PROTOCOLO DE COMPOSTAJE

1. MATERIALES

MATERIALES
 Placas Petri
 Tubos 16 x 150mm
 Matraces de 1L
 Matraces de 2L
 Tapas para tubos de 16x150mm
 Plástico negro
 Bolsas ziplock
 Cooler
 Gel pack
 Pipetas de 10mL
 Pipetas de 1mL
 Pipetas de 0,1mL
 Propipetas
 Marcador o rotulador
 Espátulas de digralsky
 Agua destilada

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

 Agar leche
 Agar extracto de malta
 Agar almidón sales minerales
 Agar tripticasa de soya (TSA)
 Agar MacConkey
 Medio basal Salino
 Solución fisiológica
 Medio Wollum II
 Lugol
 Reactivo de Kovacs

EQUIPOS
 Potenciómetro
 Medidor de conductibilidad
 Termómetro digital
 Incubadora
 Autoclave
 Estufa
 Shaker
 Refrigeradora 4°C
 Refrigeradora -20°C
 Asperjadora manual
2. METODOS

I. MONTAJE DE PILAS

El proceso de compostaje será realizado a 525 m.s.n.m en Pichanaqui,

distrito de Chanchamayo en el departamento de Junín. Se utilizará como
sustratos a la pulpa y cascara de café, estiércol de aves, melaza y tierra
agrícola.
Se mezclaran los sustratos previamente mencionados y se montarán pilas
trapezoidales de 1 a 1.5 metro cubico de tamaño (aproximadamente
2000Kg), cubriéndolas con plástico negro a fin de conservar la temperatura
y humedad dentro de la pila.

II. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS NATIVOS

Se tomará una muestra de compost (aproximadamente 200 gramos) en una

bolsa ziplock nueva y se colocarán en un cooler con varios gel packs o hielo
seco para mantener la muestra a bajas temperaturas, se transportarán las
muestras al laboratorio lo más rápido posible.

En el laboratorio, se preparará por cada muestra unos 900mL del medio de

cultivo “Medio Basal Salino” como pre-enriquecimiento en matraces de 1L.
El medio de cultivo está compuesto de NaCl (0,15 g/L), (NH4)2SO4 (0,3g/L),
K2HPO4 (0,37g/L), KH2PO4 (0,125g/L), MgSO4.7H2O (0,075g/L) y KNO3
(0,3g/L) y agua destilada, se esterilizará los medios de cultivo preparados a
15psi de presión por 15minutos en un autoclave. El autoclave empezará a
incrementar su temperatura, cuando este a 100°C cerrar la válvula y esperar
hasta que la presión llegue a 15psi o su equivalente según el autoclave que
use. Cuando la presión este en 15psi (No permitir que la presión se
incremente), controlar un tiempo de 15 minutos. Transcurrido el tiempo,
apagar el autoclave y esperar hasta que la presión baje a 0 para abrir la
válvula y retirar el material esterilizado.

Esperar a que enfrié el medio de cultivo y adicionar 100 g de la muestra en

estudio, bajo condiciones de esterilidad (Usar un mechero de Bunsen). Se
deben colocar los medios de cultivo con las muestras en agitación en un
shaker a 120 r.p.m por 12 días.

El séptimo día, se debe tomar una alícuota de cada matraz, realizar

diluciones y sembrarla en los medios de cultivo: Agar MacConkey, Agar
tripticasa de soya, Agar extracto de malta y Agar almidón sales inorgánicas
(Ver composición en III, sección a) para el aislamiento de hongos,
actinomicetos y bacterias. Homogeneizar manualmente los matraces
 sembrados, extraer 1mL con una propipeta y pipeta de 1mL, y verterlo en
tubos que contienen 9mL de solución salina. (Ver composición en sección
III, a). Se debe realizar diluciones seriadas hasta 10-6, consiste en traspasar
1mL de la dilución anterior a la dilución posterior sucesivamente hasta llegar
a la dilución 10-6. Se extraerá 1mL de las dos últimas diluciones (10-5 y 10-
6) con una pipeta de 1mL y se verterá en una placa Petri estéril, agregar
aproximadamente 15 a 20 mL del agar temperado (temperatura aproximada
de 50°C). Homogeneizar las placas realizando movimientos en forma de 8
hasta que el agar alcance a cubrir toda la superficie de la placa. Las placas
Petri deben ser colocadas en una incubadora a 37°C por 24 horas y 28°C
por 48-96 según corresponda: Agar MacConkey (37°C), Agar tripticasa de
soya (37°C), Agar extracto de malta (28°C) y Agar almidón sales inorgánicas
(28°C).

Transcurrido el tiempo, se traspasará cada colonia diferente utilizando el asa

de siembra a un tubo con 5mL de Caldo Infusión de Cerebro Corazón (BHI),
asignándoles un código que debe ser registrado en base al origen de la
muestra y proceso de aislamiento. Colocar los caldos en una incubadora a
37°C por 24 horas. Los microorganismos aislados serán mantenidos en 5mL
de caldo BHI.

III. SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS NATIVOS

Las cepas aisladas serán evaluadas para seleccionar aquellas que

presenten capacidad amilolitica y celulolitica. Se sembraran las cepas por
estriado con el asa de siembra en agar nutritivo suplementado con almidón
al 2%. Incubando en un horno o estufa a 37°C por 24-48 horas. Transcurrido
el tiempo de incubación se le adicionará lugol sobre la placa como indicador
y se seleccionaran las cepas que presenten halos de degradación
(traslucido). La actividad amilolitica será valorada de acuerdo al diámetro del
halo de degradación de cada colonia, eligiendo aquellos que presenten un
diámetro mayor o igual a 0.5cm.

Se sembraran las cepas por estriado en el medio de cultivo Agar leche y

Wollum II para determinar la actividad proteolítica y celulolitica, el medio
Wollum II contiene celulosa como única fuente de carbono. La actividad
celulolitica y proteolítica será valorada de acuerdo al diámetro del halo de
degradación de cada colonia, eligiendo aquellos que presenten un diámetro
mayor o igual a 0.5cm.

Los microorganismos que presentaron mayor capacidad amilolitica,

proteolítica y celulolitica serán sometidos a pruebas de antagonismo para no
incluir dentro del inoculo microorganismos que se inhiban.
a. Composición de medios de cultivo (g/L):

Agar tripticasa de soya (TSA):

 Tripteina: 15
 Peptona de soya: 5
 Cloruro de sodio: 5
 Agar bacteriológico: 15
 pH final: 7.3 ± 0,2

Agar MacConkey:

 Peptona pancreática de gelatina: 17,0 g

 Triptona: 1,5 g
 Peptona de carne: 1,5 g
 Lactosa: 10,0 g
 Sales biliares: 1,5 g
 Cloruro sódico: 5,0 g
 Rojo neutro: 30,0 mg
 Cristal violeta: 1,0 mg
 Agar bacteriológico: 13,5 g
 pH final: 7,1 ± 0,2

Agar almidón sales inorgánicas:

 Almidón soluble: 10 g
 (NH4)2SO4: 2 g
 K2HPO4: 1 g
 MgSO4 x 7 H2O: 1g
 NaCl: 1g
 CaCO3: 2g
 Solución de elementos traza: 1 ml
 Agar bacteriológico: 15 g
 pH final: 7.2.

Solución de elementos traza: FeSO4 x 7 H2O (0.1 g),

MnCl2 x 4 H2O (0.1 g), ZnSO4 x 7 H2O (0.1 g).

Agar extracto de malta:

 Extracto de malta 30 g
 Peptona de Soja 3 g
 Agar bacteriológico 15 g
 pH final: 5,4 ± 0,2 (Ajustarlo con ácido láctico)

Agar leche:
  Caseína hidrolizada: 5g
 Extracto de levadura: 2.5g
 D-glucosa: 1g
 Leche desnatada en polvo: 1g
 Agar bacteriológico: 1.5 g
 pH final: 7,2 ± 0,2

Solución fisiológica:

 NaCl: 0.85g
 pH final: 7.0

IV. FORMULACIÓN DE INOCULOS

Cada uno de los microorganismos a utilizar en el inoculo deben hacerse

crecer en un medio de cultivo sólido. Las bacterias y hongos se deben
sembrar por diseminación.

En primer lugar, se debe verter 1mL de un cultivo de 24horas del

microorganismo sobre una placa Petri con agar tripticasa de soya (TSA),
agar almidón sales inorgánicas y agar extracto de malta para bacterias,
actinomicetos y hongos respectivamente. Después se esparcirá el mililitro
por toda la placa Petri utilizando una espátula de digralsky. Incubar en una
estufa u horno a 37°C por 24 horas y 28°C por 10 días para bacterias y
actinomicetos/ hongos respectivamente.

Transcurrido el tiempo, se debe realizar un lavado superficial de la placa con

solución fisiológica (Ver composición en Sección III, a) estéril para recuperar
las células. Se debe obtener una solución fisiológica con células hasta tener
un 0.5 en la escala de McFarland (1x 10^7UFC/mL). Se recomienda usar un
estándar comercial para realizar la comparación.

Finalmente se debe realizar un recuento de microorganismos en placa para

corrobar la concentración del inoculo. Consiste en realizar diluciones de 1mL
de la suspensión en 9mL de solución salina hasta 10-7 y verter 100uL de las
dos últimas diluciones en placas Petri con TSA, agar almidón sales
inorgánicas y agar extracto de malta. Incubar a las condiciones previamente
mencionadas y realizar el recuento de colonias. Calcular el número de
UFC/mL en base a la siguiente formula:

𝑈𝐹𝐶 𝑁𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑥 𝐼𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

=
𝑚𝐿 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑖𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑜 (𝑚𝐿)
 Todas las suspensiones de microorganismos en 1X107 UFC/mL deben ser
mezcladas equitativamente en un solo recipiente y utilizado como inoculo.

