S.E.P.

TECNOLOGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTEPEC

ESPECIALIDAD:
INGENIERIA EN BIOQUIMICA.

REPORTE DE PRACTICA:
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GLUCÓNICO POR
FERMENTACIÓN

PRESENTA:
AGUILAR LOPEZ KAREN AMERICA
CARMONA FRANCISCO YAMILETH
FLORES PALACIOS ANGEL DANIEL
GALLEGOS RAMON JESUS ASUNCON
ROJAS SÁNCHEZ MELANIE

MATERIA:
BIORREACTORES

DOCENTE:
MARTHA PATRICIA VALENCIA PÉREZ
 INTRODUCCIÓN

El ácido es un ácido polihidroxilado, obtenido mediante la oxidación del grupo

aldehído de la glucosa. Dicha oxidación es posible realizarla por medio
microbiológico utilizando para ello bacterias u hongos. La producción de Ac.
Glucónico por fermentación es un ejemplo clásico de las fermentaciones de
oxidación simples de sustrato, donde es de importancia decisiva la cantidad de
biomasa presente puesto que es directamente proporcional a la cantidad de
producto formado, así pues, uno de los problemas por resolver en la fermentación
será la producción de cantidades masivas de esporas para manejar inóculos
pesados.

La utilización de los hongos para producir glucónico fue reportada desde 1992,
para el desarrollo de la fermentación industrial se alcanzó hasta 1930- 1940
(2,3,4,5). Los géneros probados con mejores resultados han sido Aspergillus y
Penicillium (varias especies de cada uno).

La producción industrial de Ac. Glucónico se hace bajos las formas de sales de

sodio, calcio, siempre teniendo a elevar el rendimiento de glucónico. La razón de
la anterior es que al ir aumentando la concentración de sustratos aumenta también
la cantidad de glucónico producido (baja demasiado el pH) y puede inhibirse la
fermentación. Es por eso necesario capturar el glucónico (regular al pH) mediante
la adición de Na2CO3 ó CaCo3 a fin de lograr concentraciones de glucónico
mayores y disminuir el riesgo de la inhibición
Material Equipo Reactivos
- 1 Aza bacteriológica - Autoclave - A.C.M.
- 1 bureta - Bomba de aireación - Agar Dextrosa papa y Agar
- 1 espátula mediana - Estufa Dextrosa Sabouraud
- 1 matraz de 1000ml - Microscopio - Agua destilada
- 1 matraz de 250ml - Parrilla eléctrica - Carbonato de calcio
- 1 mechero bunsen - Termo agitador magnético - Cerveza Antiespumante
- Probeta 150ml, 10 ml - Fehling A y B
- 4 vasos de precipitado 250ml - Fosfato de amonio dibásico
- 5 botellas de roux Peptona

- 5 vidrios de reloj - Fosfato de potasio mono básico

- 6 cajas Petri de vidrio - Glucosa

- Agitadores magnéticos medianos - Nitrato de amonio

- Embudo de decantación - Papas (hidrolizado)

- Embudo de filtración - Safranina

- Mangueras de plástico - Sulfato de magnesio

- Baño maría heptahidratado

- Papel filtro - Verde de malaquita

- Pinza metálica - Azul de metileno al 1%

- Portaobjetos y cubreobjetos
- Soporte universal
- Varilla de vidrio
- Aro metálico mediano
- Pinza para bureta

MATERIA PRIMA: Guisado con más de una semana de descomposición

METODOLOGIA.

OBTENCIÓN DEL MICROORGANISMO DE ASPERGILLUS NIGER:

MEDIOS DE CULTIVO:

 AGAR DEXTROSA Y PAPA

1.- Se selecciona un alimento que contenga hongos (guisado con descomposición)

2.- Suspender 7.8 gramos del medio en 200 ml de agua destilada.

3.- Mezclar bien y calentar con agitación suave hasta su completa disolución y
hervir durante un minuto en el merchero.

