Recuperacion y purificacion de proteinas

Unidad Nº1: Introducción

Podemos considerar que la biotecnología representa las aplicaciones comerciales de los
descubrimientos científicos en las ciencias biológicas. ¿Qué es la biotecnología de proteínas?
“La producción comercial de una proteína específica extraída de una planta, animal o mo
y su utilización en un evento biológico definido”.

Para producir una proteína de interés comercial, se requieren analizar dos aspectos:
● Económico
● Tecnico

Para la producción de esta proteína es necesario estimar el mercado que está determinado por
la cantidad de producto que se requiere, y en la cuestión técnica hay que analizar diferentes
aspectos en cuanto a las tecnologías de producción. Elegir la fuente de proteínas, desarrollar
un procedimiento de purificación y posteriormente evaluar el control de calidad, la estabilización
del producto final y el ajuste de la potencia.

En la elección de la fuente de proteínas, hay que pensar en una fuente adecuada que produzca
la cantidad de proteína de interés requerida o necesaria. En cuanto al desarrollo del proceso de
purificación o procedimiento de purificación es necesario pensarlo tanto a nivel laboratorio
como a escala. En cuanto a la evaluación final de este producto proteico es necesario evaluar
el control de calidad, evaluar la estabilización del producto final, porque cuanto más puro o
enriquecido se encuentra puede llegar a tener problemas de estabilización, entonces es
necesario encontrar alguna fórmula estabilizada, y el ajuste de la potencia que tiene que ver a
como se va a fraccionar este producto obtenido.
Focalizando en el análisis económico, hay que ver el mercado, el tipo y la cantidad de producto
que se requiere, así como los costos de desarrollo, producción y puesta en mercado del
producto.

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Desarrollo de un producto:
Determinar el mercado, y dentro la extensión a cubrir, es decir, si es nacional, regional o
mundial, y la prevalencia que implica la cantidad de personas que van a requerir el producto.
Análisis de competencias: que competidores y productos alternativos se encuentran vigentes.
Analizar qué porción del mercado se va a abarcar, si va a ser un nicho/oportunidad, se define
anualmente. Analizar y evaluar la fuente que se requiere para producir esa determinada
cantidad de proteína que es necesario obtener.

Además hay que analizar cuál es la viabilidad comercial, que son:

● Técnicos: que tienen que ver con si hay problemas a nivel de las operaciones pero que
tiene una tendencia hacia la disminución ya que está la posibilidad de resolverlo a
futuro.
● Percepciones adversas: de las personas consumidoras, por una cuestión de que existen
otros productos biotecnológicos que han mejorado la calidad de vida y la salud de la
población.
● Productos alternativos en el mercado: pueden reemplazar o ser más eficientes, por
ejemplo péptidos sintéticos son más económicos de producir que purificar una proteína.
● Propiedades intelectuales hay que tener en cuenta las patentes y agencias regulatorias
que pueden generar monopolios.

Clasificación general en grandes grupos según la aplicación final:

● Enzimas de uso industrial: Industria de la alimentación y bebidas.
● Enzimas para procesos químicos: biocatálisis y kit de diagnóstico.
● Terapéuticos: farmacológicos.

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El proceso de purificación consiste en varias etapas que involucran diferentes operaciones

unitarias:
● Fermentación: para poder producir la proteína de interés que puede ser extracelular o
intracelular.
● Clarificación y concentración: diferentes operaciones unitarias involucradas donde se
separa a los diferentes.
● Captura: etapa posterior que separa los parecidos.
● Purificación intermedia o purificación final: donde ya se va hacia la transformación del
producto para poder obtenerlo, para luego realizar el control de calidad, la estabilización
y el ajuste de la potencia.

