicas para la mejora de la tolerancia al
estrés abiótico utilizando ejemplos de investigaciones dirigidas al
estrés por sequía, salinidad y temperatura, con especial atención a
cómo se evalúan las plantas transgénicas.
Genes de acción única
Osmoprotectores
El estrés osmótico severo provoca cambios perjudiciales en los
componentes celulares. En las plantas transgénicas tolerantes al
estrés, muchos genes participan en la síntesis de osmoprotectores:
compuestos orgánicos como aminoácidos (p. Ej., Prolina), aminas
cuaternarias y otras (p. Ej., Glicinabetaína y poliaminas) y una
variedad de azúcares y alcoholes de azúcar (p. Ej., Manitol,
trehalosa y galactinol) que se acumulan durante la osmótica
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ajuste — se han utilizado hasta la fecha (Vincour y Altman2005).
Muchos cultivos carecen de la capacidad de sintetizar los
osmoprotectores especiales que acumulan naturalmente los
organismos tolerantes al estrés. Se cree que la osmorregulación
sería la mejor estrategia para la tolerancia al estrés abiótico,
especialmente si los genes osmorreguladores pudieran activarse en
respuesta a la sequía, la salinidad y las altas temperaturas. Por lo
tanto, una estrategia ampliamente adoptada ha sido diseñar ciertos
osmolitos o sobreexpresar dichos osmolitos en las plantas, como
una ruta potencial para generar cultivos tolerantes al estrés.
Se están siguiendo varias estrategias para diseñar
genéticamente la osmoprotección en plantas. El primer paso
involucrado en la obtención de plantas transgénicas tolerantes
al estrés ha sido diseñar genes que codifiquen enzimas para la
síntesis de osmolitos seleccionados (Bray1993). Esto ha dado
lugar a una profusión de informes que involucran
osmoprotectores como la glicina-betaína (Ishitani et al.1997;
Lilius y col.1996; Hayashi y col.1997, 1998; Alia y col.1998, 1999;
Sakamoto y col.1998, 2000; Holmstrom2000; McNeil y col.2000)
y prolina (Delauney y Verma 1993; Nanjo y col.1999a; Zhu y col.
1998; Yamada y col.2005). Además, una serie de `` alcoholes de
azúcar '' (manitol, trehalosa, mioinositol y sorbitol) se han
dirigido a la ingeniería de la sobreproducción de solutos
compatibles, protegiendo así la membrana y los complejos de
proteínas durante el estrés (Tarczynski et al.1993; Yang y col.
1996; Shen y col.1997; Abebe y col.2003; Holmstrom y col.1996;
Zhao y col.2000; Pilon-Smits y col.1995, 1998, 1999; Garg y col.
2002; Cortina y Culiáñez2005; Gao y col.2000). De manera
similar, también se han desarrollado transgénicos diseñados
para la sobreexpresión de poliaminas (Roy y Wu2001; 2002;
Kumria y Rajam2002; Waie y Rajam2003; Anderson y col.1998;
Capell y col.2004). Los estudios sobre la identificación /
aislamiento / clonación de genes que están asociados con una
mejor tolerancia al estrés por inundaciones también se han
centrado en las enzimas de las vías de fermentación glicolítica y
alcohólica, lo que indica que la vía respiratoria se ve afectada
de manera importante en respuesta al estrés anaeróbico.
Investigaciones sobre la alteración genética de los niveles de
pdc y adh en el tabaco y el arroz se ha llevado a cabo
ampliamente para dilucidar su papel en la tolerancia a la
inmersión. Arroz transgénico que sobreexpresa y subexpresa
piruvato descarboxilasa 1 (pdc1) También se ha desarrollado el
gen, que mostró una correlación positiva de las actividades de
PDC más altas con la supervivencia después de la inmersión
(Quimlo et al. 2000).
Los resultados de las modificaciones transgénicas de las rutas
biosintéticas y metabólicas en la mayoría de los casos mencionados
anteriormente indican que una mayor tolerancia al estrés y la acumulación de
solutos compatibles también pueden proteger a las plantas contra el daño
mediante la captación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y por su
acompañante. actividades similares al mantenimiento de las estructuras y
funciones de las proteínas (Hare et al. 1998;
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Bohnert y Shen 1999; McNeil y col.1999; Diamant y col.2001). Sin
embargo, se han observado efectos pleiotrópicos (por ejemplo,
necrosis y retraso del crecimiento) debido a la alteración de las vías
endógenas de los metabolismos primarios. Además, también hay
algunos informes que muestran un efecto negativo del estrés
osmótico en el potencial de rendimiento (Fukai y Cooper1995). Las
manipulaciones genéticas de solutos compatibles no siempre
conducen a una acumulación significativa del compuesto (excepto
en algunos casos de sobreproducción de prolina; Chen y Murata
2002), lo que sugiere que la función de los solutos compatibles no
se limita al ajuste osmótico y que la osmoprotección no siempre
confiere tolerancia a la sequía. Una revisión reciente (Serraj y
Sinclair2002) muestra que prácticamente ninguno de los estudios
que probaron el efecto del ajuste osmótico en el rendimiento bajo
estrés hídrico mostró algún beneficio en absoluto, ya que algunos
beneficios del ajuste osmótico podrían estar en la capacidad de las
plantas para mantener el crecimiento de las raíces bajo estrés
severo (Voetberg y Sharp1991). Otro estudio reciente con
garbanzos también ha demostrado que el ajuste osmótico no
proporcionó ningún efecto beneficioso sobre el rendimiento bajo
estrés por sequía (Turner et al.2007). Además, los resultados del
modelado de simulación también sugieren que los cambios en un
proceso metabólico dado (Passioura1977,2007), puede terminar
con pocos beneficios para el rendimiento real bajo estrés (Sinclair et
al. 2004). Para las prácticas agrícolas, la síntesis excesiva de solutos
compatibles no debe tener en cuenta los costos metabólicos
primarios y, por lo tanto, para minimizar los efectos pleiotrópicos, la
producción excesiva de solutos compatibles debe ser inducible por
estrés y / o específica de tejido (Garg et al.2002).
Genes desintoxicantes
En la mayoría de los organismos aeróbicos, existe la necesidad de
eliminar eficazmente las especies reactivas de oxígeno (ROS)
generadas como resultado de las tensiones ambientales.
