2023

PRESENTACIÓN

El presente Manual de trabajo en el Laboratorio está diseñado para el curso de Inmunología Clínica
(TEMD1113) dirigido a estudiantes de Tecnología Médica. Este manual se desarrolla en el marco de un
curso que transforma lo analizado en Inmunología general (TEMD1109) y lo aplica al ámbito clínico con
especial enfoque al laboratorio clínico.

Este material ha sido preparado por académicos del área y buscar introducir al estudiante en las técnicas
de laboratorio basadas en la reacción antígeno-anticuerpo, abordando aspectos teóricos y prácticos que
involucran todas las etapas del proceso diagnóstico, que forma parte integral del ejercicio profesional del
Tecnólogo Médico. El manual se sustenta en evidencia científica y recomendaciones técnicas nacionales
e internacionales que permitirán al estudiante desarrollar competencias específicas que le permitirán
desempeñarse eficientemente en las distintas áreas del laboratorio con especial enfoque en las áreas de
Inmunología.

Todas las técnicas de laboratorio que se realizarán tienen un tronco común y es que se basan en la
reacción antígeno-anticuerpo. Adicionalmente un grupo importante de estas mismas técnicas detectará
o cuantificará algunos elementos que son de apoyo para evaluar la función del sistema inmune.

Las y los invito recorrer este camino de aprendizaje que les permita desarrollar una sólida base
conceptual y técnica en Inmunología con enfoque clínico para contribuir a entregar una atención digna y
de calidad a nuestros usuarios.

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 ÍNDICE
PRESENTACIÓN ................................................................................................................................... 2
DETECCION DE FACTOR REUMATOIDE ................................................................................................. 5
PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN ...................................................................................................................................................... 5
FACTOR REUMATOIDE ................................................................................................................................................................ 7
KIT: HUMATEX RF - HUMAN ....................................................................................................................................................... 9
DILUCIONES SERIADAS .............................................................................................................................................................. 11
TEST RAPIDOS INMUNOLÓGICOS....................................................................................................... 12
INMUNOCROMATOGRAFÍA ...................................................................................................................................................... 12
CANABINOIDES ......................................................................................................................................................................... 15
KIT: RAPID MARIJUANA(THC) TEST – BOSON ........................................................................................................................... 16
PROCEDIMIENTOS DE LAVADO EN EL LABORATORIO .............................................................................................................. 22
CUANTIFICACIÓN POR ELISA .............................................................................................................. 24
ENSAYO POR INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (ELISA) .............................................................................................. 25
HORMONA ESTIMULADORA DE LA TIROIDES (TSH) ................................................................................................................. 28
KIT: TSH (THYROTROPIN) - HUMAN .......................................................................................................................................... 29
DETECCIÓN DE INDIRECTA DE PATÓGENOS ........................................................................................ 36
ELISA EN DETECCION INDIRECTA DE PATOGENOS.................................................................................................................... 36
SEROLOGÍA ............................................................................................................................................................................... 38
VARICELA .................................................................................................................................................................................. 41
KIT: VZV IGM - HUMAN ............................................................................................................................................................. 43
KIT: VZV IGG - HUMAN.............................................................................................................................................................. 49
CUANTIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS....................................................................................... 55
INMUNODIFUSIÓN RADIAL ....................................................................................................................................................... 55
INMUNOGLOBULINAS............................................................................................................................................................... 57
KIT: DIFFU-PLATE - BIOCIENTIFICA ............................................................................................................................................ 60
EJEMPLO DE TABLA QUE ADJUNTA EL KIT DIFFU-PLATE .......................................................................................................... 64
TUTORIAL IMAGEJ PARA DETERMINAR EL HALO DE IDR .......................................................................................................... 65
DETECCIÓN DE ALÉRGENOS ............................................................................................................... 70
INMUNOENSAYO EN LINEA (LIA) .............................................................................................................................................. 70
ALERGIAS .................................................................................................................................................................................. 71
KIT: EUROLINE INHALATION "MEXICO" (IGE) - EUROIMMUN .................................................................................................. 73
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ................................................................................. 83
INMUNOFLUORESCENCIA ......................................................................................................................................................... 83
ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ............................................................................................................................................... 83
KIT: IIFT: HEP-20-10 - EUROIMMUN ......................................................................................................................................... 87
ALGORITOMO DE CLASIFICACIÓN DE PATRONES ANA ........................................................................................................... 101

