Tcnicas Bioseparation

Visin general de la
ingeniera
bioseparaciones

 Uno de los segmentos ms

importantes dentro de la biotecnologa
es bioprocesamiento que se ocupa de
la fabricacin de productos
bioqumicos, productos
biofarmacuticos, alimentos,
nutracuticos, y agroqumicos.

 Nuevos productos de origen biolgico

se han desarrollado, aprobado y
licenciado en la ltima dcada.
Esto incluye anticuerpos monoclonales
utilizados para el tratamiento del
cncer y la esclerosis mltiple, los
plsmidos para la terapia gnica,
citoquinas e interleuquinas.
Muchos de estos productos deben ser
ampliamente purificado antes de que
puedan ser utilizados para sus
aplicaciones respectivas.
3

 Ingeniera Bioseparaciones se refiere

al estudio sistemtico de los principios
cientficos y de ingeniera utilizadas
para la purificacin a gran escala de
productos biolgicos.
Se refiere especficamente a la
separacin y purificacin de un
segmento de bioprocesos que sigui
algn tipo de reaccin biolgica, por
ejemplo, la purificacin de un
antibitico siguiendo una fermentacin
microbiana.
4

 La fabricacin de varios tipos de

productos biolgicos no implica
reacciones biolgicas in vitro.
Estos productos se sintetizan in vivo
en sus respectivas fuentes naturales y
estos son simplemente recuperados
mediante tcnicas adecuadas, por
ejemplo, la fabricacin de protenas
plasmticas de la sangre, extraccin
de alcaloides de las plantas, la
extraccin de las enzimas de los
tejidos animales.
5

 Bioprocesamiento se puede clasificar en

dos categoras:
1. bioprocesamiento reactivo
2. bioprocesamiento extractivo
En bioprocesamiento reactivo, el proceso
de bioseparacin sigue alguna forma de
reaccin biolgica
Bioprocesamiento extractivo casi
completamente implica bioseparacin.

 Ejemplos de Bioseparacin reactiva incluyen, pero

no se limitan a, la recuperacin de biocombustible a
partir de caldo de fermentacin, la recuperacin
primaria de las protenas a partir de cultivos de
clulas, extracciones de dos fases acuosas y
sistemas micelares para la particin selectiva de las
protenas, y la complejacin qumica reversible para
la recuperacin de compuestos orgnicos
complejos.
Ejemplos de Bioseparacin extractiva (produccin
de etanol, produccin de acetona / butanol, etc)

Lo que se separa en bioseparacin?

Productos de origen biolgico se

pueden clasificar en diferentes
formas; una forma se basa en su
naturaleza qumica o sus aplicaciones
previstas.

10

Los productos biolgicos tambin pueden

clasificarse en funcin de sus aplicaciones
previstas (Tabla 1.2):

11

Importancia econmica de la
bioseparacin
La purificacin de productos biolgicos de su
respectivo material de partida, por ejemplo
medios de cultivo celular es tcnicamente
difcil y caro.
Con frecuencia, esto podra ser el factor
crtico que limita la comercializacin de un
producto biolgico.
En muchos casos, el precio de bioseparacin
puede ser un componente considerable del
coste total de bioprocesamiento.
12

13

Naturaleza de bioseparacin
Bioseparation se basa principalmente en los
procesos de separacin qumica.
Un exceso de tcnicas de separacin bien
establecidos se utiliza en la industria qumica.
Un nmero de estas tcnicas se han
encontrado ser adecuado para llevar a cabo
separaciones biolgicas.
Algunas sustancia de origen biolgico tales
como antibiticos y otros compuestos de bajo
peso molecular, tales como vitaminas y
aminocidos se purific utilizando tcnicas
directas de separacin tales como la
extraccin lquido-lquido, adsorcin de lecho
compacto, evaporacin y secado sin necesidad
de modificaciones que sea necesario.
14

 Tcnicas de separacin modificadas son

necesarias para la purificacin de
molculas ms complejas, tales como
protenas, lpidos, carbohidratos y cidos
nucleicos.
A menudo, tcnicas de separacin
totalmente nuevas tienen que ser
desarrolladas.
Algunas de las caractersticas de la
bioseparacin que la distinguen de la
separacin qumica son:
15

1. Los productos biolgicos estn presentes

en concentraciones muy bajas en el
material de partida del que se purifica.
Por ejemplo, los anticuerpos
monoclonales estn tpicamente
presentes en concentraciones alrededor
de 0,1 mg / ml en los sobrenadantes de
cultivo de clulas de mamferos.
Por lo tanto grandes volmenes de
corrientes de producto diluidas tienen que
ser procesados para obtener incluso
modestas cantidades de productos puros.