Dependiendo de la naturaleza de los ROS, algunos son altamente
tóxicos y deben desintoxicarse rápidamente. Para controlar el nivel
de ROS y proteger a las células del daño oxidativo, las plantas han
desarrollado un complejo sistema de defensa antioxidante para
eliminar los ROS. Estos sistemas antioxidantes incluyen varias
enzimas y metabolitos no enzimáticos que también pueden
desempeñar un papel importante en la señalización de ROS en
plantas (Vranova et al.2002). Se han logrado una serie de mejoras
transgénicas para la tolerancia al estrés abiótico mediante la
estrategia de desintoxicación. Estos incluyen plantas transgénicas
que sobreexpresan enzimas involucradas en la protección
oxidativa, tales como glutatión peroxidasa, superóxido dismutasa,
ascorbato peroxidasas y glutatión reductasas (Zhu et al.1999; Roxas
y col.1997). Sobreexpresión de tabaco transgénicoCÉSPED en el
cloroplasto, se han generado mitocondrias y citosol (Bowler et al.
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1991; Van Camp y col.1996) y se ha demostrado que mejoran la
tolerancia al estrés oxidativo inducido por el metil viológeno
(MV) en ensayos de discos foliares. Sobreexpresión de
cloroplastoCu / Zn SOD mostró una mejora dramática en el
rendimiento fotosintético bajo condiciones de estrés por frío en
tabaco transgénico (Sen Gupta et al. 1993) y plantas de papa
(Perl et al. 1993). Sobreexpresión de plantas transgénicas de
tabacoMnSOD produjo una mayor tolerancia al estrés oxidativo
solo en presencia de otras enzimas antioxidantes y sustratos
(Slooten et al. 1995), mostrando así que el genotipo y la
composición de isoenzimas también tienen un efecto profundo
sobre la tolerancia relativa de las plantas transgénicas al estrés
abiótico (Rubio et al. 2002). Mientras que la alfalfa transgénica (
Medicago sativa)plantas cv. Sobreexpresión de RA3MnSOD en
los cloroplastos mostraron una menor lesión de la membrana
(McKersie et al. 1996), las plantas transgénicas de tabaco que
sobreproducen el gen de la alfalfa aldosa reductasa (MsALR)
mostraron concentraciones más bajas de aldehídos reactivos y
mayor tolerancia frente a agentes oxidativos y estrés por
sequía (Oberschall et al. 2000).
Proteínas abundantes en embriogénesis tardía (LEA)
Las proteínas LEA representan otra categoría de proteínas de alto
peso molecular que son abundantes durante la embriogénesis
tardía y se acumulan durante la desecación de la semilla y en
respuesta al estrés hídrico (Galau et al. 1987). Entre los varios
grupos de proteínas LEA, se prevé que las que pertenecen al grupo
3 desempeñen un papel en el secuestro de iones que se concentran
durante la deshidratación celular. Estas proteínas tienen motivos de
aminoácidos de 11 mer con la secuencia consenso TAQAAKEKAGE
repetida hasta 13 veces (Dure1993). Se predice que las proteínas
LEA del grupo 1 tienen una mayor capacidad de unión al agua,
mientras que se cree que las proteínas LEA del grupo 5 secuestran
iones durante la pérdida de agua. Sobreexpresión constitutiva del
HVA1, una proteína LEA del grupo 3 de la cebada confería tolerancia
al déficit de agua del suelo y al estrés salino en plantas de arroz
transgénicas (Xu et al.1996). Expresión constitutiva o inducida por
estrés de laHVA1 gene resultó en la mejora de las características de
crecimiento y tolerancia al estrés en términos de integridad celular
en trigo y arroz bajo condiciones de estrés hídrico y salino
(Sivamani et al. 2000; Rohilla y col.2002). Aunque, la eficiencia en el
uso del agua (WUE) reportada fue extremadamente baja en
comparación con otros datos reportados en cultivos de trigo,
plantas de arroz transgénico (TNG67) que expresan un gen de la
proteína LEA del grupo 2 del trigo (PMA80) o la proteína del trigo
LEA del grupo 1 (PMA1959). gene resultó en una mayor tolerancia a
la deshidratación y el estrés por sal (Cheng et al.2002). Además, se
ha propuesto la función de chaperona protectora de las proteínas
LEA que actúan contra el daño celular (Vincour y Altman2005), lo
que indica el papel de las proteínas LEA en anti-
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agregación de enzimas bajo estrés por desecación y
congelación (Goyal et al. 2005).
Genes transportadores
Una estrategia importante para lograr una mayor tolerancia al
estrés abiótico es ayudar a las plantas a restablecer la homeostasis
en entornos estresantes, restaurando la homeostasis iónica y
osmótica. Este ha sido y sigue siendo un enfoque importante para
mejorar la tolerancia a la sal en las plantas a través de la ingeniería
genética, donde el objetivo es lograr Na+
excreción de la raíz o su almacenamiento en la vacuola. Se han
producido varias plantas transgénicas tolerantes al estrés
abiótico aumentando los niveles celulares de proteínas (como
las proteínas antiportadoras vacuolares) que controlan las
funciones de transporte. Por ejemplo, melón transgénico
(Bordás et al.1997) y tomate (Gisbert et al. 2000) plantas que
expresan el HAL1 gen mostró un cierto nivel de tolerancia a la
sal como resultado de retener más K+ que las plantas de control
sometidas a estrés por salinidad.
Un canal de cloruro vacuolar, AtCLCd gen, que está involucrado
en la desintoxicación de cationes, y AtNHXI gen que es homólogo a
NhxI gen de la levadura se han clonado y sobreexpresado en
Arabidopsis para conferir tolerancia a la sal compartimentando Na+
iones en las vacuolas. TransgénicoArabidopsis y plantas de tomate
que sobreexpresan AtNHX1acumularon abundantes cantidades del
transportador en el tonoplasto y exhibieron una tolerancia a la sal
sustancialmente mejorada (Apse et al. 1999; Quintero y col.2000;
Zhang y Blumwald2001). Locus de Salt Overly Sensitive 1 (SOS1) en
A. thaliana,que es similar al Na de la membrana plasmática+/ H+
antiportador de bacterias y hongos, fue clonado y sobreexpresado
usando el promotor CaMV 35S. La regulación al alza deSOSI Se
encontró que el gen era consistente con su papel en Na+ tolerancia,
proporcionando una mayor fuerza motriz de protones que es
necesaria para niveles elevados de Na+/ H+ actividades antiporter
(Shi et al. 2000).