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 INFORME DE RESULTADOS RECOMENDADOS POR ISP PARA ANA ......................................................................................... 110
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS NUCLEARES EXTRAÍBLES................................... 113
ANTIGENOS NUCLEARES EXTRAÍBLES ..................................................................................................................................... 113
RELACIÓN ENTRE LOS PATRONES DE ANA Y LOS AUTOANTICUERPOS ENA ........................................................................... 114
KIT: ANTI-ENA PROFILEPLUS 1 EUROLINE - EUROIMMUN ...................................................................................................... 116

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 DETECCION DE FACTOR REUMATOIDE

En esta actividad práctica se detectará la presencia del factor reumatoide en pacientes por medio de un
kit de aglutinación en lámina. Debido a esto es que primero se abordará el concepto de aglutinación para
continuar con factor reumatoide.

PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN

La reacción entre un anticuerpo y su antígeno puede dar como resultado diversas formas de visualizar
dicha reacción. Un ejemplo de estas formas son las reacciones de aglutinación. La aglutinación se define
como la unión de varios elementos menores para formar uno o varios elementos mayores. Desde el punto
de vista biológico ocurre cuando las células que se encuentran en suspensión y en forma unicelular se unen
entre sí por medio de anticuerpos que sirven como puentes. El concepto clásico de aglutinación involucra
que el antígeno debe ser “particulado”, lo cual significa que debe poseer cuerpo y volumen y no debe ser
soluble en el medio para poder observar la aglutinación.

De acuerdo a la figura las células en suspensión (izquierda) adoptan la forma de conglomerados por medio
de puentes de anticuerpos (derecha). Estos conglomerados provocan que en el medio donde están
suspendidas las células se produzcan espacios libres, lo cual cambia el aspecto de homogeneidad que
poseía la suspensión.

Desde el punto de vista del laboratorio se pueden usar anticuerpos específicos para detectar la presencia
de algún antígeno de interés presentes en células, lo cual se traduce en una reacción de aglutinación, esta
forma se denomina aglutinación directa. Un ejemplo claro es la detección de los antígenos A y/o B de
sistema ABO en glóbulos rojos, en el cual se usan anticuerpos específicos para cada antígeno eritrocitario.
Contrario a esto se han desarrollado kits de detección de moléculas solubles en suero, siendo el material
“particulado” generado en la industria, siendo el más común usado el látex. Este material es recubierto por
anticuerpo policlonales específicos para la molécula e interés, por lo que sí está presente en una muestra
de suero se observará esta aglutinación, esta reacción se denomina aglutinación indirecta.

Para que la aglutinación ocurra, en el caso de la aglutinación directa, es necesario conocer con que clase
anticuerpos se está trabajando: IgG o IgM. En suspensión las IgG son monomérica mientras que la IgM son
pentaméricas, por lo que esta última posee 10 sitios de unión al antígeno para el cual es específico, a
diferencia de la IgG que solo posee 2. Esta diferencia también se traduce en el tamaño total de la molécula,
siendo la IgM mucho mayor a IgG, lo cual favorece la formación de puentes de unión a los antígenos.

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En esta figura se observa lo que ocurre cuando se usan anticuerpos de tipo IgG (izquierda) o IgM (Derecha).
Los anticuerpos de tipo IgM son de mayor tamaño y poseen mayor cantidad de sitios de unión al antígeno,
lo cual provoca que se formen puente entre las distintas células provocando una aglutinación. En el caso de
los anticuerpos de tipo IgG, al ser de menor tamaño no logra formar puentes entre las distintas células, por
lo que no se evidencia aglutinación. Sin embargo el anticuerpo si se unió al antígeno presente en las
células, lo cual se denomina sensibilización, no obstante la aglutinación no ocurrirá a menos que se use
otro anticuerpo como puente.