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Para reducir el número de etapas se debe realizar un diseño racional para acomodar entre sí
las etapas unitarias para favorecer la reducción del número de etapas.
En cuanto al diseño racional de los procesos de purificación, es interesante determinar el rango
de estabilidad porque hay diferencias entre proteínas y es importante usarlo a favor como la
estabilidad a alta o baja temperatura que tiene que ver con la preparación de la muestra; en
cuanto a reducir el volúmen de agua que es el principal contaminante es importante elegir
procesos que no la diluyen o que la concentren, por eso se evita operaciones de
acondicionamiento, aumentos de volumen, eliminación de sales, porque involucra un paso más
de purificación en todo el proceso.
En cuanto a estudiar la fermentación y purificación como un proceso integrado, es una
estrategia desarrollada por algunas empresas, donde proponen cuatro etapas del proceso de
purificación completo: La preparación de la materia prima, teniendo en cuenta después la
captura, la purificación intermedia y la purificación final para obtener el producto en la pureza
requerida disminuyendo el número de etapas.

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Otro aspecto a considerar es la proporción con respecto a las proteínas contaminantes. Es

decir, que a mayor contenido de proteínas contaminantes, más específico va a tener que ser el
método separativo y más complejo el sistema. Por lo cual puede llegar a tener un mayor grado
de purificación, teniendo una cuestión crítica a tener en cuenta, ya que menor va a ser la
recuperación del producto, el grado de pureza y los niveles de contaminante hay que
conocerlos y tener en cuenta, antes de diseñar el proceso porque no hay que purificar más de
lo necesario ya que mas paso de purificación reducen la estabilidad biológica y el rendimiento.
La cantidad total de proteínas va a establecer el número de ciclos de uso de determinada
operación.

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Unidad 2: Recuperación

La preparación de la materia prima, es una etapa importante dentro de un proceso integrado

para la recuperación de una proteína. Porque en algunos casos la producción es extracelular,
por lo cual se recupera a partir del medio, lo único que hay que hacer es la remoción celular
más algunos acondicionamientos. Si el producto queda dentro de la célula, ya sea soluble o
insoluble dentro del citoplasma, o que se encuentre en el espacio periplasmático, de alguna
manera hay que liberarlo, y es por eso que se requiere lisis celular o una lisis de la pared (en el
caso del espacio periplasmático).

En el estudio de los
sistemas de
disrupción celular, hay
que tener en cuenta la
liberación de
productos
intracelulares, y los
diferentes métodos y
principios de acción
que tienen cada uno
de ellos.

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Teniendo en cuenta que hay diferentes

tipos de células productoras, que van
a tener distintas paredes celulares,
distintas membranas, con distintas
resistencias y que también hay
distintos metabolitos de interés, por
ejemplo una proteína que tenga
diferente grado de estabilidad frente a
otras, entonces, teniendo en cuenta
esos dos factores, es necesario elegir
el método de ruptura celular más
adecuado. Convirtiendo a la
disrupción celular, en un paso clave en
la producción de productos biológicos
y es por eso que se han desarrollado
distintas técnicas eficientes y
confiables, que difieren en el principio
de acción y cada una tiene sus ventajas y desventajas, entonces ¿Cuál es el mejor método de
ruptura para liberar productos intracelulares? Va a depender de varios factores. Dentro de los
mismos, hay factores que son importantes a la hora del escalado, que van a depender del mo,
la resistencia de la pared celular y el tipo de célula, también hay un efecto a considerar sobre
los pasos posteriores de la recuperación y purificación, cuán económico es el proceso, cuál es
el potencial escalado en función de la escala que se requiere del producto que tiene que ver
con la economía del proceso, porque hay que tener en cuenta el equipamiento, el tamaño o
volumen de operación de lote que se requiere para justamente evaluar cual es el mejor método
de ruptura para ese tipo de producto y ese tipo de célula productora.

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Los objetivos de una ruptura son maximizar el rendimiento de la liberación del producto y la
velocidad, porque una vez liberado el producto este va a tener menos estabilidad en un medio
complejo y va a tender a degradarse por lo cual hay que evitar la formación de partículas
submicrónicas que pueden obstaculizar la posterior separación de líquido-sólido que se
proponga, ya sea una centrifugación o filtración, además cuanto mayor va a ser el tamaño de
los restos celulares más fácil va a ser la separación, en cuanto al producto, hay que evitar
oxidaciones, alteraciones secundarias, degradaciones proteolíticas, degradaciones térmicas,
siempre hay que tener en cuenta lo que se maximiza y lo que se evita para justamente obtener
un producto calidad.

