Microscopía Óptica y M

Electrónica

Prof. María Cruz

Dpto. Morfología Humana
Célula animal: 10-20 µm
 MICROSCOPIA

S. XVII-
Leeuwenhoek
- Observó microorganismos en gota de agua
- Eritrocitos en sangre

Robert Hooke
1665

Zacarías Janssen. Microscopio compuesto.

200 años

Siglo XIX: inicios

Schleiden (1838) Schwann (1839)

Las células son las unidades estructurales

de los seres vivo
Los tejidos vegetales y animales son agregados celulares
(1838 Teoría celular)
 m
MICROSCOPIA
SIGLO XIX ( fines)
Desarrollo de técnicas y colorantes Microscopio electrónico
Células. Diminuta
incoloras
Translúcidas

Microscopia depende de:

- Preparación de la muestra
- Rendimiento del microscopio
- Ondas de luz

Muestras deben ser

 Fijadas
 Seccionadas en cortes
finos
 Colocadas en lamina
 Teñidas

Observar
Las ondas están en Las ondas desfasadas
fase y se refuerzan , interfieren una con otra parcial
generando aumento en o totalmente cambian la
la luminosidad relación de la fase de onda
luminosas efectos de
interferencia oscuro
 Resolución del ojo en comparación con la de los microscopio

Distancia entre los puntos que se

resuelven
OJO 0,2 mm

Microscopio óptico de campo claro 0,2 µm

Microscopio Electrónico de barrido 2,5 nm
Microscopio electrónico de transición
En teoría 0,05 nm
En práctica 1,0 nm
 MICROSCOPIO ÓPTICO
Micros= pequeño scopein: ver

PROPIEDADES Aumento
Poder de resolución
Campo
Profundidad de foco
Contraste
Distancia focal
Distancia frontal
 AUMENTO
•Es la relación que existe entre el
tamaño real del objeto observado
y el apreciado al microscopio:
•Calculo:
–Aumento del objetivo x aumento del ocular

100X x 10X

• MO  magnificación de hasta 1000 veces

(1000X)
• ME aumentos mas de 100000 veces (100
000X)
–
 PODER DE RESOLUCIÓN (R)
 Es la capacidad de distinguir como imágenes
diferentes dos puntos cercanos
 la distancia mínima entre dos puntos próximos puedan verse
separados
 Determinado por:
 Longitud de onda: λ (para la luz blanca es 0,53 µm)
 Apertura numérica o poder de captación de la luz de los
lentes del microscopio
0, 61 x λ 0.61 x 0,5
 R= ------------------ R = -------------------- = 0, 22 µm
AN 1 x 1.5
>AN  >poder de resolución
 < λ > poder de resolución
 Aceite de cedro  > poder de resolución
 Constante de proporcionalidad
• Constante de proporcionalidad está
relacionada con el grado de superposición de
dos puntos para que ser resueltos por el ojo
humano.

• Esta constante es 0,61

 Longitud de onda de la luz
• Longitud de onda de la luz visible y es de 0,4 –
0,7µm y se calcula en 0,5 para el MO
 Apertura numérica
• Puede definirse como el tamaño del cono de luz
que entra en la lente del microscopio después
de pasar a través de la muestra
AN= n Sen θ donde:
 n= índice de refracción del medio a través
del cual la luz viaja entre la muestra y la lente.
θ = Angulo correspondiente a la mitad de la
anchura del cono de luz recogido por la lente.
Valor máximo es 90º sen θ = 1
 Apertura numérica

Índice de refracción:
Angulo de apertura: θ
Capacidad de objetivo de captar los rayos
luminosos refractados cuando éstos
atraviesan un medio transparente. Cuanto
mayor sea este ángulo, la lente frontal del
objetivo aceptará una mayor cantidad de ellos.

Velocidad de la luz en el aire

IR=
Velocidad de la luz en el medio

IR de: Agua = 1.3300

Aceite de inmersión = 1.5150
Fluorita = 1.4340
Vidrio (crown) = 1.5200
Aire= 1
AN
Para lentes secos: < 1
Para lentes de inmersión = 1.4
Calcular el poder de resolución de los diferentes
objetivos del microscopio óptico:
Objetivo: 10X

R=
Objetivo: 40X
R=
Objetivo: 100X

R=
 OTRAS PROPIEDADES
• PODER DE DEFINICIÓN
– Capacidad del objetivo para formar imágenes
claras de contornos nítidas
– Depende de la calidad y de la corrección de las
aberraciones de las lentes

• PROFUNDIDAD DE FOCO
– Es la propiedad del objetivo de permitir varios
planos del preparado en una misma posición de
enfoque
• CONTRASTE: Es la
diferencia en la absorción
de luz entre el objeto y el
medio que lo rodea