A la izquierda se presentan las células mezcladas con los anticuerpos de clase IgG que detectan al antígeno
presente en la célula y se une a él (lo sensibilizan), sin embargo, no las aglutinan. En la derecha se
presentan las mismas células ya sensibilizadas con el anticuerpo IgG, adicionando un segundo anticuerpo
anti IgG (en palabras simples sería un anticuerpo anti anticuerpo). El segundo anticuerpo reconoce la
porción constante del anticuerpo (Fc), lo cual puede formar puente con los anticuerpos IgG ya unidos a las
células provocando finalmente la aglutinación. El segundo anticuerpo, al ser especifico contra todas las IgG
de la especie animal del primer anticuerpo, debe ser fabricado a partir de otro modelo animal diferente al
primer anticuerpo. Un ejemplo sería: Las células son de origen humano por lo que el primer anticuerpo de
clase IgG es fabricado en ratones. El segundo anticuerpo debe ser fabricado en otro animal para que
reconozca la porción Fc de las IgG de ratón y no las humanas o de otra especie. El ejemplo de la derecha
corresponde a una aglutinación directa, pero de reacción indirecta, debido a que a que se usó un
anticuerpo secundario para revelar la reacción.

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Ejemplo de placa de aglutinación indirecta en látex. Se dispone de 6 pocillo con reacciones en los pocillos 1,
2, 3 y 4. La reacción positiva se observa por la forma de conglomerados de látex que se agrupan
permitiendo tener espacios oscuros, lo que corresponde al pocillo 2 (reacción fuerte) y pocillo 1 (reacción
débil). La reacción positiva indica que el anticuerpo conjugado al látex se unió a su molécula especifica y se
encuentra por sobre el umbral de detección que posee la técnica. La reacción negativa se observa como
una solución homogénea de las partículas de látex sin poder observar el fondo de placa, lo cual
corresponde a los pocillos 3 y 4. La reacción negativa se observa homogénea ya que los anticuerpos que
recubren a la partícula de látex no están unidos a su moléculas especifica lo cual permite que se puedan
repartir de forma uniforme entre toda la solución.

FACTOR REUMATOIDE

El factor reumatoide se denomina a un grupo de autoanticuerpos dirigidos contra epítopes localizados

en la porción Fc de la IgG. Suelen ser de clase IgM aunque existen isotipos IgG, IgA e IgE, sin embargo los
anticuerpos de clase IgM son los que poseen valor diagnóstico. Se detectan en la práctica clínica de
forma cualitativa con pruebas de aglutinación en látex y de forma cuantitativa por medio de
nefelometría.

Representación esquemática de la molécula de factor reumatoide. La imagen muestra que el factor reumatoide
corresponde a una IgM soluble con su forma pentamérica y que su especificidad es contra la porción Fc de la IgG.

El factor reumatoide puede aparecer en diferentes enfermedades autoinmunes, sin embargo, adquiere
gran relevancia en la artritis reumatoide, ya que este autoanticuerpo se ha observado en el suero de 80%
de las personas que poseen esta patología. La artritis reumatoide es una enfermedad sistémica,
inflamatoria y crónica, que se localiza de forma preferente en las articulaciones. Se caracteriza por la

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activación de diferentes poblaciones celulares sinoviales y la producción de mediadores proinflamatorios
como citocinas, prostaglandinas y proteasas. En general, se considera que es una enfermedad
autoinmune, aunque no se han identificado el o los antígenos desencadenantes. La alteración de los
mecanismos de tolerancia inmunológica desencadena una respuesta inmune persistente y exagerada
que se manifiesta por la formación de clones de células T autorreactivas y la producción espontánea de
autoanticuerpos dirigidos contra estructuras celulares propias (autoantígenos).

La detección de concentraciones elevadas de factor reumatoide sérico en pacientes con clínica

compatible es muy indicativa de artritis reumatoide, pero su ausencia no excluye el diagnóstico y, de
hecho, un subgrupo de pacientes presenta artritis reumatoide persistentemente seronegativa. Los
pacientes con artritis reumatoide y concentraciones elevadas de factor reumatoide clase IgM tienen
mayor riesgo de desarrollar una enfermedad articular erosiva grave, con más articulaciones inflamadas,
erosiones y manifestaciones extraarticulares, en particular nódulos subcutáneos y vasculitis.