En cuanto a los factores que afectan a la disrupción se tiene que tener en cuenta los que
afectan al microorganismos o al producto. En el caso de microorganismos: las paredes
celulares tienen que ser lo más débiles posibles para que la disrupción requiera menos energía,
es importante el medio de cultivo utilizado. Por ejemplo: en E. coli, cultivado en medio complejo
muestra mayor resistencia que las células cultivadas en medio mínimo. En cuanto al tipo celular
por ejemplo las Gram + son más resistentes que las Gram -. En cuanto al estado fisiológico las
células en estado estacionario son más difíciles de desintegrar que en fase exponencial. En
cuanto al tamaño, las células más grandes son más fáciles de romper. Los microorganismos
esféricos son más resistentes que los bacilos. Y por último, en cuanto a la velocidad específica
de crecimiento, cuanto mayor es la velocidad permite una ruptura más fácil ya que las paredes
son más débiles.
Por otro lado, en cuanto al producto hay que tener en cuenta la desnaturalización térmica, cuan
sensible es la proteína, las fuerzas de corte o shear stress, son importantes si se quisiera
purificar ácidos nucleicos (DNA en particular) pero por si solas no causan inactivación de
enzimas u otras proteínas. En general es un resultado de un cambio químico, como por
ejemplo: oxidación que ocurre cuando se produce interfaz aire-líquido por eso es muy
importante disminuir la formación de espuma. En cuanto a la localización dentro de la célula,

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las que están localizadas en el espacio, entre la pared celular y la membrana citoplasmática,
son más simples para liberar al medio intracelular (creo que quiso decir extracelular, no se
duda?) que las que están dentro de la células intracelularmente, tiene que ver porque se puede
aplicar un shock osmótico. Es importante saber la localización del producto, dentro de la célula

En cuanto al tipo
de
microorganismo,
se propone un
esquema de las
paredes celulares
que son el objetivo
blanco de la
ruptura. En este
caso se presentan
bacterias Gram
(+), Gram (-),
levaduras y
hongos
filamentosos.

En cuanto a las diferencias en la pared celular, si bien ambos tipos tienen peptidoglicanos, las
gram (-) tienen una membrana externa de lipopolisacáridos estabilizadas por Calcio.

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En el caso de las levaduras, tienen dos capas principales.

Los métodos de ruptura se clasifican en 3 categorías:

● Físicos ● Químicos ● Biológicos

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A modo de resumen se muestran los distintos métodos. Muchas veces se pueden utilizar en
conjunto y analizar si los efectos aumentan o disminuyen para determinar si se pueden
combinar.

Para saber si la eficiencia de la ruptura se puede medir directa o indirectamente. Como método
directo se puede utilizar la turbidez pero se debe tener en cuenta que los residuos celulares
dispersan la luz y se deben utilizar blancos. Por métodos indirectos se puede utilizar la

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actividad enzimática, lo interesante de esto es que nos permite tener una idea de la actividad
biológica que mantiene esta proteína y si mantiene su estabilidad.

Una vez realizado el proceso de ruptura debemos pensar que proceso es necesario para poder
remover los restos celulares y poder recuperar el producto de interés.

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Los métodos físicos se puede separar en:

- Mecánicos: siguen una cinética de primer orden. El más utilizado en la industria
biotecnológica, es el Homogeneizador de Alta Presión, seguido por el molino de bolilla y los
microfluidizadores. A escala laboratorio se utiliza la French Press y el sonicador.
- No mecánicos: se utiliza el shock osmótico, el secado y para células eucariotas el
congelamiento/descongelamiento.

El molino de bolillas permite el uso continuo.