• CAMPO MICROSCOPICO:
plano visible a través del
microscopio
• DISTANCIA FOCAL: es la
distancia que existe
entre el foco y el plano
de la lente
• DISTANCIA FRONTAL: es
la distancia existente
entre el lente frontal del
objetivo y el preparado
enfocado cubierto con
una lámina cubre objeto
de 0,17 – 0,16 mm de
espesor
 MICROSCOPIO ÓPTICO
SISTEMAS S. SOPORTE
S. DE AUMENTOS
S. DE ILUMINACION
S. DE AJUSTE
 SISTEMA SOPORTE
Tubo
160mm
Ennegrecido en el
interior

Brazo
Platina
Orificio
Carril
Porta la muestra
Fija o móvil

Píe

Sostiene al instrumento,
Escala debe ser de amplia base,
sólido y pesado
 SISTEMA DE AJUSTE
Anillo de ajuste
de los oculares

Tornillo que
permite mover
el cabezal

Tornillos del
condensador

Tornillos
Palanca de reguladores de
cierre del la platina
diafragma
SISTEMA DE ENFOQUE

Tornillo
macrométrico
Permite el
enfoque ràpido de
la muestra

Tornillo
micrométrico
Permite el
enfoque nítido
 SISTEMA DE ILUMINACIÓN
FUENTE DE LUZ

 Suele ser una lámpara

halógena de intensidad
graduable
 En el exterior puede
tener un filtro
Filtro

Interruptor y graduación
de la luz
Lámpara
 CONDENSADOR Y DIAFRAGMA
• Condensador: concentra la luz de
la lámpara sobre el plano de la
preparación
– Lente planoconvexa
– Lente biconvexa
• Diafragma o iris
– Insertado en el condensador
– Sistema de laminillas concéntricas
– Regula la abertura y controla la
calidad de la luz
 SISTEMA DE AUMENTOS
• OBJETIVOS
 Producen aumentos de las imágenes de los
objetos
 Establecen calidad de imagen: nitidez y capacidad
para captar los detalles de la misma (poder de
resolución).
 Están en el revolver
 Un anillo indica los aumentos
 Rojo 4X
 Amarillo 10X
 Azul 40X
 Blanco 100X (inmersión)
 OBJETIVOS
Lentes: convergente y divergente
Eliminar aberraciones que afecta
calidad imágenes.
Forman Imagen: aumentada de
tamaño, invertida y real.
Lentes disponen dentro soporte o
camiseta metal, con anotaciones
en exterior que indican:

DIC = Interferencia de contraste diferencial

H = puede emplearse en microscopios con platina
caliente (heating stage)
 TIPOS DE OBJETIVOS
1. Según Medio existente entre objeto
examinado y lente frontal del objetivo.
• EN SECO • DE INMERSIÓN
• Se utilizan sin • Sistema de lentes complejos
ninguna sustancia • Utilizan aceite de inmersión:
entre ellos y el aceite de cedro o aceites
artificiales
preparado
• Su misión es concentrar los
• Aumentos : rayos de luz que proceden
– 10X
– 20X
del foco luminoso evitando
– 40X su refracción en caso de
– 60X atravesar el aire
 2. Según la Corrección a que se somete las lentes

(a)Acromático: corrigen los rayos luminosos azules y rojos

haciéndoles coincidir e un solo plano focal.
(b)Semiapocromático o fluorita, corrigen espectro secundario
dan como resultado imágenes de bordes nítidos. Corrigen
esfericidad verde y azul, alta capacidad trasmitir royos onda
corta son ideales M. fluorescencia.
(c)Apocromático: hace coincidir en solo plano rayos azules,
rojos verdes, obtiene imagen de borde nítidos.
características de los objetivos
 Aumentos
8X,10X, 12,5X, 15X
OCULARES
• Recogen imagen producida por el
objetivo
• Genera imagen aumentada, virtual
y derecha
• Lentes:
– Lente superior o lente ocular: Plano
convexa
– Lente inferior /campo/ colectora
Recibe la imagen real formada por el
Ajuste de la
distancia
objetivo y lo refracta y origina en el
interpupilar plano del diafragma del ocular una
imagen
 TIPOS DE OCULARES
Clasificación:
Según disposición de lentes y diafragma, dentro del tubo

a) Oculares negativos de b) Oculares positivos o de Ramsden.