La artritis reumatoide es una enfermedad por inmunocomplejos extravasculares que afecta

preferentemente al tejido sinovial. Los factores reumatoides se sintetizan localmente en la membrana
sinovial reumatoide, forman inmunocomplejos y se localizan en la matriz del cartílago. Es posible que
sean importantes en la patogenia de la artritis reumatoide, pero los mecanismos son poco conocidos y
aún no se ha demostrado definitivamente su participación directa en el desarrollo de las lesiones
articulares.

Referencias
1. Lopez F.J. (2002) Autoanticuerpos en la artritis reumatoide. Revista Española de Reumatología Suplementos 1(1):
27-35.

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KIT: HUMATEX RF - HUMAN
INICIO DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “HUMATEX RF”
HUMATEX RF
Prueba rápida en lámina de aglutinación en látex para la determinación cualitativa y semi-cuantitativa del
factor reumatoide, en suero.

Método
HUMATEX RF se basa en la reacción de aglutinación entre el factor reumatoide (RF) de la muestra del
paciente o el suero control y la inmunoglobulina humana G (IgG), que recubre las partículas de látex de
poliestireno. Una reacción positiva es indicada por una marcada y visible aglutinación de las partículas de
látex en el área de la lámina.

Contenidos, composición de reactivos en la prueba

1. Reactivo de látex (blanco) (tapa blanca)
Suspensión de partículas de látex poliestireno, recubiertas con Inmunoglobulina
humana G (IgG) 1,0 %
2. Suero control positivo (tapa roja)
Listo para usar, suero control de oveja, produce una aglutinación marcada
Anti-IgG humano (oveja)
3. Suero control negativo (tapa verde)
Control listo para usar, no reacciona con reactivo de látex
4. 1 lámina con 6 áreas
Reactivos 1, 2 y 3 poseen azida de sodio 0.095%

Estabilidad
El reactivo de látex y suero control son estables hasta su fecha de caducidad cuando se almacena de 2 a 8
°C. ¡No congelarlo!

Muestras
Suero: Almacenar de 2 a 8 °C hasta 24 horas
Almacenar de -20 °C hasta 4 semanas

Esquema de pipeteo
A. Determinación cualitativa (prueba de screening)
Llevar el reactivo de látex, controles y muestras de suero temperatura ambiente.
Mezclar el reactivo de látex con cuidado a fin de resuspender completamente las partículas.
Pipetear o gotear en áreas separadas de la lámina:
Suero muestra 40 µl
Suero control positivo, frasco 2 tapa roja 1 gota
Suero control negativo, frasco 3 tapa verde 1 gota
Reactivo de látex RF*, frasco 1 tapa blanca en las muestras y los controles 1 gota a cada uno
Mezclar con palillos por separado y extender el fluido sobre la superficie completa de las áreas.
Inclinar la placa de tras hacia adelante por 2 minutos de tal forma que la mezcla rote lentamente dentro de
las celdas de la placa o colocar en un rotador automático a 100 r.p.m.
Al final de los 2 minutos leer el resultado bajo luz artificial.
* Color blanco

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Interpretación de los resultados
La aglutinación clara indica un contenido de RF de más de 12 UI/ml en la muestra sin diluir. Los sueros
con resultados positivos en la prueba cualitativa deberían reanalizarse con la prueba de titulación (véase
parte B).

B. Semi-cuantitativa
Diluir las muestras con buffer glicina-salino (Cat.- No.: 40 037)

Dilución RF (UI/ml en muestra/dilución)

1 + 1 (1 : 2) 24
1 + 3 (1 : 4) 48
1 + 7 (1 : 8) 96
1 + 15 (1 : 16) 192
1 + 31 (1 : 32) 384
Continuar la prueba como se describe en la parte A.

Sensibilidad
HumaTex RF, está estandarizado para detectar concentraciones de RF en muestras de suero no diluido
para aproximadamente 12 UI/ml o más de acuerdo con el “suero internacional de referencia para factor
reumatoide (OMS)”.