4.- El matraz con agar se pone a esterilizar en autoclave a 121°C durante 15

minutos.

5.- Dejar enfriar, una vez estéril repartir en seis cajas Petri estériles y dejar en
reposo para que solidifique. Para después proceder a estriar con ayuda del aza
bacteriológica.

6.- Se coloca a incubar a 37°C por 72 horas

7.- Una vez que pasaron las 72 horas se observa al microscopio el hongo obtenido
e identificar si es Aspegillus niger para su posterior resiembra en una nueva caja
Petri.

 AGAR DEXTROSA SABOURAUD

1.-Suspender 13 gramos del medio en 200 ml de agua destilada.

2.- Mezclar bien y calentar con agitación suave hasta su completa disolución y
hervir durante un minuto en el merchero.

3.- El matraz con agar se pone a esterilizar en autoclave a 121°C durante 15

minutos.
4.- Dejar enfriar, una vez estéril repartir en cajas Petri estériles y dejar en reposo
para que solidifique. Para después proceder a estriar con ayuda del aza
bacteriológica.

5.- Incubar a 37°C por 72 horas.

GRAMOS POR LITRO

I. Medio para II. Medio de III. Medio de IV. Medio de
conservar la esporulación germinación fermentación
cepa
Glucosa 30 50.00 50.00 75.00
Sulfato de magnesio 0.100 00.12 0.125 0.078
heptahidratado
Nitrato de amonio 0.225 ----------------- ----------------- -----------------
Fosfato de potasio 0.120 0.144 0.15 0.125
mono básico
Fosfato de amonio ----------------- 0.56 0.40 0.194
dibásico
Peptona 0.25 0.20 0.01 -----------------
Papas (hidrolizado) 200.0 ----------------- ----------------- -----------------
Agar 20.00 1.5 ----------------- -----------------
A.C.M. ----------------- ----------------- ----------------- 25
Carbonato de calcio 4.0 ---------------- 18.75 -----------------
MILILITROS POR LITRO.
Cerveza 50.00 45.0 20.0 -----------------
Antiespumante ----------------- ----------------- ---------------- 05.00

II.PREPARACION DE ESPORAS:

Preparar medio de esporulación y envasar en 5 botellas de Roux con 200 ml por

botella. Esterilizar 20 min a 1 kg/cm2 en autoclave, a partir de cinco tubos
inclinados con medio de conservación de cepa de Aspergillus Níger ATCC-9029,
hacer una suspensión de esporas en agua con humectante (Tween 80) estéril y
reunirlos en un matraz estéril vacío. Con la suspensión inocular las botellas con
medio de esporulación y cultivar el cultivo estacionario a 29 °C durante 40hr.
III. GERMINACION DE ESPORAS.

Preparar medio de germinación y envasar 200 ml de medio en matraces

Erlenmeyer de 1000 ml. Esterilizar 20 min a kg /cm2 de las botellas de esporulación
hacer una suspensión homogénea de esporas (auxiliarse con agua y humectante,
tener cuidado de no mojar tapones), a inocular matraces de germinación.

Incubar estos a 29 °C en la maquina agitadora. Reunir los matraces germinados

en un solo matraz de 3 lts. vacío y estéril, utilizar este inoculo del fermentador.

 CARGA DEL FERMENTADOR.

Pesar los ingredientes del medio de fermentación para un volumen de 30 litros.

Cargar el fermentador con 10 lts. De agua, añadir los ingredientes de la
formulación, disolver y homogenizar y ajustar el volumen a 30 litros con agua y
montar el fermentador. Calentar a 121°C y enfriar hasta 30°C y proceder a
inocular. Tomar una muestra de 100 ml inicial.

CONDICIONES DE FERMENTACIÓN:

 AGITACIÓN 300 R.P.M.

 TEMPERATURA 30 °C

CONTROL DE FERMENTACIÓN:

Tomar muestras de 50 ml cada 2 hrs. de fermentación, con las siguientes

condiciones:

 AGITACIÓN 300 R.P.M.