Genes multifuncionales para la biosíntesis de lípidos
Los enfoques transgénicos también tienen como objetivo mejorar la
fotosíntesis en condiciones de estrés abiótico a través de cambios en la
bioquímica de lípidos de las membranas (Grover y Minhas 2000). La
adaptación de las células vivas a temperaturas frías es una función de la
alteración en la composición de lípidos de la membrana por una mayor
insaturación de ácidos grasos. Plantas de tabaco modificadas
genéticamente que sobreexpresan cloroplasto glicerol-3-fosfato
aciltransferasa (GPAT) gen (involucrado en la desaturación de ácidos
grasos de fosfatidil glicerol) de calabaza (Cucurbita maxima) y A. thaliana
(Murata y col. 1992) mostró un aumento en el número de ácidos grasos
insaturados y una disminución correspondiente en la sensibilidad al frío.
Además,
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plantas de tabaco transgénicas con expresión silenciada de
cloroplasto X3-ácido graso desaturasa (Fad7, que sintetiza ácidos
grasos trienoicos) pudieron aclimatarse a altas temperaturas en
comparación con el tipo salvaje (Murakami et al. 2000).
Genes de proteínas de choque térmico
La respuesta al choque térmico, el aumento de la transcripción de
un conjunto de genes en respuesta al calor u otra exposición a
agentes tóxicos, es una respuesta biológica altamente conservada,
que ocurre en todos los organismos (Waters et al. 1996). La
respuesta está mediada por el factor de transcripción de choque
térmico (HSF) que está presente en una forma monomérica sin
unión al ADN en células no estresadas y se activa por estrés a una
forma trimérica que puede unirse a los promotores de genes de
choque térmico. La inducción de genes que codifican proteínas de
choque térmico (Hsps) es una de las respuestas más destacadas
observadas a nivel molecular de organismos expuestos a altas
temperaturas (Kimpel y Key1985; Lindquist1986; Vierling1991).
La ingeniería genética para aumentar la tolerancia térmica
mediante la mejora de la síntesis de proteínas de choque térmico
en plantas se ha logrado en varias especies de plantas (Malik et al.
1999; Li y col.2003; Katiyar-Agarwal y col.2003). Ha habido algunos
informes sobre correlaciones positivas entre los niveles de
proteínas de choque térmico y la tolerancia al estrés (Sun et al.2001;
Wang y col.2005). Aunque se desconoce el mecanismo preciso por
el cual estas proteínas de choque térmico confieren tolerancia al
estrés, un estudio reciente demostró que la función in vivo de la
termoprotección de pequeñas proteínas de choque térmico se
logra mediante su ensamblaje en gránulos de estrés funcional
(HSG; Miroshnichenko et al.2005).
Genes reguladores
Muchos genes que responden a múltiples tensiones como la
deshidratación y la baja temperatura a nivel transcripcional
también son inducidos por ABA (Mundy y Chua 1988), que
protege a la célula de la deshidratación (Dure et al. 1989;
Skriver y Mundy1990). Para restaurar la función celular y hacer
que las plantas sean más tolerantes al estrés, la transferencia
de un solo gen que codifica una única proteína de estrés
específica puede no ser suficiente para alcanzar los niveles de
tolerancia requeridos (Bohnert et al.1995). Para superar tales
limitaciones, mejorar la tolerancia hacia múltiples estreses por
un gen que codifica un factor de transcripción inducible por
estrés que regula varios otros genes es un enfoque
prometedor (Yamaguchi-Shinozaki et al.1994; Chinnusamy y
col.2005). Por lo tanto, una segunda categoría de genes de
preferencia reciente para la ingeniería genética de cultivos son
aquellos que activan factores de transcripción que regulan la
expresión de varios genes relacionados con el estrés abiótico.
415
Factores de transcripción
Una categoría objetivo atractiva para la manipulación y la
regulación de genes es el pequeño grupo de factores de
transcripción que se han identificado para unirse a elementos
reguladores de promotores en genes que están regulados por
estrés abiótico (Shinozaki y Yamaguchi-Shinozaki 1997; Winicov
y Bastola1997). Los factores de transcripción activan cascadas
de genes que actúan juntos para mejorar la tolerancia a
múltiples tensiones. Decenas de factores de transcripción están
involucrados en la respuesta de la planta al estrés por sequía
(Vincour y Altman2005; Bartels y Sunkar2005). La mayoría de
estos pertenecen a varias familias grandes de factores de
transcripción, como AP2 / ERF, bZIP, NAC, MYB, MYC, Cys2His2
zinc-finger y WRKY. Los miembros individuales de la misma
familia a menudo responden de manera diferente a varios
estímulos de estrés. Por otro lado, algunos genes sensibles al
estrés pueden compartir los mismos factores de transcripción,
como lo indica la superposición significativa de los perfiles de
expresión génica que se inducen en respuesta a diferentes
estreses (Seki et al.2001; Chen y Murata2002). La activación
transcripcional de genes inducidos por estrés ha sido posible
en plantas transgénicas que sobreexpresan uno o más factores
de transcripción que reconocen los elementos reguladores del
promotor de estos genes. Dos familias, bZIP y MYB, están
involucradas en la señalización de ABA y su activación genética.
Muchos genes inducibles por ABA comparten el consenso (C /
T) ACGTGGC,cis-elemento que actúa como respuesta a ABA
(ABRE) en sus regiones promotoras (Guiltinan et al. 1990;
Mundy y col.1990). La introducción de factores de transcripción
en la vía de señalización de ABA también puede ser un
mecanismo de mejora genética de la tolerancia al estrés de las
plantas. La expresión constitutiva de ABF3 o ABF4 demostró
una mayor tolerancia a la sequía enArabidopsis, con expresión
alterada de ABA / genes sensibles al estrés, p. ej. rd29B, rab18,
ABI1 y ABI2 (Kagaya y col.2002). En tales plantas se observaron
varios fenotipos asociados a ABA, como hipersensibilidad a ABA
e hipersensibilidad al azúcar. Además, se observó
hipersensibilidad a la sal en plantas que sobreexpresan ABF3 y
ABF4 en las etapas de germinación y plántula joven, lo que
indica la posible participación de ABF3 y ABF4 en respuesta a la
salinidad en estas etapas particulares de desarrollo. (Abebe et
al.2003). Transgénico Arabidopsis plantas que sobreexpresan
constitutivamente un factor de transcripción inducible por frío (
CBF1; Proteína de unión CRT / DRE) mostraron tolerancia a la
congelación sin ningún efecto negativo sobre las características
de desarrollo y crecimiento (Jaglo-Ottosen et al. 1998).