Interpretación de resultados
Leer el título en la última dilución que presenta una aglutinación visible. Multiplicar el título por el factor de
conversón 12 (ver sensibilidad) y reportar el resultado en UI/ml.
Ej: Título 1 : 16 → concentración RF:
16 x 12 UI/ml = 192 UI/ml.

Control de Calidad
Los controles positivos y negativos se deben analizar con cada serie. Estos resultados deben ser
comparados con las muestras, para distinguir una posible granulación de una aglutinación.
El control positivo debe mostrar una aglutinación clara dentro de los 2 minutos.
El control negativo debe mostrar una suspensión homogénea sin aglutinación visible después de los 2
minutos.

Valor Diagnóstico
El significado clínico de las determinaciones de RF consiste en diferenciar entre la artritis reumatoide, en la
cual el factor reumatoide se ha demostrado en el suero de aproximadamente el 80% de los casos
examinados, y la fiebre reumática en la cual el factor reumatoide está casi siempre ausente. La prueba RF
es positiva más frecuentemente en los procesos activos a largo tiempo, que en las enfermedades menos
activas o que están aún en las primeras etapas. Ocasionalmente se encuentra en el suero de pacientes con
poliartritis nudosa, lupus eritematoso sistémico, hepatitis y en otras determinadas enfermedades.

Notas
1. Los sueros contaminados y fuertemente lipémicos pueden causar reacciones no específicas y por lo
tanto no deben ser analizados.

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2. Un tiempo de reacción mayor a 2 minutos puede dar resultados falsos positivos debido al efecto de
desecación.
3. Realizar el pipeteo teniendo el gotero en forma vertical.
4. Como en todos los métodos de diagnóstico, el diagnóstico final no debe basarse exclusivamente en el
resultado de una sola prueba, sino que debe estar fundamentado en la correlación de más de un resultado
junto a otros hallazgos clínicos.
5. El reactivo de látex y los sueros contienen azida de sodio como preservante: No ingerirlos. Evitar el
contacto con la piel o las membranas mucosas.
6. Todos los reactivos son de origen humano han sido probados para HBsAg y anticuerpos de HIV y se
encontró que son negativos según los métodos aprobados por FDA. Sin embargo, a pesar de estos
resultados negativos, deben tratarse como material potencialmente infeccioso.

Referencias bibliográficas
1. Beauregard, J.M. (1962) Serology of rheumatoid arthritis. Union Med Can 91:977-9.
2. Bandilla, K.K., McDuffie, F.C. (1969) Reactivity of rheumatoid factor with autologous IgG antibodies. Arthritis
Rheum 12(2):74-81.

FINALIZA TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “HUMATEX RF”

DILUCIONES SERIADAS

En el kit “Humatex RF” da la opción de realizar una mediación semicuantitativa indicando las diluciones
de la muestra recomendadas a estudiar. El formato de diluciones corresponde a la denominada
diluciones seriadas donde a partir de una muestra concentrada se hacen diluciones siguiendo el mismo
factor de dilución. La dilución entregada en el kit corresponde a una dilución seriada en múltiplo de 2
donde se traspasa un volumen constante de un tubo a uno siguiente dando resultado una dilución 1:2 de
tubo en tubo, pero si se analiza la dilución final de cada tubo corresponde a un exponente de 2. Por
ejemplo, si se tiene una muestra y se diluye 1:2, su concentración sería la mitad, pero si esta mitad
también se diluye 1:2 ahora sería “la mitad de la mitad” siendo ahora su factor de dilución 1:4. Si
continuamos el mismo ejercicio y la diluimos a la mitad, su factor de dilución será de 1:8 y su mitad sería
1:16 y así pudiendo continuar con 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, etc.

Tubo N° Dilución Factor de dilución

1 Sin Dil. --
2 1:2 2
3 1:4 4
4 1:8 8
5 1:16 16
6 1:32 32

Para fines del kit “Humatex RF”, esto se hace para semicuantificar la muestra, por lo que el ultimo tubo
que obtiene la reacción positiva, se multiplica su factor de dilución por el límite de detección del kit (12
UI/ml) entregando una concentración cercana que es cercana a la real, pero no la verdadera. Para
obtener una concentración exacta de FR se deben utilizar otros tipos de técnicas para cuantificar.