16

2. Varias otras sustancias que normalmente

son impurezas y, en algunos casos, los
subproductos estn presentes en el material
de partida junto con los productos diana
biolgica.
Con frecuencia, estas impurezas o
productos tienen propiedades qumicas y
fsicas similares a las del producto
solicitado.
Esto hace extremadamente difcil la
separacin.
Por lo tanto, bioseparacin tiene que ser
muy selectiva en la naturaleza.
17

3. Hay estrictos requisitos de calidad de

los productos utilizados para fines
profilcticos, diagnsticos y
teraputicos tanto en trminos de
contenido de producto activo, as
como en trminos de la ausencia de
impurezas especficas.
Productos teraputicos inyectables
deben estar libres de endotoxinas y
pirgenos.
18

4. Los productos biolgicos son susceptibles a la

desnaturalizacin y otras formas de degradacin.
Por lo tanto, las tcnicas de bioseparacin tienen
que ser "suaves" en trminos de evitar los
extremos de las condiciones fsico-qumicas tales
como el pH y la fuerza inica, las condiciones
hidrodinmicas tales como el corte alto en las
tarifas, y la exposicin al gas-lquido interfaces.
Los disolventes orgnicos que son ampliamente
utilizados en las separaciones qumicas tienen su
uso relativamente limitado en bioseparaciones a
causa de su tendencia a promover la degradacin
de muchos productos biolgicos.

19

5. Muchos productos biolgicos son

termolbiles y por lo tanto muchas
tcnicas de bioseparacin se llevan a
cabo usualmente a temperaturas
subambientales.
6. Bioseparation con frecuencia se basa
en la separacin multi-tcnica.

20

Bases de separacin en los

procesos bioseparacin
Productos biolgicos se separan en base a
uno o ms de los siguientes factores:
1. Tamao: por ejemplo, filtracin,
separacin por membrana, centrifugacin
2. Densidad: por ejemplo, centrifugacin,
sedimentacin, flotacin
3. Difusividad: por ejemplo, separacin por
membrana

21

4. Forma: por ejemplo, centrifugacin,

filtracin, sedimentacin
5. Polaridad: por ejemplo, extraccin,
cromatografa, adsorcin
6. Solubilidad: por ejemplo, extraccin,
precipitacin, cristalizacin
7. Carga electrosttica: por ejemplo,
adsorcin, separacin de membrana, la
electroforesis
8. Volatilidad: por ejemplo, destilacin,
destilacin por membrana, la
pervaporacin
22

Las formas fsicas separadas en

bioseparacin
1 Separacin Lquido-Partcula
La separacin de las clulas del medio de
cultivo celular, la separacin de las clulas
sanguneas del plasma en la fabricacin de
protenas plasmticas, y la eliminacin de las
bacterias y los virus de soluciones de
protenas.
Separacin Lquido-Partcula se puede lograr
forzando la suspensin a travs de un medio
poroso que retiene las partculas al tiempo
que permite el lquido en pasar a travs.
23

 Este principio se utiliza en la filtracin y

separacin de membrana.
Separacin Lquido-Partcula tambin se puede
conseguir sometiendo la suspensin a campos
gravitacionales naturales o artificiales inducidos .
Este principio se utiliza en procesos de separacin
tales como la sedimentacin y centrifugacin.
Si las partculas son ms ligeras que el lquido en
el que estn suspendidas, stas tienden a flotar
y, por tanto concentrarse cerca de la parte
superior del recipiente en el que se lleva a cabo la
suspensin.
Este principio se utiliza en la flotacin.
24

2 - Separacin Partcula-Partcula en
medio lquido
The fractionation of sub-cellular
organelle, the separation of plasmid
DNA from chromosomal DNA, and
the separation of mature cells from
young cells.
This type of separation can be achieved
by zonal centrifugation which involves
the introduction of the mixture at a
location within a liquid medium which is
then subjected to an artificially induced
gravitational field.
25

 As a result of this the heavier particles

would migrate faster than the lighter
particles, resulting in their separation
into distinct bands from which these
particles can be subsequently
recovered using appropriate means.
Particle-particle separation can in
theory be carried out by using a
porous medium which retains the
bigger particles but allows the smaller
particles to go through.
26

3-Particle-solute separation in liquid

medium

The separation of dissolved

antibiotics from cells and cell debris
present in fermentation broth.
The methods used for particle-solute
separation are fundamentally similar
to those used for solid-liquid
separation on account of the fact that
the solute remains dissolved in the
liquid medium.
27

4-Solute-solvent separation
The purpose of this being either the total or
partial removal of a solvent from a solute
product (e.g. protein concentration
enrichment), OR
The removal of dissolved impurities from a
liquid product, OR
The replacement of a solvent from a solution
by another (i.e. solvent exchange).
A range of options are available for solutesolvent separation the easiest of these being
evaporation and distillation.
28

 These techniques involve the application of

heat and cannot therefore be used for
separation of biological materials which
tend to be thermolabile.
Membranes which can retain dissolved
material while allowing solvents through
are widely used for this type of separation:
a reverse osmosis membrane will retain
small molecules and ions, a nanofiltration
membrane will retain larger molecules such
as vitamins, hormones and antibiotics,
while an ultrafiltration membrane will
retain macromolecules such as proteins and
nucleic acids.
29

 Another way of removing a solvent from a

solute is by reversibly binding the solute
on to a solid surface, this being referred
to as adsorption.
Once solute binding has taken place, this
separation is transformed to a particleliquid separation, i.e. the solvent is
separated from the solid-bound solute.
The bound solute is subsequently
recovered from the solid material, this
being referred to as desorption.
30

 An indirect method for solute-solvent

separation is by inducing precipitation
of the solute, thereby once again
transforming the separation to a
particle-liquid separation.