 TEMPERATURA 30 °C
 AEREACIÓN 2.0 U.V.M.
DETERMINAR

A. pH
B. Determinar azúcar residual
C. Peso seco de biomasa
D. Peso húmedo de biomasa
E. Temperatura.

DETERMINACIÓN DE AZÚCAR RESIDUAL POR EL MÉTODO DE FEHLING:

Se coloca en una bureta la solución problema. En un matraz E. M. de 200 ml. se

ponen 5 ml de la solución A de Fehling y 40 ml de agua, se lleva a ebullición y se
mantiene constante durante la titulación, hasta la desaparición añadiendo tres
gotas de azul de metileno al 1% un poco antes del punto final, (rojo ladrillo).

DETERMINACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES POR EL MÉTODO DE

FEHLING

1.- En un matraz se le agregan 5 ml de los dos reactivos Fehling A y B y 50 ml de

agua destilada.

2.- Se pone a ebullición la mezcla, la cual permanece de esa manera y en

constante agitación

3.- Se coloca en la bureta la solución problema, se abre la bureta hasta que el

color de la mezcla cambie de color, antes de abrir la bureta se le añaden dos gotas
de azul de metileno, se deja caer gotas pequeñas hasta que el color cambie a un
rojo ladrillo.
EVIDENCIA FOTOGRÁFICA
MEDIO DE CULTIVO AGAR DEXTROSA PAPA
MEDIO DE CULTIVO AGAR DEXTROSA SABOURAUD

TINCION PARA HONGOS

GERMINACIÓN DE ESPORAS

CARGA Y CONTROL DEL FERMENTADOR

DETERMINACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES POR EL
MÉTODO DE FEHLING
RESULTADOS
CURVAS DE pH
Tiempo pH dia 1 pH dia 2

07:00 a. m. 6 7

09:00 a. m. 7 6

11:00 a. m. 6 6

01:00 p. m. 5 6

03:00 p. m. 6 6

05:00 p. m. 6 7

8
pH Ph dia 1 Ph dia 2

4
7:00 AM 9:00 AM 11:00 AM 1:00 PM 3:00 PM 5:00 PM
El medio tenía un pH de 7 que es neutro es la condición adecuada, eso quiere
decir que el hongo se adaptó y debido a eso podrá tener crecimiento de sus
esporas.

pH de 5,6 es un pH ácido donde el medio está tratando de adaptarse a su entorno

y este caso a un proceso de agitación con oxigenación para así poder tener un
crecimiento de esporas adecuado.

PESO SECO DE MICELIO

Tiempo Biomasa día 1 Biomasa día 2
07:00 a. m. 0.211 0.628
09:00 a. m. 0.984 0.78
11:00 a. m. 0.663 1.241
01:00 p. m. 1.621 1.865
03:00 p. m. 1.648 0.705
05:00 p. m. 0.453 0.563

BIOMASA
Biomasa dia 1 Biomasa dia 2
2
1.8
1.6
1.4
1.2
Biomasa

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
7 :0 0 AM 9 :0 0 AM 1 1 :0 0 AM 1:00 PM 3:00 PM 5:00 PM

Tiempo
Recordando que la biomasa es un parámetro fundamental en procesos de
tratamiento biológico. Para efectos de supervisión y control de estos procesos
industriales se requiere la determinación de los valores actuales de las variables
controladas en línea. Existen un gran número de técnicas de estimación, algunas
de éstas, basadas en balances de masa simples que permiten la estimación de
biomasa, o su correspondiente concentración, a partir de los valores medidos en
línea. Los observadores de estado son herramientas que permiten estimar las
variables o estados de un sistema a partir de otras variables del proceso
susceptibles de ser medidas en.

A los picos de crecimiento y reducción que son observables en el esquema

propuesto el dióxido de carbono liberado es absorbido por las esporas.

