MICROSCOPIA y

TINCION
Dra. María Elizabeth Alemán Huerta
Microscopía óptica de campo claro

•El microscopio óptico utiliza lentes

de vidrio para desviar y enfocar los
rayos de luz, produciendo
imágenes aumentadas de objetos
pequeños.

•La resolución máxima de un

microscopio óptico es aprox. 0.2µm.
Microscopía óptica de campo claro
•El microscopio de campo claro requiere la
aplicación de colorantes sobre los
microorganismos para facilitar su visualización.

•Los colorantes se utilizan también para

determinar la naturaleza de las paredes
celulares bacterianas o para visualizar
estructuras procariotas específicas como
flagelos o cápsulas.

•Los microscopios electrónicos utilizan

haces de electrones en vez de luz para
lograr una resolución (hasta 0.5nm).

•Nuevas formas de microscopía: confocal

de barrido láser y el microscopio de sonda
de barrido .
 Microscopía óptica de campo claro
Los microscopios electrónicos utilizan haces de electrones
en vez de luz para lograr una resolución (hasta 0.5nm).

• Unidad Abrev Valor

1centímetro cm 10m
-2

1 milímetro mm 10metros
-3

1micrómetro mm 10 m
-6

1 nanómetro nm
-9
10 m
1 Angstrom Aº
-10
10 m
Microscopía óptica de campo claro

• Lentes y desviación de la luz.

•Cuando un rayo de luz pasa de un medio a otro se
produce refracción es decir, el rayo se desvía en la
interfase.

•El índice de refracción es una medida de la intensidad

con la que una sustancia disminuye la velocidad de la luz.

•La dirección y la magnitud de la desviación

se determinan por los índices de refracción de
los dos medios que forman la interfase.
Microscopía óptica de campo claro

•Lentes y desviación de la luz.

EL MICROSCOPIO de CAMPO CLARO
•Una lente funciona de modo similar a un
conjunto de prismas. Los rayos de luz
producidos por una fuente distante se
enfocan en un punto focal F.
 •Un prisma desvía la luz

•Las lentes actúan como un conjunto de

prismas. Cuando la fuente de luz está alejada
de forma que sobre la lente inciden rayos de
luz paralelos, si la lente es convexa se enfocará
los rayos en un punto específico, el punto focal.
Microscopía óptica de campo claro

•La distancia entre el centro de la lente y el

punto focal se denomina distancia focal.

•La potencia de la lente está relacionada

con la distancia focal; una lente con una
distancia focal corta aumentará un
objeto más que una lente más débil con
una mayor distancia focal.
EL MICROSCOPIO OPTICO
Actualmente los microbiólogos
utilizan varios microscopios
ópticos en su trabajo:

•Los microscopios de campo claro

•Microsc. de campo oscuro
•Microsc de contraste de fases
•Microsc de fluorescencia.
 EL MICROSCOPIO de CAMPO CLARO
•El microscopio ordinario
base
se denomina microscopio
de campo claro porque
forma una imagen oscura brazo
sobre un fondo más claro.
Fuente de luz (espejo
Ó iluminador eléctrico)
Mando de ajuste fino
MICROMETRICO Mando
de ajuste grueso
MACROMETRICO
 EL MICROSCOPIO de CAMPO CLARO

•Consiste en un cuerpo o soporte de metal compacto

base Fuente de luz (espejo Ó iluminador eléctrico)

PLATINA: SITUADA EN MEDIO; CON PINZAS SIMPLES O SOBRE

PLATINA MEC

Mando de ajuste fino MICROMETRICO

Mando de ajuste grueso MACROMETRICO
 EL MICROSCOPIO de CAMPO CLARO

•Consiste en un cuerpo o soporte de metal compacto

• La imagen que se ve al observar la muestra con un

microscopio compuesto se crea por el efecto conjunto de las
lentes objetivo y ocular.

• La luz procedente de la muestra iluminada se enfoca con la lente

objetivo, creando dentro del microscopio una imagen aumentada.
• La lente ocular aumenta todavía más esta primera imagen.

El aumento total se calcula multiplicando los aumentos del objetivo y del

ocular.
10 x 10 = 100 veces aumentado el tamaño real
10 x 40= 400 veces aumentado el tamaño real
10x 100= 1000 veces aumentado el tamaño real
Resolución de un microscopio

La parte más importante de un microscopio es el objetivo q

debe formar una imagen aumentada, pero además clara.
Por ello la resolución es extremadamente importante.