V. INOCULACIÓN DE PILAS

El inoculo microbiano se aplicara por aspersión. Se usara una regadera

asperjadora manual de una boquilla de 2mL para esparcir el inoculo sobre
las pilas, a razón de 2 litros por metro cubico de materia orgánica. La
aplicación se efectuará por única vez al comienzo del proceso. Al finalizar el
proceso de inoculación se tomaran dos muestras de cada una de las pilas
para su posterior análisis fisicoquímico y microbiológico, asimismo se medirá
la temperatura, pH y humedad. Finalmente, se debe tapar cada una de las
pilas con plástico negro.

Se puede utilizar tres pilas sin inoculo como grupo control, con el propósito
de comparar los resultados obtenidos con el proceso de compostaje
inoculado con microorganismos.

VI. DETERMINACIÓN DE TEMPERATURA Y pH

La medición de temperatura y pH debe ser realizada una vez por semana

durante todo el proceso de compostaje. Cada medición debe ser realizada
tres veces y el resultado final se obtendrá del promedio de los tres valores
obtenidos.

A. TEMPERATURA: La determinación de la temperatura consiste en

destapar las pilas e introducir un termómetro digital y registrar la
temperatura. Tapar las pilas con plástico negro al terminar las
mediciones.

B. PH: La determinación del pH consiste en tomar muestras de 10

gramos de compost utilizando bolsas ziplock. En el laboratorio, se
realizará una dilución de 1gramo en 5mL de agua destilada, se
homogeneizara y se medirá el pH utilizando un pHmetro o
potenciómetro. En caso de ausencia de potenciómetro o pHmetro, se
pueden utilizar tiras de pH, que determinaran la acidez o basicidad al
compararlo con el patrón. Tapar las pilas con plástico negro al
terminar las mediciones.

VII. CONTROL DE HUMEDAD Y AIREACIÓN

 C. AIREACIÓN: La aireación manual de las pilas será realizada una vez
a la semana después de la medición de temperatura y pH. Se
airearan las pilas al voltearlas, mezclar cada una y volver a
rehacerlas y taparlas. La aireación se debe realizar durante todo el
tiempo de compostaje.

D. HUMEDAD: El porcentaje de humedad será determinado por análisis

en el laboratorio, para el cual se requiere tomar una muestra de 15
gramos de compost una vez por semana y transportarla al laboratorio
(El análisis de humedad esta detallado en la sección VII, A). Es
necesario mantener la humedad entre 50-60%, cuando el porcentaje
sea menor, se deberá añadir agua después de medir la temperatura
y airear la pila.

VIII. DETERMINACIÓN DE PARAMETROS FISICOQUIMICOS

Se tomarán muestras de aproximadamente 500g de las pilas a los 0,30 y 90

días. Las muestras serán colectadas en bolsas ziplock y rotuladas con los
datos de la pila de origen, después se transportaran al laboratorio
inmediatamente. En caso los análisis no se realicen el mismo día, debe ser
almacenado en una refrigeradora a 4°C. La medición de cada parámetro
fisicoquímico se realizara por triplicado.

A. Humedad: El porcentaje de humedad se determinará por diferencia

de pesos, inicialmente se pesará 10 gramos de compost en una
balanza y después se colocara en una estufa u horno a una
temperatura de 105°C por 24 horas. Terminado el tiempo de
exposición, se volverá a pesar en la balanza. Todos los datos deben
ser debidamente registrados.

B. Conductibilidad eléctrica: Se realizará una dilución de 1gramo de

compost en 5mL de agua destilada, se homogeneizara y se medirá
la conductibilidad eléctrica utilizando un medidor de conductibilidad.

IX. DETERMINACIÓN MICROORGANISMOS PATOGENOS

Se realizará un control de calidad al producto final del compostaje, incluye el

recuento de coliformes totales y Escherichia coli. El recuento de coliformes
totales y Escherichia coli se realizará en el caldo fluorogenico LMX, el cual
posee una mayor sensibilidad a menor tiempo.
Se preparará el medio de cultivo, se dispensará 10mL en tubos y esterilizara
en el autoclave a 15psi por 15minutos a 121°C. Se realizará diluciones
sucesivas de hasta 10-3 a partir de 1 gramo de compost.
Después se colocará 1mL de cada dilución en un tubo con medio de cultivo
LMX. Cada dilución debe ser por triplicado. Se incubará aeróbicamente a 36
± 1.0°C por 18-24 horas.

La presencia de coliformes totales y E.coli se evidenciará por un cambio de

color a azul verdoso, adicionalmente se confirmará la presencia de E.coli al
adicionar dos gotas del reactivo de Kovacs para la reacción de indol,
formándose un anillo rojizo si presenta E.coli. La enumeración se realizará
al contabilizar el número de tubos positivos, comparándolo con tablas
estándares de NMP y aplicando la siguiente formula: