Microscopía Clínica:

Aspectos fundamentales
TM. Alfonso H. Hernández Monsalves, PhD
Microscopía óptica

Hacer pasar luz visible de una fuente a través

de lentes ópticos simples o múltiples, para
lograr una vista ampliada de una muestra
Conceptos Clave

Magnificación Definición Resolución

Relación entre el diámetro Distancia mínima a la cual el

aparente de la imagen y el Nitidez de las imágenes equipo puede mostrar dos
diámetro o longitud del objeto obtenidas puntos como entidades
separadas

Depende de la calidad y Depende de la longitud de

Depende del aumento de corrección de aberraciones onda de la luz y la apertura
objetivos y oculares de los lentes. numérica de la lente.
Conceptos Clave

Punto Focal Distancia Focal

Conceptos Clave

Aberraciones

Esférica

Astigmatismo
F1 F3
F2
Geométricas Coma

Distorsión

Curvatura de campo
Casusas
• Daños en el objetivo, grasa de los dedos y restos de aceite de
inmersión en la lente frontal del objetivo.
De posición • Cubreobjetos de espesor o índice de refracción inadecuado.
• Longitud de tubo incorrecta.
Cromáticas
• Medio de montaje inadecuado.
De magnitud • Espesor excesivo de la muestra.
Conceptos Clave

Aberraciones

Esférica

Astigmatismo

Geométricas Coma

Distorsión

Curvatura de campo

De posición
Cromáticas
De magnitud
Conceptos Clave

Aberraciones

Esférica

Astigmatismo

Geométricas Coma

Distorsión

Curvatura de campo

Cromáticas
Conceptos Clave

Aberraciones

Esférica

Astigmatismo

Geométricas Coma Sin distorsión

Distorsión

Curvatura de campo

Corsé, cojín Mostacho o

Barril o alfiletero compleja
Cromáticas
Se produce en lentes que utilizan diafragma
Conceptos Clave

Aberraciones

Esférica F2

Astigmatismo F1

Geométricas Coma

Distorsión

Curvatura de campo

Cromáticas
Conceptos Clave

Aberraciones
De posición
Esférica

Astigmatismo

Geométricas Coma

Distorsión
¿Cómo corregir?
Curvatura de campo De magnitud • Utilizar una fuente de luz
monocromática.
• Introducir un sistema de filtros que
solo dejen pasar unas pocas
longitudes de onda.
• Sustituir la lente simple por un
doblete de lentes combinando
Cromáticas distintos tipos con los índices de
refracción y dispersión adecuados.
Microscopio Óptico

Partes Ópticas Partes Mecánicas

1. Ocular (lente ocular)

2. Revólver
3. Lentes de objetivo.
4. Perilla de enfoque de Ajuste grueso.
5. Perilla de enfoque de Ajuste fino.
6. Platina.
7. Fuente de luz (lámpara)
8. Lente y diafragma del condensador.
9. Platina mecánica.
Microscopio Óptico
Microscopio Óptico Invertido
Objetivos

• Sistemas de lentes de aumento

• Cilindro que contiene una o más
lentes de vidrio, cuya función es
captar la luz procedente de la muestra
• En su configuración más sencilla, es
una sola lente de aumento de gran
potencia, con una distancia focal muy
corta.
• Esto obliga a situarlo muy cerca de la
muestra examinada, de modo que la
luz recibida se enfoca dentro del tubo
del microscopio.
Características de un objetivo

10x 40x 100x

Multiplicar por aumento de

Número de aumento ocular (10x)
(4x – 250x)

Apertura numérica

Clasificación Objetivos

Según medio refractivo

Secos
• Se utilizan directamente, de forma que lo único que se interpone
entre el objetivo y el espécimen es el aire.

De inmersión
• Necesitan un líquido entre el objetivo y el espécimen. Se utilizan
diversos aceites, de los que el más empleado es el aceite de cedro,
que posee un índice de refracción igual al del cristal.
Clasificación Objetivos
Clasificación Objetivos

Según corrección de aberraciones

Acromáticos
• Utilizan lentes que eliminan la aberración
cromática. Esta distorsión se debe a que la luz
blanca es separada por las lentes en sus
componentes, por lo que el contorno de las
imágenes da unas franjas coloreadas.