Sobreexpresión deArabidopsis CBF1 (Proteína de unión CRT /
DRE) se ha demostrado que activa cor genes homólogos a
temperaturas no aclimatadas (Jaglo et al. 2001). losCBF1ADNc
cuando se introduce en tomate (Lycopersicon esculentum) bajo
el control de un promotor CaMV 35S mejorado
123
416
tolerancia al estrés por frío, sequía y sal, pero exhibió fenotipo
enano y reducción en el número de frutos y semillas (Hsieh et
al. 2002). Otro regulador transcripcional,Alfin1,cuando se
sobreexpresa en alfalfa transgénica (Medicago sativa
L.) plantas endógenas reguladas MsPRP2 (Gen inducible por NaCl)
niveles de ARNm, lo que da como resultado una tolerancia a la
salinidad, comparable a algunas plantas tolerantes a la sal
disponibles (Winicov y Bastola 1999). Lee y col. (1995) producido
termo-toleranteArabidopsis plantas desreprimiendo la actividad de
ATHSF1,un factor de transcripción de choque térmico que conduce
a la expresión constitutiva de proteínas de choque térmico a
temperatura normal. Varios estres inducidoscor genes como rd29A,
cor15A, kin1y cor6.6 se activan en respuesta al tratamiento con frío,
ABA y estrés por déficit hídrico (Thomashow 1998). Se han realizado
numerosos esfuerzos para mejorar la tolerancia a múltiples
estreses como el frío, la sequía y el estrés salino en cultivos
distintos de las plantas modelo comoArabidopsis, tabaco y alfalfa.
Una mayor tolerancia a las heladas y la sequía enArabidopsis se
logró sobreexpresando CBF4, un homólogo cercano de CBF / DREB1
cuya expresión se induce rápidamente durante el estrés por sequía
y por el tratamiento con ABA, pero no por el frío (Haake et al. 2002).
Del mismo modo, uncis-elemento activo, elemento sensible a la
deshidratación (DRE) identificado en A. thaliana,también está
involucrado en la expresión de genes independientes de ABA en
condiciones de sequía, baja temperatura y alto estrés salino en
muchos genes sensibles a la deshidratación como rd29A que son
responsables de la deshidratación y la expresión génica inducida
por el frío (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki 1993; Iwasaki y col.
1997; Nordin y col.1991). Se han aislado varios ADNc que codifican
las proteínas de unión a DRE, DREB1A y DREB2A deA. thaliana y ha
demostrado que se une específicamente y activa la transcripción de
genes que contienen secuencias DRE (Liu et al. 1998). Se cree que
los DREB1 / CBF funcionan en la expresión génica sensible al frío,
mientras que los DREB2 están involucrados en la expresión génica
sensible a la sequía. La activación transcripcional de genes
inducidos por estrés ha sido posible en plantas transgénicas que
sobreexpresan uno o más factores de transcripción que reconocen
elementos reguladores de estos genes. EnArabidopsis, el factor de
transcripción DREB1A interactúa específicamente con el DRE e
induce la expresión de genes de tolerancia al estrés (Shinozaki y
Yamaguchi-Shinozaki 1997). El ADNc de DREB1A bajo el control del
promotor CaMV 35S en plantas transgénicas provoca una fuerte
expresión constitutiva de los genes inducibles por estrés y produce
una mayor tolerancia al estrés por congelación, salinidad y sequía
(Liu et al.1998). Se observó una fuerte tolerancia al estrés por
congelación en transgénicosArabidopsisplantas que sobreexpresan
CBF1 (DREB1B) cDNA bajo el control del promotor CaMV 35S (Jaglo-
Ottosen et al.1998). Posteriormente, la sobreexpresión deDREB1A
Se ha demostrado que mejora la tolerancia al estrés por sequía y
baja temperatura en el tabaco, el trigo y el maní (Kasuga et al. 2004;
Pellegrineschi y col.2004; Behnam y col.2006;
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Plant Cell Rep (2008) 27: 411–424
Bhatnagar-Mathur y col. 2004, 2006). El uso de stressinduciblerd29A El
promotor minimizó los efectos negativos sobre el crecimiento de las
plantas en estas especies de cultivos. Sin embargo, la sobreexpresión de
DREB2 en plantas transgénicas no mejoró la tolerancia al estrés, lo que
sugiere la participación de la activación postraduccional de las proteínas
DREB2 (Liu et al.1998). Recientemente, se demostró que una forma
activa de DREB2 transactiva los genes inducibles por estrés diana y
mejora la tolerancia a la sequía en transgénicos.Arabidopsis (Sakuma y
col. 2006). La proteína DREB2 se expresa en condiciones normales de
crecimiento y se activa mediante el estrés osmótico a través de la
modificación postraduccional en las primeras etapas de la respuesta al
estrés osmótico.
Otra expresión génica independiente de ABA, sensible al estrés y
activada por senescencia implica ERD gen, cuyo análisis del promotor
identificó además dos elementos novedosos diferentes que actúan en
cis implicados en la inducción del estrés por deshidratación y en la
senescencia inducida por la oscuridad (Simpson et al.2003). De manera
similar, las plantas transgénicas desarrolladas expresando un TF de tipo
AP2 sensible a la sequía, SHN1-3 o WXP1, indujeron varios genes
relacionados con la cera que dieron como resultado una mayor
acumulación de cera cuticular y una mayor tolerancia a la sequía
(Aharoni et al.2004; Zhang y col.2005). Por lo tanto, claramente, la
sobreexpresión de algunos factores de transcripción sensibles a la
sequía puede conducir a la expresión de genes posteriores y la mejora
de la tolerancia al estrés abiótico en las plantas (ver revisión, Zhang et al.
2004). Los genes / factores reguladores reportados hasta ahora no solo
juegan un papel significativo en el estrés por sequía y salinidad, sino
también en la tolerancia a la sumersión. Más recientemente, un gen
similar al factor de respuesta de etilenoSub1A, uno del grupo de tres
genes en el Sub1 locus se han identificado en el arroz y la
sobreexpresión de Sub1A-1 en una inmersión intolerantevariedad
confirió una mayor tolerancia a la inmersión a las plantas (Xu et al. 2006),
lo que confirma el papel de este gen en la tolerancia a la inmersión en el
arroz.