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 TEST RAPIDOS INMUNOLÓGICOS

Los avances en la generación de anticuerpos como apoyo al diagnóstico han creado diversas técnicas
para evaluar desordenes hormonales, la presencia de toxinas de agentes patógenos, respuesta inmune
frente a algunos agentes virales y presencia de metabolitos estupefacientes. Algunas de estas técnicas
requieren de varios pasos procedimentales, incluido lavados, para poder evidenciar una reacción. Debido
a esto es se han generado pruebas de laboratorio de fácil realización. Este tipo de técnicas solo
requieren de mezclar una muestra de suero u orina en una matriz sólida y esperar que ocurra una
reacción donde deben aparecer bandas o líneas en ciertas zonas. Este tipo de técnicas por lo general son
con fundamento de la cromatografía pero al asociarlo al uso de anticuerpos se denomina
inmunocromatografía.

INMUNOCROMATOGRAFÍA

La cromatografía es una técnica usada para separar componentes o solutos de una mezcla distribuida en
un líquido en movimiento, denominado la fase móvil, y una fase estacionaria continua, que
generalmente es sólida, aunque puede ser líquida. El movimiento molecular constate permite
intercambio entre las dos fases provocando que los solutos migren a distintas regiones de la fase sólida.
Los primeras evidencia de la cromatografía provienen de cuando se usaban sustancias colorantes sobre
papel secante y se producían cambios de colores a medida que migraban por el papel.

El concepto de inmunocromatografía mezcla la separación de componentes de una muestra en una

matriz sólida y una reacción inmunoquímica. El sistema inmunocromatográfico más usado en la práctica
clínica son las tiras reactivas de “test rápidos”.

Ejemplos de tiras de inmunocromatografía. Las imágenes en A y B corresponden a casetes sellados de

inmunocromatografía, dejando descubiertas dos áreas del total de sus almohadillas. La imagen en C corresponde a
una cinta inmunocromatográfica descubierta.

Las tiras reactivas inmunocromatográficas poseen cuatro componentes principales:

1. Almohadilla de aplicación de la muestra.

Se prepara de fibras de celulosa o vidro. En este punto se aplica la muestra optimizada para el método ya
que aquí se inicia la reacción inmunocromatográfica. La almohadilla de muestra debe ser capaz de

12
transportar la muestra de una manera suave, continua y homogénea. En esta área ocurren procesos
como separación de la muestra, eliminación de interferentes, ajuste del pH etc.

2. Almohadilla de conjugación.
En este lugar es donde se encuentran los anticuerpos específicos para la molécula conjugada con
sustancias que otorgan color, siendo las partículas nano oro coloidal las mayormente usadas. El
componente presente aquí debería avanzar a medida que la fase liquida móvil se desplaza desde la
almohadilla de aplicación de la muestra. En esta región la muestra junto con el anticuerpo conjugado
avanzan en un flujo constante a las siguientes regiones de la tira inmunocromatográfica.

3. Membrana del sustrato

Este componente es crítico porque determina la sensibilidad del test. En esta membrana se encuentran
las líneas “test” y “control” que revelan y dan interpretación a lo ocurrido. Una membrana ideal debería
proveer soporte y buena captura a los componentes que se desplazan por la fase móvil, siendo la
nitrocelulosa la membrana mayormente usada. No debe ser susceptible a uniones inespecíficas porque
alterarían las líneas test y control. Generalmente estas membranas ya fueron tratadas antes, realizando
bloqueos para evitar uniones inespecíficas.

4. Almohadilla absorbente
Funciona como sumidero al final de la tira reactiva. También ayuda a mantener la velocidad de flujo del
líquido sobre la membrana y detiene el flujo de retorno de la muestra. La capacidad adsorbente de esta
almohadilla para contener líquidos puede jugar un papel importante en los resultados del ensayo.

Todos los componentes anteriores están fijos sobre una tarjeta de soporte. Los materiales de esta tarjeta
son flexibles porque no tienen relación con la reacción inmunocromatográfica, solo proveen de una
plataforma para ensamblar los demás componentes.

Componentes de una tira inmunocromatográfica.

Las kit inmunocromatográfico poseen 2 formatos en base al fundamento de la reacción:

1. Ensayo Sándwich:
En este formato, el anticuerpo conjugado es depositado en la almohadilla de conjugación, en la cual
ocurre una adsorción temporal, ya que la fase móvil permite que este anticuerpo fluya en la misma
dirección del líquido. El anticuerpo depositado es específico para un epítope de la molécula a detectar y
al tener contacto con la muestra que sigue su flujo, ocurre la reacción antígeno-anticuerpo. Durante el
flujo, la muestra llega a la línea test, la cual también presenta anticuerpos contra la molécula de interés,
pero para otro epítope. En esta línea los anticuerpos fijos a la membrana del sustrato capturan a la
molécula de interés, la cual ya estaba unida al anticuerpo conjugado. Esta reacción provoca que se

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visualice la línea test. Adicionalmente, los kits incluyen otra línea denominada control, la cual posee
anticuerpos contra la región Fc de la clase de inmunoglobulina presente en la almohadilla de
conjugación. Esta línea tiene la finalidad de capturar a los anticuerpos conjugados al colorante que no se
unieron a la molécula de interés. Esta línea valida el resultado presente en la línea Test ya que al no
presentarse la línea control indicaría que la técnica no se realizó como corresponde. El nombre Sándwich
se otorga porque la molécula de interés esta entremedio de 2 anticuerpos.

Ejemplo de ensayo inmunocromatográfico tipo Sándwich.

En estos ensayos la presencia de la molécula de interés se evidencia con la presencia de la línea “Test”,
además debe estar presente la línea “control” para validar resultado. En el caso de ausencia de la
molécula de interés, solo se observará la línea “control”.

2. Ensayo competitivo
Los ensayos competitivos tienen la misma anatomía que el ensayo anteriormente explicado. La
diferencia radica que la línea “test” ya posee la molécula de interés anclada en la membrana del
sustrato. Se denomina competitivo porque la molécula de interés anclada a la línea “test” compite con la
molécula de interés de la muestra por los anticuerpos conjugados a un colorante presente en la
almohadilla de conjugación. De esta forma si la muestra posee una concentración de la molécula de
interés por sobre el umbral de detección, no se observará la línea “Test”. Igualmente existe una línea
control la cual deberá estar siempre presente para validar el resultado obtenido. Recíprocamente, las
muestras que no poseen la molécula de interés tendrán las dos líneas, debido a que el anticuerpo
conjugado se unirá a la molécula de interés presente en la línea Test y el exceso de anticuerpos será
capturado por los anticuerpos anti clase de inmunoglobulina ubicados en la línea control.

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El formato de inmunocromatografía competitivo parece más complicado que en tipo sándwich, sin
embargo es útil para componentes de bajo peso molecular que no pueden unir dos anticuerpos
simultáneamente.

Ejemplo de ensayo inmunocromatográfico tipo competitivo. Se observa un resultado negativo porque el Ag. Z está
en concentración bajo el límite de detección

CANABINOIDES

La planta Cannabis Sativa, también conocida como cáñamo indiano, ha sido utilizada desde hace más de
8000 años, expandiéndose su uso por todo el mundo. Dicha difusión fue causada por sus usos
analgésicos, anestésicos, recreativos e incluso textiles. Es una planta herbácea, cuyo interés
farmacológico reside en los cannabinoides, presentes en las sumidades floridas y en la resina de las
plantas. La planta posee una mezcla de unos 400 componentes, de los cuales 60 pertenecen al grupo de
los cannabinoides. Los principales son cannabinol, cannabidiol y tetrahidrocannabinol, siendo este
último al que se le atribuyen las propiedades psicoactivas.

Referencias
1. Suero-Garcia C, Martin-Banderas L, Holgado M, 2015. Ars Pharm 56 (2): 77-87.