La resolución es la capacidad de un lente de separar o

distinguir entre objetos pequeños muy próximos entre sí.
Resolución de un microscopio

La mejor resolución se obtiene

:
-utilizando una lente con la
mayor apertura numérica
(AN) posible y
-Una luz con la menor

longitud de onda posible, la

luz del extremo azul del

espectro visible.
 Resolución de un microscopio
Poder resolutivo (PR)

Capacidad de un sistema óptico para ver detalles

LR<PR

LR OJO 0.2 mm EQUIVALENCIA DE UNIDADES

LR MO 0.2 um 1mm-------------- 1000um (micrómetros)
LR Me 0.2 nm 1um--------------1000nm (nanómetros)
1nm--------------1000A (Amstrong)
Resolución de un microscopio
Optico
 Resolución de un microscopio

Resolución Magnificación

Ojo Humano 0.1mm No produce

Microscopio óptico 200nm 1000-2000 veces

Microscopio
3-5 A° 250,000 vecces
electrónico
Resolución de un microscopio
•La apertura numérica (n sen θ) de una lente es un
concepto complejo q puede ser difícil d comprender.
Se define mediante 2 componentes:
El indice de refracción del medio en el que se
encuentra la lente (ej. aire) y θes la mitad del
ángulo del cono de luz que entra en un objetivo.
Cuando este cono tiene un ángulo estrecho, forma
un vértice muy agudo y no se extiende mucho más
allá después de atravesar el portaobjetos, por lo
que no separa adecuadamente las imágenes de
dos objetos muy próximos entre sí. Si el cono de luz
tiene un ángulo muy abierto y se propaga
rápidamente después de atravesar la muestra, los
objetos muy próximos aparecen ampliamente
separados y se resuelven.
•El ángulo del cono de luz que puede penetrar
una lente depende del índice de refracción (n)
del medio en el que trabaja la lente, así como
del propio objetivo.

•El índice d refracción del aire es 1 y sen θ, no

puede ser superior a 1 (θmax es 90º y sen 90=1).

•Por lo tanto unas lentes que funcionan en el aire

no pueden tener una apertura numérica por
encima de 1.
•El único modo práctico de aumentar la apertura
numérica por encima de e1, y de este modo
lograr una mayor resolución, es aumentando el
índice de refracción con aceite de inmersión, un
líquido incoloro con el mismo índice de
refracción que el vidrio.

•Si se sustituye el aire por el aceite de inmersión,

muchos de los rayos de luz que no penetraban
en el objetivo por la reflexión y la refracción de
las superficies del objetivo y del portaobjetos, lo
harán ahora.

•Esto provocará un aumento en la apertura

numérica y en la resolución.
 •Esto provocará un aumento en la
apertura numérica y en la
resolución.

Objetivo

Distancia
θ
de trabajo
 •El poder de resolución teórico máximo de un
microscopio con un objetivo de inmersión en aceite
(apertura numérica de 1.25) y luz azul-
verde es aproximadamente 0.2 µm.

•En el mejor de los casos, un microscopio de

campo claro puede diferenciar entre dos puntos
situados a 0.2 µm (el mismo tamaño d una
bacteria pequeña).
•Conociendo el límite de resolución de un microscopio óptico,
puede determinarse el aumento útil máximo(la cantidad de
aumentosnecesaria para incrementar el tamaño de los objetos
solubles más pequeños que se puede visualizar con el
microscopio óptico.

•Nuestro ojo tan sólo puedo detectar un punto de 0.2mm

de diámetro, por lo que el límite útil de aumento es unas
1000 veces la apertura numérica de la lente del objetivo.

•La mayoría de los microscopios estándar tiene oculares de 10x

y un limite superior d unos 1000x con aceite d
inmersión.
 Preparación y tinción de muestras
• Los microorganismos se tienen que fijar y teñir para
facilitar su observación, acentuar características
morfológicas específicas, y conservarlas para estudios
posteriores.

• FIJACION
Las células teñidas deberían parecerse tanto como sea
posible a las células vivas. La fijación es el proceso por el que
se preservan y se fijan en una posición las estructuras
internas y externas de las células y los moos̀.

• Este proceso inactiva enzimas que podrían alterar la

morfología celular y endurecer las estructuras celulares de
manera que no se alteren durante la tinción y observación

• Normalmente durante la fijación los m.oo’s se inactivan y se

unen fuertemente al portaobjetos.
 2.2. Preparación y tinción de muestras

• FIJACION
• 2 tipos:

Fijación por calor

Fijación química
 2.2. Preparación y tinción de muestras

Fijación por calor

Se utiliza de manera rutinaria para observar procariotas.

Normalmente una película de células (un frotis) se

calienta suavemente pasando el portaobjetos por una
llama.

La fijación por calor preserva la morfología global pero no

las estructuras intracelulares.
 2.2. Preparación y tinción de muestras (25-28)

Se utiliza para proteger

subestructuras celulares finas y la
morfología de los microorganismos
más grandes pero más delicados. Fijación química

Los fijadores químicos penetran en

las células y reaccionan con los
componentes celulares, normalmente
proteínas y lípidos, para inactivarlos,
insolubilizarlos e inmovilizarlos. Fijador
muestra
Ej. Mezclas con etanol, ac. acético,
cloruro de
mercurio, formaldehído y
glutaraldehído.
2.2. Preparación y tinción de muestras

Colorantes y tinción simple

Los colorantes contienen grupos cromóforos: grupos con

dobles enlaces conjugados que dan al colorante su color, y
pueden unirse a las células por enlaces iónicos,
covalentes, o hidrofóbos.