El equipo de mesada consta de una cámara
con un eje central con paletas en formas de
anillos concéntricos. Contienen gran cantidad
de perlas de vidrios (el contenido oscila entre
el 70-90%). También cuenta con una entrada
y salida por encima para evitar el escape de
las esferas de vidrios. También cuenta con
encamisado para disipar el calor que se
genera por fricción. Requiere estandarizar
parámetros, como el tiempo de residencia y la
constante de velocidad k.

Estas ecuaciones de cinética de primer orden permiten calcular la velocidad de la ruptura para
optimizar y realizar un seguimiento de los procesos.

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En la optimización del proceso hay que lograr un valor absoluto de k más grande por lo tanto el
tiempo de residencia será más corto. Esto se logra optimizando varios factores, variando por
ejemplo:
● Velocidad de agitación: a mayor velocidad mayor es la eficiencia en la ruptura.
● Concentración de células, entre un 30-60% de sólidos en peso húmedo.
● Concentración de bolillas: a menos del 70% se reduce la eficiencia y a más de 90% se
reduce el espacio en la cámara.
● Diámetro de bolillas: se establece en función del microorganismo, experimentalmente.
● Temperatura: la temperatura es fundamental para la estabilidad del producto.
● Diseño del molino.

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La French Press se utiliza a escala laboratorio y trabajo en lote (batch) de no más de 100 ml, lo
máximo que se puede procesar, dependiendo de la cámara y el émbolo. Consiste en una
cámara que es un cilindro de acero, donde se coloca la solución congelada y por medio de un
émbolo se produce presión, tiene una válvula de salida en la parte inferior para drenar por
descompresión, es decir, de 1000 atm pasa a 0 atm, explotando al microorganismo. Además la
descompresión produce liberación de calor.

Equipamiento más frecuentemente utilizado para la gran escala en la industria biotecnológica,

permite el uso en continuo. No es recomendado para microorganismos filamentosos, ya que la
válvula de salida tiene un espacio de décimas de micrones y se pueden tapar las válvulas. Se
genera mucho calor durante el proceso de homogeneización debido a la descompresión
adiabática. Para lisado de microorganismos se utiliza por encima de 600 atm lo que implica un
aumento de 15°, por eso es importante trabajar con una muestra pre-enfriada. En cuanto a la
generación de aerosoles, que es otro problema frecuente, implica resguardar a la persona
operadora. En cuanto al desgaste de la válvula, existen distintos materiales que se pueden usar
a distintas presiones de trabajo y es necesario cada tanto hacer un recambio. En cuanto a las
condiciones de trabajo estándar, se necesita una muestra pre-enfriada y 4 pasajes a 800-1000
atm con un caudal de 22L7h.

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Sin embargo en 5-6 ciclos se observa una degradación de ácidos nucleícos, y esto puede ser
favorable para pasos posteriores de purificación por que se disminuye la viscosidad. En este
caso se podría hacer una estandarización, un ensayo en primera instancia para evaluar si se
puede incrementar el número de ciclos, ver si no hay disminución en los rendimientos, para
evitar el agregado de enzimas o aditivos que degradan ácidos nucleícos ya que el mismo
proceso puede ayudar a degradarlos, al menos los de mayor tamaño. Los parámetros a
estandarizar son experimentales, es el número de pasajes N, la presión de trabajo y el
microorganismo.

Homogeneizador en funcionamiento, tiene acoplado una serpentina para rápidamente enfriar la

suspensión, manómetro que indica la presión de trabajo que usualmente ronda entre 600-1200
atm. Este equipo puede trabajar hasta 2000 atm de presión. En este caso se hace una entrada

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a través de un embudo, otros modelos tienen una tolva de acero inoxidable y la entrada en
forma de U, es para evitar la entrada de burbujas de aire a la válvula.
El homogeneizador consta de un motor, que impulsa a través de un pistón, la suspensión hacia
la válvula, esto hace de un flujo constante independiente de contra presión que se pone a
cerrar el émbolo de la válvula, que se muestra en la etapa 1. El equipo luego sale con mayor
velocidad en la etapa 2, donde puede llegar hasta 300 m/seg. Este líquido acelerado choca
contra el anillo de alto impacto que rodea la válvula. Por último, en la etapa 3, el líquido llega al
exterior, cambiando la presión de 800-1000 atm a 1 atm en el exterior, siendo que el choque
contra el anillo de impacto y la descompresión son las dos principales causas de la ruptura
celular. La cinética sigue siendo de primer orden y la ecuación que gobierna este proceso de
ruptura, se encuentra levemente modificada a la presentada para el molino de bolillas, ya que
al ser de flujo continuo, el tiempo de residencia se reemplaza por la presión que se encuentra
elevada a un exponente que depende de la biomasa y N que es el número de pasajes a través
del equipo.

Hay diferentes tipos y modelos de válvulas. Los materiales de los cuales están hechos,
soportan distintas presiones. En la industria láctea, para homogeneizar la leche se utiliza hasta
200 bar. En cambio, para industrias con aplicaciones biotecnologicas que requieren presiones
mayores a 600 bar usan pistones ceramicos.

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La velocidad de ruptura en Homogeneizador también sigue una cinética de primer orden. Se

presenta la ecuación para describir el proceso de ruptura, para justamente seguirlo y
optimizarlo. Los factores que influyen en la ruptura celular son: el número de pasajes de la
suspensión por el homogeneizador, la presión de operación y el exponente de presión que es
función del microorganismo y del estado metabólico que se obtiene experimentalmente.

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Se muestran las diferencias obtenidas en la ruptura en cuanto a 2 pasajes y 5 pasajes por el

homogeneizador.

Los microfluidizadores funcionan por el choque de un chorro líquido de alta presión de una
suspensión sobre una placa. También trabajan con bomba de presión positiva y cambia la
cámara de ruptura. Hay tres tipos de cámara de ruptura, con agujeros pequeños por donde
salen estos chorros líquidos de alta velocidad que impactan en una placa o entre sí.

Los tres tipos dejan residuos de mayor tamaño, lo cual es más fácil para la posterior
sólido-líquido que sigue en el tren de purificación y recuperación, son eficientes a bajo
contenido de biomasa, un 2% de peso húmedo de biomasa es requerido y esto tiene una
aplicación en lo que es en fermentación continua, se puede adosar a la fermentación en
continuo, tiene también un mejor enfriamiento y permiten trabajar a bajos caudales para poder

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integrarlo con la fermentación, también pueden usarse en volúmenes pequeños y son de

tamaño compacto.

Mecanismo de ruptura como la cavitación que puede considerarse como un método físico,
ahora como está mediado por un equipamiento y sigue una cinética de primer orden
proporcional al potencial acústico del amplificador puede considerarse lo como un método
mecánico. Se utiliza solo a escala laboratorio, por su simplicidad y efectividad en pequeñas
muestras menores a 1 ml. Como otros métodos produce disipación de la energía en forma de
calor.

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En cuanto al tipo de gráfica para el seguimiento de la ruptura celular por un método mecánico,
hay una gráfica directa que no nos brinda demasiada información, pero si lo hace el gráfico
logarítmico ya que se puede obtener el parámetro K que es la velocidad de ruptura.

Dentro de los químicos, los ácidos y los agentes caotrópicos son muy poco utilizados.
El agregado de alcali para subir el pH a 10,5 o 12, 5, también puede ser utilizado para
recuperar ácidos nucleicos, además elimina microorganismos viables y en realidad se
recomienda su uso para recuperar proteasas alcalinas que sean resistentes a ese pH, pues el

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Recuperacion y purificacion de proteinas

resto de las proteínas o la mayoría de las proteínas sufren de desnaturalización o de

degradación.
En cuanto a los solventes, son de fácil escalado y económicos. Pueden realizarse en un
reactor, también se eliminan microorganismos viables e inhiben el crecimiento microbiano,
posterior, por seguridad biológica de la muestra es un factor importante. Los solventes
miscibles con agua en bajas concentraciones pueden estabilizar las proteínas, esto es algo a
favor. Y en cuanto a las desventajas, pueden producir desnaturalización proteica, liberación de
proteasas y aparte los solventes pueden ser inflamables o tóxicos y están sujetos a
regulaciones.