31

5- Solute-solute separation in liquid

medium
The most challenging form of separation.
An example of this is the separation of serum
albumin from other serum proteins.
Solute-solute separation can be achieved by
selective adsorption, i.e. by selectively and
reversibly binding the target solute on to a
solid material.
Solute-solute separation can also be carried
out by liquid-liquid extraction, i.e. by
contacting the solution with an immiscible
liquid in which the target solute has high
solubility.
32

 Nanofiltration, ultrafiltration and

dialysis membranes can be used for
such separations.
An indirect way of carrying out
solute-solute separation is by
precipitation, which involves the
selective precipitation of the target
solute.
33

6- Liquid-liquid separation
Liquid-liquid separation is required in the
manufacture of solvents such as acetone
and ethanol which typically have to be
separated from an aqueous medium.
If the solvent is immiscible with water,
phase separation followed by
decantation may be sufficient.
However, if the solvent is miscible with
water (as in the case of ethanol), other
separation methods have to be utilized.
34

 With temperature stable and volatile

solvents such as ethanol, distillation has
been traditionally used.
However with the advent of membrane
technology, separation processes such
as membrane distillation and
pervaporation have come into
widespread use.
Typically, the upstream side of the
membrane is at ambient pressure and
the downstream side is under vacuum to
allow the evaporation of the selective
component after infiltration through the
membrane
35

Bioseparation techniques
Table 1.4 categorizes bioseparation
techniques into two broad groups.
As previously mentioned, a
bioseparation process must combine
high selectivity (or resolution) with
high throughput (or productivity).
Hence bioseparation processes tend
to be based on multiple techniques
arranged such that both highresolution and high-throughput can
be obtained in an overall sense.

36

37

The RIPP scheme

While developing a bioseparation process
the following should be taken into
consideration:
1. The nature of starting material: e.g. a cell
suspension, a crude protein solution
2. The initial location of the target product:
e.g. intracellular, extracellular, embedded
in solid material such as inclusion bodies
3. The volume or flow-rate of the starting
material
38

4. The relative abundance of the product in

the starting material, i.e. its
concentration relative to impurities
5. The susceptibility to degradation e.g. its
pH stability, sensitivity to high shear
rates or exposure to organic solvents
6. The desired physical form of the final
product, e.g. lyophilized powder, sterile
solution, suspension
7. The quality requirements, e.g.
percentage purity, absence of endotoxins
or aggregates
8. Process costing and economics
39

 A RIPP (Recovery, Isolation,

Purification and Polishing) scheme is
commonly used in bioseparation.
This strategy involves use of low
resolution techniques (e.g.
precipitation, filtration, centrifugation,
and crystallization) first for recovery
and isolation followed by high
resolution techniques (e.g. affinity
separations, chromatography, and
electrophoresis) for purification and
polishing.
40

 The high-throughput, low-resolution

techniques are first used to
significantly reduce the volume and
overall concentration of the material
being processed.
The partially purified products are
then further processed by highresolution low-throughput techniques
to obtain pure and polished finished
products.
41

Example of bioseparation
A scheme for the bioseparation of reagent
grade monoclonal antibody from cell
culture supernatant is shown in Fig. 1.2.
Murine or mouse monoclonal antibodies
are produced by culturing hybridoma cells
in different types of bioreactors.
In recent years it has been possible to
synthesize humanized and chimaric
monoclonal antibodies by culturing
recombinant Chinese Hamster Ovarian
(CHO) cells.
42

44

 In the bioseparation scheme shown in Fig.

1.2, the key purification step involves affinity
chromatography.
Prior to affinity chromatography the cell
culture supernatant needs to be cleaned up
by membrane filtration or centrifugation so
that cells, cell debris and other particulate
matter do not clog-up the affinity column.
The nearly purified monoclonal antibody
obtained by affinity chromatography is
further purified by ion-exchange
chromatography and polished by gel-filtration
to obtain greater than 98% pure product in
the solution form.
44

Current trends in the bioseparation

The main disadvantages of using the
RIPP scheme are:
1. High capital cost
2. High operations cost
3. Lower recovery of product

45

 With the advent of membrane separation

processes and other new types of separations,
the potential exists for avoiding the
conventional RIPP scheme.
Membrane processes give high throughput and
can be fine-tuned or optimized to give very
high selectivity.
Some of these new and emerging techniques
are:
1. Membrane and monolith chromatography
2. Expanded-bed chromatography
3. High-resolution ultrafiltration
4. Hybrid bioseparations