Hüygens:
- Dos lentes plano convexos,
dirigida hacia abajo
- Entre ambas lente se sitúa
diafragma anular, localizado en el
plano focal de las lentes..
- Lentes plano convexas dispuestas con
superficies curvas dirigidas hacia
adentro.
- El diafragma situado por debajo de
lente de campo o frontal; en el plano
donde se forma la imagen formada por
objetivo.

diafragma
 TIPOS DE MICROSCOPIOS
Microscopio Lupa
Óptico Simple
Microscopio
óptico Microscopio M. de campo claro
Óptico M. Campo oscuro
Tipos M Contraste de fases
Compuesto M Fluorescencia

Microscopio Transmisión
electrónico Barrido
Digital
Efecto túnel o cuántico
 MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO
• La luz pasa directamente a través de
la muestra  imagen

• El contraste se obtiene por uso de

colorantes que reaccionan con
proteína y ácidos nucleicos
previamente fijados
λ que se absorbe

λ que pasan
 MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO
• Los objetos se iluminan por rayos de luz
oblicuos - desde la parte lateral
• El objeto iluminado dipersa la luz y se
hace así visible contra el fondo oscuro

las partículas de
polvo iluminadas
por un rayo de sol
que se cuela en
una habitación
cerrada.
Bloquea los rayos de
luz centrales
Uso: Esta forma de iluminación se utiliza
• para analizar elementos biológicos transparentes y
sin pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin
fijar la muestra
• En investigación examina preparados
autoradiograficos
– Granulos de plata que aparecen blancos en un fondo
oscuro
• En clínica
– Detecta cristales en orina
– Identificación de espiroquetas
Treponema palidum
(sifilis)
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE
FUNDAMENTO
Las fases de las ondas
luminosas varia en relación al
índice de refracción de las
partes de la célula

Utiliza sistemas ópticos

que conviertes las variaciones
de densidad en las diferentes
partes de la célula en
diferencias de contraste y
generan la imagen
Permite observar células
vivas o cortes finos no
teñidos
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE
El anillo forma un cono hueco de
luz.
El rayo de luz que atraviese la
muestra va a retrasarse respecto
del rayo que siga de largo

Modificaciones
M. Interferencia
M. De interferencia diferencial
 MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
• Utiliza una tinción fluorescente para marcar la estructura
de interés
• La fluorescencia se detecta mediante la iluminación de la
muestra con una longitud de onda que excita al tinte
fluorescente
• Utiliza filtros para detectar la longitud de onda específica
que emite el colorantes
Colorantes fluorescentes
(fluorocromos)
 MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
Aplicaciones
Detecta proteínas específicas
Revela organelos dentro de la célula

Limitaciones
En cortes celulares finos
Utiliza fijadores que destruyen la
antigenicidad de las proteínas

Moleculas flurescentes
- Proteina verde fluorescente
- Bromuro
- Naranja de acridina
 MICROSCOPIO CONFOCAL

• Barrido de luz por toda la muestra -una imagen bidimencional

• Recoge información secuencial de cada punto --- registro-- imagen
tridimencional
Permite resolver estructuras: redes del citoesqueleto
• Limitante: no es eficiente en cortes finos, puede obtener imagen de
profundidad de 150um
MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
 MICROSCOPIO ELECTRONICO
• El ME utiliza electrones para iluminar un
objeto
• Longitud de onda mucho menor que la de la
luz muestra estructuras mucho más
pequeñas.
• λ mas corta de luz visible es de alrededor de
4.000 ángstroms
• λ de los electrones en ME es = 0,5 ángstroms.
En el estudio de las células se utilizan dos
tipos básicos de microscopio electrónico:

1. Microscopio electrónico de transmisión

(MET)
2. Microscopio electronico de barrido (MEB)
 M.E. DE TRANSMISIÓN
•Emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto
•Haz de electrones pasan a través de la muestra imagen
•Haz de electrones chocan con ion metal impregnado en
la muestra y se reflejan no forman imagen zonas
oscura
•Cortes de la muestra en capas finas,
•Aumentan el tamaño del objeto
hasta un millón de veces.

Bacilos en división
 Técnica
Tinción positiva Tinción negativa
• Cortes finos de muestra • Muestra + metales pesados
• Fijación : que rodean la superficie
• glutaraldehido • Lamina densa de
• T. de osmio electrones rodea la
• Congelación: hielo vitreo muestra
• Tinción con metales pesado • Imagen clara en fondo
– Acetato de uramio oscuro
– Citrato de plomo Para estructura
• Reacciona con: lípidos, intactas
- Bacterias
proteínas, Ac. nucleicos - Organelos
- Macro-
• Imagen oscura moléculas
Filamentos de actina
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE
TRANSMISIÓN
 M.E. DE BARRIDO
• Muestra + metal pesado
• Haz de electrones que
Haz de electrones barre toda la muestra
primarios
• Se producen electrones
secundarios que una vez
recogidos por el detector
son empleados como señal
en una pantalla de tubo de
rayos catódicos para
obtener una imagen
tridimencional
• Amplian los objetos 100.000
veces o más.
  Iluminación
COMPARACION  Longitud de
onda
 Lentes
 Medio
 Resolución
 Magnificación
 Contraste
 Formación de
imagen
FUENTES
Alberts
Cooper
David Freifelde. Técnicas de bioquímica y biología molecular(disponible Web)