Tinciones negativas: en las que lo que se tiñe no es la célula

si no el fondo; las células o ls estructuras de interes (capsulas)
no teñidas aparecen como
objetos brillantes sobre un fondo oscuro. Ej . la tinta china
y la nigrosina,
 2.2. Preparación y tinción de muestras (25-28)

Los colorantes se unen a las

células por interacciones iónicas

Pueden dividirse en:

1) Colorantes básicos
azul de metileno
Fucsina básica
Cristal violeta
Safranina
Verde de
malaquita
Colorantes básicos

Tienen grupos cargados positivamente

Se unen a moléculas cargadas
negativamente como ácidos nucleicos y
Proteínas
Superficie de células procariotas
2. Colorantes ácidos

Eosina
Rosa de bengala
Fucsina acida

Poseen grupos cargados negativamente como

carboxilos (-COOH) e hidroxilos fenólicos (-
OH).
Se unen a estructuras de la célula cargadas
positivamente
El pH puede modificar la eficacia de la tinción de los
colorantes

Los colorantes ácidos tiñen mejor bajo condiciones

acídicas en las q las proteínas y muchas otras
moléculas presentan carga positiva, y los
colorantes básicos son más eficaces a pH
elevados.

 TIPOS DE TINCIONES
TINCION SIMPLE: Se utiliza un solo colorante.

TINCION DIFERENCIAL: Se utilizan para diferenciar

organismos en base a sus características de
tinción.

TINCION ESPECIAL: Para el estudio de estructuras

especificas
 TINCION SIMPLE:
Se utiliza un solo colorante.

TINCION DIFERENCIAL: Se utilizan

para diferenciar organismos en
base a sus características de
tinción.

TINCION GRAM; desarrollada en

1884, por el médico danés Christian
Gram.
Es el método más ampliamente
utilizado en bacteriología.
 2. Tinciones diferenciales
TINCION GRAM

La tinción Gram divide a

Bacterias en dos clases:
GRAMNEGATIVOS Y
GRAMPOSITIVOS.

1.Tinción con el colorante básico cristal violeta.

2.Agregar un mordiente. El yodo intensifica la interacción
entre la célula y el colorante de manera que la célula se tiñe
más intensamente.
Comunmente se usa Yodo Lugol
3.Posteriormente se decolora el frotis
lavándolo con acetona o alcohol.
Comunmente se usa Alcohol-Acetona.

4. Finalmente se agrega safranina como

colorante secundario, el cual tiñe las
bacterias que se decoloraron (Gram-)
 Tinción Acidorresistente
Ziehl-Neelsen
Tinción diferencial
Se utiliza normalmente para identificar
Mycobacterium tuberculosis y M.leprae, los
patógenos responsables de la tuberculosisy la
lepra, respectivamente.
Estas bacterias tienen paredes celulares con un
elevado contenido de lípidos, en particular,
ácidos micólicos, que evita que los colorantes se
unan fácilmente a las células.
Sin embargo, estas bact.erias ,se pueden teñir mediante
metodos más fuertes como el método Ziehl-Neelsen, que
utiliza el calor y fenol para que la fucsina básica penetre en
las células.

Una vez ha penetrado, no es fácil decolorar con alcohol

ácido, y por ello se dice que son acidorresistentes.

Las bacterias no acidorresistentes se decoloran con el

alcohol acido y por ello se tiñen de azul con el
colorante de contraste azul de metileno.
 3. Tinciones

especiales
Tinción de cápsula

Capsula: redes normalmente de

polisacáridos que rodean muchas
bacterias y algunos hongos.

Las células se mezclan con tinta china

o con nigrosina y se extiende en una
capa fina sobre el portaobjetos.

Las celulasc aparecen como cuerpos

brillantes en unfondo azul-negro,
Tinción negativa.
.


Tinción de endosporas.

Se requiere de un método fuerte, Las

endosporas pueden ser desde esféricas
hasta elípticas y pueden ser más pequeñas
o más grandes que la bacteria progenitora.

Las endosporas no se tiñen bien con la

mayoría de los
colorantes, pero una vez teñidas, resisten
fuertemente a la decoloración. Esta
característica es la
base de la mayoría de métodos de tinción
de esporas.


Tinción de endosporas.

Método Schaeffer-Fulton:
Las endosporas se tiñen
primero calentando las
bacterias en presencia de
verde de malaquita,
después, el resto de la
célula se decolora
lavando con agua y se
realiza tinción de
contraste con safranina.
Esporas verdes, en el
interior de cels rosas.


Tinción de flagelos.
Proporciona información de valor taxonómico
sobre la presencia y el patrón de distribución
de flagelos en células procariotas.

Los flagelos procariotas son orgánulos de

locomoción con forma de hilo, tan delgados
(10-30 nm diámetro), que sólo pueden verse
con el microscopio electrónico

Para observarlos con el microscopio óptico,

el grosor de los flagelos se incrementa
recubriéndolos con mordientes como el
ácido tánico y el alumbre de potasio y
después se tiñen con pararosanilina
(método de Leifson) o fucsina básica
(método de Gray).
Thank
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