Genes de transducción de señales
Genes implicados en la detección de señales de estrés y una
cascada de señales de estrés en A. thaliana ha sido de interés de
investigación reciente (Winicov y Bastola 1997; Shinozaki y
Yamaguchi-Shinozaki1999). Los componentes de la misma vía de
transducción de señales también pueden ser compartidos por
varios factores de estrés como la sequía, la sal y el frío (Shinozaki y
Yamaguchi-Shinozaki1999). Aunque existen múltiples vías de
sistemas de transducción de señales que operan a nivel celular para
la regulación de genes, ABA es un componente conocido que actúa
en una de las vías de transducción de señales, mientras que otras
actúan independientemente de ABA. Se sabe que los genes de
respuesta temprana codifican factores de transcripción que activan
genes de respuesta retardada aguas abajo (Zhu2002). Aunque
existen ramas y componentes específicos (Lee et al.2001), las vías
de señalización para la sal, la sequía y
Plant Cell Rep (2008) 27: 411–424
Todos los estreses fríos interactúan con ABA e incluso convergen en
múltiples pasos (Xiong et al. 1999). La señalización de estrés
abiótico en plantas implica fosfo-relé acoplado al receptor, Ca
inducido por fosfoionositol2+ cambios, la cascada de proteína
quinasa activada por mitógenos (MAPK) y la activación
transcripcional de genes sensibles al estrés (Xiong y Zhu 2001).
Varios componentes de señalización están asociados con la
respuesta de la planta a las altas temperaturas, el congelamiento, la
sequía y el estrés anaeróbico (Grover et al.2001).
Uno de los méritos de la manipulación de factores de señalización es
que pueden controlar una amplia gama de eventos posteriores que
pueden resultar en una tolerancia superior para múltiples aspectos
(Umezawa et al. 2006). La alteración de estos componentes de
transducción de señales es un enfoque para reducir la sensibilidad de las
células a las condiciones de estrés, o tal que se induzca un bajo nivel de
expresión constitutiva de genes de estrés (Grover et al.1999). La
sobreexpresión de At-DBF2 funcionalmente conservado (homólogo de la
quinasa DBf2 de levadura) mostró una sorprendente tolerancia al estrés
múltiple enArabidopsis plantas (Lee et al. 1999). Pardo y col. (1998)
también logró plantas transgénicas tolerantes al estrés salino al
sobreexpresar calcineurina (un Ca2+/ Proteína fosfatasa dependiente de
calmodulina), una proteína fosfatasa que se sabe que está involucrada
en la transducción de señales de estrés salino en levaduras. Las plantas
de tabaco transgénicas producidas al alterar la señalización del estrés a
través de la reconstitución funcional de calcineurina de levadura
activada no solo abrieron nuevas rutas para el estudio de la señalización
del estrés, sino también para la ingeniería de cultivos transgénicos con
mayor tolerancia al estrés (Grover et al.1999). La sobreexpresión de una
proteína quinasa activada por estrés osmótico, SRK2C resultó en una
mayor tolerancia a la sequía en
A. thaliana, que coincidió con la regulación positiva de genes
sensibles al estrés (Umezawa et al. 2004). De manera similar, una
proteína quinasa quinasa quinasa quinasa activada por mitógenos
del tabaco (MAPKKK), NPK1, activó una cascada de señales
oxidativas que dio como resultado tolerancia al frío, el calor, la
salinidad y la sequía en plantas transgénicas (Kovtun et al.2000;
Shou y col.2004). Sin embargo, la supresión de los factores de
señalización también podría mejorar eficazmente la tolerancia al
estrés abiótico (Wang et al.2005). Esta hipótesis se basó en informes
anteriores que indicaban que las subunidades ayb de la
farnesiltransferasa ERA1 funcionan como un regulador negativo de
la señalización de ABA (Cutler et al.1996; Pei y col.1998). La
regulación a la baja antisentido condicional de las subunidades aob
de la proteína farnesiltransferasa, dio como resultado una mayor
tolerancia a la sequía deArabidopsis y plantas de canola.
Elección de promotores
Un aspecto importante de la tecnología transgénica es la expresión
regulada de transgenes. La especificidad tisular de la expresión
transgénica también es una consideración importante.
417
mientras se decide la elección del promotor para aumentar el nivel
de expresión del gen. Por lo tanto, la fuerza del promotor y la
posibilidad de utilizar promotores específicos de tejido, en etapa de
desarrollo o inducibles por estrés también han demostrado ser
críticas para adaptar la respuesta de la planta a estos estreses (Bajaj
et al.1999). Algunos productos génicos se necesitan en grandes
cantidades, como LEA3, por lo que se necesita un promotor muy
fuerte. Con otros productos génicos, como las enzimas para la
biosíntesis de poliaminas, puede ser mejor utilizar un promotor
inducible de fuerza moderada. Los promotores que se han utilizado
con mayor frecuencia en la producción de plantas tolerantes al
estrés abiótico hasta ahora incluyen los promotores CaMV 35S,
ubiquitina 1 y actina. Estos promotores, que son de naturaleza
constitutiva, expresan en general los transgenes aguas abajo en
todos los órganos y en todas las etapas. Sin embargo, la
sobreproducción constitutiva de moléculas, como la trehalosa
(Romero et al.1997) o poliaminas (Capell et al. 1998) provocan
anomalías en plantas cultivadas en condiciones normales. Además,
la producción de las moléculas descritas anteriormente puede
resultar metabólicamente cara. En estos casos, el uso de un
promotor inducible por estrés puede ser más deseable. En las
plantas, varios tipos de estrés abiótico inducen un gran número de
promotores útiles y bien caracterizados. Un promotor inducible
ideal no solo debe estar desprovisto de cualquier nivel basal de
expresión génica en ausencia de agentes inductores, sino que la
expresión debe ser reversible y dependiente de la dosis. Las
regiones reguladoras de la transcripción de los genes inducidos por
la sequía y el frío se han analizado para identificar varioscis-
actuando y trans-elementos que actúan involucrados en la
expresión génica que es inducida por el estrés abiótico (Shinwari
1999). La mayoría de los promotores de estrés contienen una serie
decis-elementos activos que son reconocidos por los factores de
transcripción requeridos; por ejemplo, la regulación transcripcional
dehsp genes está mediado por el núcleo "elemento de choque
térmico" (HSE) ubicado en la región promotora de estos genes, 5
'de la caja TATA. Toda la plantahsp Se ha demostrado que los genes
secuenciados hasta ahora contienen múltiples HSE que se
superponen parcialmente proximales al motivo TATA. A parte de
estoshsp promotores, rd29 y adh También se han estudiado los
promotores de genes inducidos por estrés osmótico y estrés
anaeróbico, respectivamente. losArabidopsis rd29A y rd29B son
genes sensibles al estrés, pero se inducen diferencialmente en
condiciones de estrés abiótico. losrd29A El promotor incluye
elementos DRE y ABRE, donde la deshidratación, la alta salinidad y
las bajas temperaturas inducen el gen, mientras que el rd29B el
promotor incluye solo ABRE y la inducción es dependiente de ABA.