Apocromáticos
• Usan lentes que eliminan la aberración esférica.
Esta se produce por ser la refracción de la luz
mayor en los bordes de la lente que en el centro, lo
que distorsiona la imagen.
Descripción del Objetivo
Tubo
Condensador

Recoge la luz y la concentra en un cono de luz

que ilumina la muestra con una intensidad
uniforme en todo el campo de visión

TIPOS
Iluminación Köhler
Platina
Macro y micrometrico
Tipos de microscopía
Tipos de Microscopía

Óptica
MICROSCOPÍA Electrónica

De Sonda de Barrido
Campo Claro Transmisión
Contraste de Fase

Campo Oscuro Barrido

Confocal De rayos X

De fluorescencia
Microscopio de contraste de fases

Permite observar muestras vivas sin

necesidad de usar técnicas de tinción Microscopía
convencional

Cambio de fase Cambio de amplitud

Microscopía de
contraste de
fases
Diferencia de fase entre dos ondas
Microscopio de contraste de fases
Microscopía de campo oscuro
Microscopía de campo oscuro
Microscopía de fluorescencia
Microscopía de fluorescencia
Microscopía Confocal (LCSM)

Utiliza como fuente de luz un láser para controlar la

profundidad de campo y un “pinhole” (colimador de
orificio delimitante) para eliminar la luz desenfocada,
lo que permite la visualización de la imagen en un
plano horizontal simple.
Microscopía Confocal
Cuidados del Microscopio
Cuidados del Microscopio

Cuidar de:
• Agua y humedad ambiental
• Grasa procedente de los dedos o del
propio equipo
• Restos de medios de inmersión, medios de
montaje y medios de cultivo
• Ambientes químicamente agresivos
• Sol directo y fuentes de calor
• Polvo
Cuidados del Microscopio

Efecto del polvo

 Cuidados del Microscopio

• Mantenimiento, limpieza y conservación

– Trabajar sobre una superficie estable, limpia y
con buena iluminación.
– Cuando se retira cualquier elemento óptico o
mecánico que deje abierto el camino óptico,
es imprescindible cegar inmediatamente el
hueco que queda libre.
– Cuando se desmonta un objetivo, mientras
una mano lo desenrosca la otra lo sujeta.
– No desarmar los elementos ópticos (ocular,
objetivo, condensador) si no es
absolutamente imprescindible
– En ningún caso tocar el interior de los
caminos ópticos con los dedos

Imágenes: Initiative for Medical Equipment Sustainability. Microscope cleaning and maintenance (Youtube) https://www.youtube.com/watch?v=D_KNey_rMkg
Cuidados del Microscopio

• Mantenimiento, limpieza y conservación

– Limpiar inmediatamente Los objetivos de inmersión al finalizar el trabajo de observación
– Solución de limpieza: Etanol – Éter (1:1)

Lentes cóncavas

Lentes convexas
Cuidados del Microscopio

Efecto del aceite residual

Cuidados del Microscopio

• Mantenimiento, limpieza y
conservación
– Siempre que no se esté utilizando el
microscopio, debe estar completamente
tapado por medio de una funda.
– Retirar el polvo de las ranuras de
ventilación. Soplando con una pera de
goma, aire a presión y ayudándose de un
pincel limpio, seco y libre de grasa.
– Al limpiar fuente de iluminación, primero
dejar enfriar. Usar guantes de algodón y
limpiar con etanol. Para suciedad
carbonizada, usar amoníaco
 Cuidados del Microscopio

• Al terminar el trabajo, dejar

microscopio en posición de
“descanso”
– Disminuir intensidad lumínica al mínimo.
– Apagar lámpara.
– Retirar portaobjetos.
– Limpiar objetivos de inmersión.
– Limpiar restos de muestras o suciedad.
– Platina abajo.
– Condensador arriba.
– Revolver con objetivo de menor aumento
apuntando a la platina.
Imágenes: Biología Aplicada. El Sistema Mecánico del Microscopio Compuesto. (Youtube) https://www.youtube.com/watch?v=LM37nYBthSg