Un ejemplo del uso de solventes para la liberación de Beta-D-galactosidasa. Donde se somete

a la biomasa a un solvente por determinadas horas, se incuba y luego se separa. Esta biomasa
se reconstituye o se recompone en un buffer de determinada característica y luego se
determina la actividad de Beta galactosidasa y la presencia de otras proteasas para obtener el
rendimiento del proceso.

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Se han evaluado distintos solventes. Etanol, metanol, isopropanol y ter-butanol son los que
mejores rendimientos han obtenido frente a acetona, metil-etil-cetona, etc. La concentración
final de solvente fue del 80%, con un tiempo de incubación de la biomasa de 90 min, la
liberación posterior fue de 15h. Se aprovechó la posibilidad de autolisis luego de haber
sometido a las paredes celulares al solvente.

Los detergentes solubilizan membranas, permeabilizan paredes celulares, con esto se evita la
fragmentación de la pared celular y la consecuente liberación de ácidos nucleícos al medio, por
lo cual es fácil escalar. También se puede escalar con otro agente como los caotrópicos. Hay
que tener en cuenta que se está agregando un contaminante que puede producir inactivación
por formación de espuma.

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Se muestran los distintos reactivos con concentraciones y proteínas totales solubilizadas en

porcentaje que se han utilizado para solubilizar proteínas de membrana en E. coli.

En algunos casos se agregan agentes reductores o agentes redox para intervenir en los
puentes disulfuros de las paredes y membranas celulares existentes.
En el ejemplo se han probado distintos pH, molaridades y salinidades, así como también el
agregado de L-cisteína.

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El más utilizado es la lisis enzimática. En cuanto a Fagos y Virus, son más difíciles de
conseguir o no se consiguen comercialmente, además son complejos de aplicar en la industria.

El objetivo de estas enzimas, son en general las paredes celulares y los enlaces que se
establecen entre las moléculas que la componen.

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Es importante saber el detalle de la composición química. En este caso se muestra la pared de

Gram (+), en detalle el peptidoglucano, es un polímero con tres tipos de uniones glicosídicas,
glúcidos y peptídicas. Por lo cual podemos tener tres tipos de enzimas que pueden atacar esta
pared, los sitios de corte de enzimas degradativas pueden ser glucosidasas dónde apuntan a la
hidrólisis del enlace beta 1, 4, el otro puede ser la acetil muramoil L-alanina amidasa o
peptidasas.
Los tipos de enzimas que se han
estado usando a nivel industrial. La
lisozima existe a nivel comercial es
bacteriolítica, y cortan cadenas de
polisacáridos, es un tipo de glicosidasa.
Para lograr la lisis de levadura son
necesarias que estén presente la
proteasa específica y la beta 1,6
glucanasa. Muchas veces a nivel
industrial, en vez de usar estas
enzimas purificadas se usan sistemas
enzimáticos donde se encuentran
varias actividades de enzimas en
simultáneo.

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Recuperacion y purificacion de proteinas

También se puede evaluar la

utilización de distintos métodos, ya
sean físicos, químicos o biológicos,
experimentalmente si hay sinergia
entre ellos, es decir, si se potencian
los efectos en conjunto en
comparación a que si lo hicieran por
separado. En este caso, se evaluaron
los efectos del pH, la salinidad, el
agregado de un agente quelante y una
enzima sobre la lisis de un cultivo de
Pseudomonas Putidas priorizando
obtener la máxima liberación en el
menor tiempo posible. Es importante
conocer y evaluar los fundamentos y
cual es el objetivo de cada técnica de
lisis a implementar.

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