Sobreexpresión de factores de transcripción DREB1A bajo el control
del promotor inducible por estrés derd29A mostraron un mejor
crecimiento fenotípico de las plantas transgénicas que las
obtenidas utilizando el promotor constitutivo CaMV 35S (Kasuga et
al. 1999). Una expresión inducible por estrés de
123
418
Arabidopsis CBF1 en tomate transgénico se logró utilizando el
promotor ABRC1 de cebada HAV22 (Lee y col. 2003). La expresión
génica es inducida por la unión de DREB1A, que en sí mismo es
inducida por el estrés por frío y agua, a uncis-elemento DRE que
actúa en los promotores de genes tales comord29A, rd17, cor6.6,
cor15A, erd10, y kin1, de este modo, se inicia la síntesis de
productos génicos que imparten tolerancia a las bajas
temperaturas y al estrés hídrico en las plantas. Las regiones de la
alcohol deshidrogenasa respiratoria.adhUn promotor genético en
el maíz y el arroz que se requiere para la inducción anaeróbica
incluye una cadena de bases llamada elemento de respuesta a la
anoxia (ARE) con la secuencia consenso de su elemento central
como TGGTTT. Además, otros sensibles al estréscis-Se han
identificado secuencias promotoras que actúan como elementos
sensibles a baja temperatura (LTRD) con una secuencia consenso de
A / GCCGAC en genes tales como Cor 6,6, Cor 15 y Cor 78Estos
hallazgos básicos sobre los promotores del estrés han llevado a un
cambio importante en el paradigma de la ingeniería genética de
cultivos tolerantes al estrés (Katiyar-Aggarwal et al. 1999).
Evaluación fisiológica del efecto del estrés
Un gran número de estudios han evaluado diferentes construcciones
transgénicas en diferentes especies de plantas y diferentes estreses
como la sequía, la salinidad y el frío. La expresión de los genes
insertados, así como los niveles alterados de metabolitos, se han
informado con gran detalle. Sin embargo, se dan menos detalles con
respecto a los métodos utilizados para evaluar la respuesta al estrés.
Aunque normalmente se informa que la construcción transgénica ha
aumentado la tolerancia a la sequía en la mayoría de los casos, se hace
referencia a ella como tal en otros artículos. Esta falta de detalles se
aplica principalmente al estrés por sequía; los protocolos utilizados para
el estrés por salinidad suelen estar mejor descritos (Tarczynsky et al.
1993; Holstrom y col.2000), aunque los niveles de estrés salino utilizados
en algunos estudios están mucho más allá de los que se encuentran en
un entorno natural. Se entiende que la mayoría de estos estudios están
destinados a evaluar la expresión génica, a menudo en plantas modelo,
bajo un estrés particular, y a menudo se utilizan situaciones extremas de
estrés para asegurar la expresión génica. Sin embargo, estos estudios
pueden generar algunas conclusiones engañosas desde una perspectiva
agronómica o fisiológica, donde la evaluación de la tolerancia al estrés
de los transgénicos debe realizarse con respecto a su interrelación con
otros genes / mecanismos relacionados con el estrés y donde los efectos
del estrés deben observarse durante períodos / condiciones más
prolongados. Esto es particularmente importante, con el fin de imitar de
cerca la vida útil de la mayoría de los cultivos bajo ciclos de estrés, en
lugar de una breve exposición a estreses muy severos. aunque estamos
de acuerdo en que las exposiciones breves al estrés son ciertamente
adecuadas si el propósito es evaluar únicamente la expresión génica.
Por lo tanto, en la siguiente discusión, nos enfocamos en los aspectos
agronómico / fisiológico
123
Plant Cell Rep (2008) 27: 411–424
perspectiva y no pretenden cuestionar la calidad del trabajo
realizado para evaluar la expresión génica. Nuestra intención es
intentar conciliar ambos enfoques (molecular y agronómico) hacia
un enfoque común: el mejoramiento.
Dos cuestiones importantes que normalmente deben abordarse en
la evaluación de la respuesta al estrés de los transgénicos incluyen: (1)
Medios de imposición de estrés, detalles sobre el estrés y las
condiciones de crecimiento (incluida la intensidad, el momento y la
rapidez de la imposición, etc.), y (2) Datos "duros" sobre la respuesta de
los materiales probados para respaldar las conclusiones (comparación
dentro de la misma especie). Además, los detalles precisos sobre los
protocolos utilizados para evaluar el rendimiento de las plantas a
cualquier estrés dado son muy esenciales para evaluar el rendimiento de
los materiales.
Medios de imposición de tensiones, condiciones de crecimiento
y evaluaciones.
Las condiciones de estrés utilizadas para evaluar el material transgénico
en la mayoría de los informes hasta ahora suelen ser demasiado graves
(Nanjo et al. 1999a; Shinwari y col.1998; Garg y col.2002) ya que es muy
poco probable que las plantas sufran tales tensiones en condiciones de
campo. Además, los medios de evaluación suelen ser significativamente
diferentes de las condiciones naturales. Por ejemplo, Pellegrineschi et al.
(2004) compararon el desempeño de los eventos iniciales del trigo
transgénico DREB1A con el progenitor silvestre al retener el agua a
plántulas de 2 semanas de edad cultivadas en 5 cm 9 Macetas de 5 cm, y
luego re-regar hasta la madurez cuando fueron evaluadas. Las plantas
no transformadas estaban casi muertas dentro de los 10 a 15 días de la
imposición de estrés, probablemente debido a un patrón diferente de
uso del agua, mientras que las plantas transgénicas sobrevivieron en
estas pequeñas macetas y "aprobaron" la evaluación con éxito;
obviamente tales condiciones no ocurrirían en el campo. Además, del
tipo de sistemas utilizados para evaluar el rendimiento de la planta,
cabría esperar que la evaluación se hiciera, al menos, sobre la base de la
biomasa acumulada durante el estrés.
Si bien el uso de PEG (polietilenglicol) en hidroponía puede ser
útil para probar cierta respuesta de plantas bajo un potencial
osmótico dado, según lo informado por Pilon-Smits et al. (1996,
1999), ofrece condiciones relativamente diferentes a las del suelo
donde el depósito de agua es por definición finito. Aquí, la
observación de un crecimiento mejorado se explicó por una mayor
absorción de agua bajo el potencial hídrico aplicado, debido a la
producción de osmolitos por la planta transgénica. Esto es bastante
posible en un sistema de este tipo porque el depósito de agua es
ilimitado en hidroponía y porque el potencial hídrico es constante.
Sin embargo, en las condiciones del suelo, el volumen de suelo que
rodea la raíz donde se puede extraer el agua es limitado, y el
potencial hídrico de ese suelo disminuye rápidamente con la
absorción de agua por las raíces, alcanzando el potencial hídrico del
suelo donde incluso el mejor
Plant Cell Rep (2008) 27: 411–424
La producción de osmolitos de los transgénicos no podría extraer
ninguna cantidad adicional significativa de agua. Una prueba más
realista de la capacidad para absorber agua utilizando transgénicos
potenciados por potencial osmótico sería comparar su capacidad para
extraer agua de un sistema de suelo en lugar de un sistema
hidropónico. Un estudio reciente de Sivamani et al. (2000) informó de un
aumento de WUE en el trigo transgénico. Desafortunadamente, no hubo
control sobre la evaporación del suelo, lo que probablemente explica la
mayor parte de la pérdida de agua y explica los valores muy bajos de
WUE observados. Además, investigar las respuestas a la sequía
mediante el uso de peso fresco (Sun et al.2001) y otras estimaciones
indirectas de rendimiento como tasa de crecimiento, alargamiento del
tallo (Pilon-Smits et al. 1995; Lee y col.2003) o supervivencia (Pardo et al.
1998) es probable que den resultados inconsistentes. Al aplicar un estrés
por sequía, es importante conocer las etapas del estrés por sequía a las
que están expuestas las plantas, para lo cual se necesita una descripción
detallada de las condiciones de crecimiento, el tamaño de la planta, el
tamaño del recipiente, la disponibilidad de agua y la transpiración.
También es crucial informar el peso seco de las plantas analizadas,
posiblemente antes y después del período de estrés.
De manera similar, a menudo el estrés impuesto se ha modificado de
2 días a 2 semanas e incluso 4 semanas utilizando las mismas
condiciones experimentales (Lee et al. 2003), sin indicar la capacidad de
retención de agua de la mezcla para macetas utilizada, así como la
densidad de la planta. Esto obviamente conduce a diferentes tipos de
estrés, donde las plantas expuestas durante 2 días de estrés hídrico
pueden haber permanecido en la etapa I cuando el agua es abundante
(ver más abajo), mientras que las plantas expuestas a 4 semanas de
estrés pueden haber pasado la mayor parte del tiempo bajo etapa III
donde las raíces pueden haber agotado toda el agua disponible.
También hay casos en los que se aplica una determinada cantidad de
agua a las plantas en días alternos de 2 a 10 semanas (Sivamani et al.
2000), por lo tanto, sin tener en cuenta el hecho de que las necesidades
de agua aumentan drásticamente durante el período, y probablemente
exponiendo sus plantas a una inundación inicial antes de un estrés
severo.
Protocolos adecuados para aplicar estrés por sequía y salinidad
A diferencia de lo que parece ser una práctica común en la evaluación de
transgénicos, aplicar la sequía no consiste simplemente en retener el
agua. De hecho, no podemos investigar las respuestas de las plantas a la
sequía sin comprender las diferentes fases que atraviesa una planta en
condiciones de sequía en condiciones naturales. Estos pasos se han
descrito anteriormente (Ritchiemil novecientos ochenta y dos; Sinclair y
Ludlow1986). En la fase I, el agua es abundante y la planta puede
absorber toda el agua requerida por la transpiración y los estomas están
completamente abiertos. Durante esa etapa, la pérdida de agua está
determinada principalmente por las condiciones ambientales a las que
están expuestas las hojas. Durante la etapa II, las raíces ya no pueden
suministrar suficiente agua al
419
el brote y los estomas se cierran progresivamente para ajustar la pérdida de agua al suministro de agua, de modo que se
mantenga la turgencia de las hojas. En la etapa III, las raíces han agotado toda el agua disponible para la transpiración. Los
estomas se cierran y prácticamente todos los procesos fisiológicos que contribuyen al crecimiento, incluida la fotosíntesis, se
inhiben. Esto se ha utilizado para diseñar experimentos de secado donde la respuesta de las plantas a la sequía se toma como
una función de la fracción de humedad del suelo disponible para plantar (fracción de agua transpirable del suelo, FTSW), y no
como una función del número de días. después de lo cual se ha impuesto el estrés. El primero permite una comparación
precisa del estrés impuesto a través de experimentos y condiciones ambientales, mientras que se refiere a la intensidad del
estrés en el número de días de exposición al estrés, sin hacer referencia al tamaño de la maceta, la demanda evaporativa, etc.,
pueden dar lugar a datos erráticos e irreproducibles. Con base en los valores de transpiración, es posible compensar
parcialmente la pérdida de agua para aplicar una condición de estrés más suave, lo que permite que plantas de diferentes
tamaños estén expuestas a un estrés por sequía similar. Por ejemplo, las plantas expuestas al estrés hídrico pueden perder un
máximo de 70 g por día. Cualquier pérdida de agua que supere este valor se vuelve a agregar en función de la planta. Esto
permite mantener el contenido volumétrico de humedad del suelo, un proxy del estrés hídrico, similar en todas las macetas. La
cantidad de agua que se pierde al día se puede adaptar para aumentar / disminuir el nivel de estrés. Este protocolo tiene la
ventaja de imitar la situación que enfrentaría una planta en el campo, es decir, un secado progresivo del suelo. Este método se
ha utilizado con éxito en ICRISAT para evaluar la respuesta de 14 eventos transgénicos de maní (Fig. puede dar lugar a datos
erráticos e irreproducibles. Con base en los valores de transpiración, es posible compensar parcialmente la pérdida de agua
para aplicar una condición de estrés más suave, lo que permite que plantas de diferentes tamaños estén expuestas a un estrés
por sequía similar. Por ejemplo, las plantas expuestas al estrés hídrico pueden perder un máximo de 70 g por día. Cualquier
pérdida de agua que supere este valor se vuelve a agregar en función de la planta. Esto permite mantener el contenido
volumétrico de humedad del suelo, un proxy del estrés hídrico, similar en todas las macetas. La cantidad de agua que se pierde
al día se puede adaptar para aumentar / disminuir el nivel de estrés. Este protocolo tiene la ventaja de imitar la situación que
enfrentaría una planta en el campo, es decir, un secado progresivo del suelo. Este método se ha utilizado con éxito en ICRISAT
para evaluar la respuesta de 14 eventos transgénicos de maní (Fig. puede dar lugar a datos erráticos e irreproducibles. Con
base en los valores de transpiración, es posible compensar parcialmente la pérdida de agua para aplicar una condición de
estrés más suave, lo que permite que plantas de diferentes tamaños estén expuestas a un estrés por sequía similar. Por
ejemplo, las plantas expuestas al estrés hídrico pueden perder un máximo de 70 g por día. Cualquier pérdida de agua que
supere este valor se vuelve a agregar en función de la planta. Esto permite mantener el contenido volumétrico de humedad del
suelo, un proxy del estrés hídrico, similar en todas las macetas. La cantidad de agua que se pierde al día se puede adaptar para
aumentar / disminuir el nivel de estrés. Este protocolo tiene la ventaja de imitar la situación que enfrentaría una planta en el campo, es decir, un secado pr
Figura 1 Curva de respuesta típica del cultivar de maní JL 24 a la condición de secado
del suelo. Esto se utiliza para diseñar experimentos de secado donde la respuesta de
las plantas a la sequía se toma como una función de la fracción de humedad del
suelo disponible para plantar (fracción de agua transpirable del suelo, FTSW), y no
como una función del número de días. después de lo cual se ha impuesto el estrés
123
420
en condiciones de invernadero contenido (Bhatnagar-Mathur et
al. 2004, 2006).
En cuanto a la salinidad, la mayoría de las evaluaciones
reportadas hasta el momento se han realizado en la etapa de
plántula (Maliro et al. 2004), aunque se ha informado que este tipo
de evaluación tiene poca correspondencia, si es que tiene alguna,
con el comportamiento posterior de las plantas bajo estrés salino
(Munns et al.2002; Vadez y col.2006). Además, las evaluaciones se
realizan a corto plazo utilizando altas concentraciones de sal; muy
por encima de los que se encuentran incluso en un entorno natural
altamente salino que obviamente magnifica el efecto de los
transgénicos diseñados para excretar sal. Por lo tanto, deben
evitarse los protocolos que utilizan concentraciones demasiado
elevadas de sal. Algunos otros temas de controversia incluyen los
tratamientos que se utilizan como estrés salino, y también la
hipótesis sobre los principales determinantes de la tolerancia al
estrés salino.
A menudo se asume que la evitación de Na+ la acumulación y
la toxicidad confieren tolerancia a la sal en las plantas. Por
tanto, la mayor parte del trabajo transgénico se ha ocupado de
genes implicados en Na+ extrusión de la raíz o
compartimentación de Na en las vacuolas. Sin embargo, las
tensiones severas (más de 200-300 mM) en hidroponía
(Behnam et al.2006; Holmstrom y col.2000; Lee y col.2003) que
es poco probable que ocurran en el entorno natural,
necesariamente destacarán aquellos transgénicos que son
capaces de excretar Na+ y capaz de mantener la homeostasis,
aunque sea por poco tiempo. Si tal estrategia es adecuada
sigue siendo una pregunta abierta. Vadez y col. (2007)
informaron que la tolerancia a la salinidad no se relacionó con
diferencias en la acumulación de Na+ en garbanzo, por lo tanto,
una estrategia de Na+ la excreción en garbanzos parecería
inadecuada y se han observado datos convergentes similares
en sorgo y mijo (datos no publicados).
Se están optimizando los procedimientos para la evaluación de la
salinidad de los cultivos para llevarlos a cabo en condiciones de suelo en
una instalación al aire libre en condiciones naturales en ICRISAT. Aquí, el
estrés salino se aplica al suelo durante las primeras etapas de la
germinación y el desarrollo de la planta mediante una aplicación
escalonada de sal (cantidad total dividida en tres aplicaciones) para
evitar un choque osmótico. Además, las plantas se mantienen cerca del
80% de la capacidad de campo hasta la madurez para evitar un posible
aumento en la concentración de sal si el agua no se repone
regularmente. La tolerancia de la planta al estrés se evalúa con base en
el rendimiento de semilla ya que no se ha observado correlación entre la
biomasa de brotes y el rendimiento de semilla bajo salinidad (Vadez et
al.2007). Es probable que la reproducción sea el proceso fisiológico clave
afectado por la salinidad. Por lo tanto, la investigación transgénica
destinada a mejorar la tolerancia a la sal probablemente debería
centrarse en aquellos procesos que parecen ser sensibles. Una
investigación exhaustiva de estos procesos solo puede ayudar a diseñar
un enfoque transgénico adecuado y enfocado.
123
Plant Cell Rep (2008) 27: 411–424
Conclusiones
Esta revisión resume los esfuerzos recientes para mejorar la
tolerancia al estrés abiótico en plantas de cultivo mediante el
empleo de algunos de los genes relacionados con el estrés y
factores de transcripción que se han clonado y caracterizado. Las
siguientes conclusiones generales surgen de esta revisión:
1. El uso de transgenes para mejorar la tolerancia de los cultivos al
estrés abiótico sigue siendo una opción atractiva.
2. Las opciones dirigidas a la regulación de múltiples genes parecen
mejores que las dirigidas a genes únicos.
3. Un tema importante a abordar es cómo se evalúa la
tolerancia al estrés abiótico específico y si la tolerancia
lograda se compara con la tolerancia existente. Se debe
evaluar adecuadamente el costo biológico de producción
de diferentes metabolitos para hacer frente al estrés y su
efecto sobre el rendimiento.
4. Se requiere un enfoque bien centrado que combine los
aspectos moleculares, fisiológicos y metabólicos de la
tolerancia al estrés abiótico para colmar las lagunas de
conocimiento entre los efectos a corto y largo plazo de los
genes y sus productos, y entre la expresión molecular o
celular de los genes y todo el fenotipo de la planta bajo
estrés.
5. La comprensión profunda de los procesos fisiológicos
subyacentes en respuesta a diferentes tensiones abióticas
puede impulsar de manera eficiente / exitosa la elección de un
promotor o factor de transcripción dado que se utilizará para
la transformación.
Expresiones de gratitud Los autores agradecen al Dr. David Hoisington sus
útiles comentarios sobre esta revisión. KKS quisiera agradecer la colaboración
indo-suiza en biotecnología que es financiada conjuntamente por el
Departamento de Biotecnología, el Gobierno de la India y la Corporación Suiza
de Desarrollo por proporcionar los fondos.
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