(Pendiente por terminar)

TEMPERATURA
Tiempo (Hrs) Temp dia 1 en °C Temp. dia 2 en °C
07:00 a. m. 26.6 26.8
09:00 a. m. 26.4 26.4
11:00 a. m. 27.3 27.7
01:00 p. m. 28.8 29.3
03:00 p. m. 28.5 28.7
05:00 p. m. 27.9 28.9
 Temperatura
30

29

28

27

26

25

24
7:00 AM 9:00 AM 11:00 AM 1:00 PM 3:00 PM 5:00 PM

Temp dia 1 en °C Temp. dia 2 en °C

La temperatura es un factor crítico en la fermentación, ya que influye en la

actividad y el crecimiento de bacterias. Cada especie de bacteria tiene una
temperatura optima para su crecimiento y producción de ácido.
En general, se considera que la temperatura óptima para la fermentación esta
entre 25° y 45°.
En la grafica se puede apreciar como va el el aumento de temperatura con
respecto el tiempo, lo cual es una temperatura optima para el crecimiento de
bacterias.

CONCLUSION

En la práctica realizada se evaluó la cinética de crecimiento microbiano del hongo

Aspergillus niger, utilizando como medio de fermentación el dulce de atado para la
producción del Ácido Glucónico. El método de fermentación utilizado fue por lotes
en un sistema cerrado, debido que durante su realización no se le suministró al
medio más sustrato; el sustrato del medio de cultivo es la sacarosa. Antes de ser
consumida la sacarosa por el hongo, primero la desdobla a glucosa y fructosa,
obteniendo la glucosa como sustrato principal para la obtención de la energía
necesaria para su crecimiento y formación del Ácido Glucónico. El estudio fue
mediante tres ensayos (E1, E2 y E3); realizados bajo condiciones estériles a
temperatura de 28°C; las muestras fueron extraídas cada 24 horas, obteniendo un
total de siete muestras por duplicado, el pH fue variado de 3.0 a 1.0. La cinética
para cada ensayo fue evaluada a través de los siguientes parámetros: pH, grados
°Brix, biomasa por peso seco, azúcares totales (método Fenol-Sulfúrico) y Ácido
Glucónico. El ensayo E1 se trabajó a un pH de 2.67 y una concentración de
sacarosa de 30 g/L de medio de cultivo de fermentación, se agitó y suministró
oxígeno al medio; estas dos últimas condiciones (agitación y suministro de
oxígeno) no fueron posibles llevarlas de forma simultánea; de manera que se tuvo
que intercalar cada 24 horas, el mantenimiento a la cepa del hongo Aspergillus
niger fue por 15 días en medio de cultivo de Agar Sabouraud; bajo estas
condiciones el Ácido Glucónico producido fue de 0.1844% en las primeras 48
horas, obteniéndose la máxima producción de Ácido Glucónico a las 168 horas, la
cual fue de 0.2152%. El ensayo E2 fue realizado bajo las siguientes condiciones:
concentración de sacarosa de 80 g/L, 2 x 10-3 UFC (unidades formadoras de
colonia) y el pH fue de 3.02. Antes de ser inoculado el hongo Aspergillus niger al
medio de fermentación se le dió mantenimiento en Agar Sabouraud por un mes, el
oxígeno fue suministrado durante todo el proceso de fermentación, obteniéndose
el máximo rendimiento de ácido glucónico hasta las 192 horas y fue de 0.4919%,
se obtuvo una mejor cinética y un mejor rendimiento de ácido formado para este
ensayo. El ensayo E3 la concentración de sacarosa, período de mantenimiento de
la cepa de Aspergillus niger en Agar Sabouraud y oxigenación fue igual que el
ensayo E2, el pH fue de 1.95 y 26 x 10-3 UFC. Este ensayo E3 no dió Ácido
Glucónico porque el pH es muy bajo, solo fue observado a través de su cinética,
que el Aspergillus niger pierde características porque estuvo mucho tiempo en el
medio de mantenimiento, el cual fue de un mes.