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KIT: RAPID MARIJUANA(THC) TEST – BOSON
INICIO DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “RAPID MARIJUANA(THC) TEST”
RAPID MARIJUANA(THC) TEST
Para la medición cualitativa de metabolitos de marihuana en orina humana.
Número de catálogo: 1L4S3, 1L14C3
Para solo para diagnostico in vitro y uso forense

INTENCIÓN DE USO
El “rapid marijuana(THC) test” es una prueba in vitro basada en inmunocromatografia de un solo paso.
Está diseñado para la determinación cualitativa de metabolitos de la marihuana (THC) en muestras de
orina humana.
Este ensayo entrega solo un resultado analítico preliminar. Se deben usar técnicas químicas alternativas
más específicas para poder obtener un resultado analítico confirmatorio. La cromatografía
gaseosa/espectrometría de masas (GC/MS), por su nombre en inglés) ha sido establecida como el
método confirmatorio preferente por la Administración de servicios de salud mental para el abuso de
sustancias (SAMHSA, por su nombre en inglés). Se debería aplicar consideración clínica y juicio
profesional para cualquier resultado del test de abuso de drogas, particularmente cuando se indica un
resultado positivo preliminar.

RESUMEN Y EXPLICACIÓN
El componente de la marihuana que causa varios efectos biológicos en humanos es llamado
cannabinoides. El cannabinoide es un estimulante del sistema nervioso central que altera el ánimo y la
percepción sensorial, produciendo perdida de la coordinación, disminución de la memoria a corto plazo,
produce síntomas de ansiedad, paranoia, depresión, confusión, alucinación, e incrementa el ritmo
cardiaco. Altas dosis de cannabinoides podrían causar un desarrollo de tolerancia y dependencia
fisiológica y puede llevar al abuso. Una tolerancia a efecto cardiaco y psicotrópico puede ocurrir y el
síndrome de abstinencia produce inquietud, insomnio, anorexia y nauseas. El Δ9-THC es el principal
componente activo en cannabinoides. El principal metabolito excretado en orina es 11-nor-Δ9-THC-9-
COOH, el cual se puede encontrar dentro de la hora de exposición y mantener detectable en la orina por
3-10 días después de haberla fumado.

PRINCIPIO
El Rapid Marijuana(THC) test está basado en el principio de la reacción inmunoquímica especifica entre
anticuerpo y antígeno para analizar un componente particular en muestras de orina humana. El ensayo
depende de la competencia por el anticuerpo de captura. Cuando la droga y sus metabolitos están
presentes en muestras de orina, compiten con el conjugado de droga por la cantidad litada del
conjugado de anticuerpo-tinción. Cuando la cantidad de droga y sus metabolitos presentes en orina son
igual o superior que el punto de corte, estos prevendrán la unión del conjugado de droga al anticuerpo.
Por lo tanto, una muestra de orina positiva no mostrara la banda coloreada en la zona de la línea test,
indicando un resultado positivo, mientras que la presencia de una banda coloreada indica un resultado
negativo.

Una línea control está presente en la ventana del test para funcionar como un control de procedimiento.
Esta banda debería siempre aparecer en la zona de la línea de control si el dispositivo del test es
almacenado en condiciones adecuadas y si el test el ejecutado apropiadamente.

16
MATERIAL PROPORCIONADO
1. Test Rapid Marijuana(THC). La cantidad de cada antígeno cubierto y/o anticuerpo en la tira menos de
1,0 mg para le antígeno conjugado y es menos de 1,0 para anticuerpo anti IgG de conejo de cabra.
Almohadilla de conjugación: contiene anticuerpo anti la droga.
2. Instrucciones de uso

MATERIAL REQUERIDO, PERO NO PROPORCIONADO

1. Contenedor de orina
2. Timer o reloj

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
El dispositivo del test debería ser almacenado a 4-30°C, para ser efectivo hasta la fecha de expiración
indicada en su caja. El producto es sensible a la humedad y debería ser usado inmediatamente después
de ser abierto. Cualquier producto con un sellado inapropiado debería ser descartado para le uso.

PRECAUCIONES
1. Solo para diagnostico in vitro y uso forense
2. No usar el producto posterior a la fecha de expiración
3. Manipule todas las muestras como potencialmente infecciosas
4. Producto sensible a la humedad, no abra la bolsa de aluminio hasta que este listo para realizar el test.
5. Utilice un frasco de orina nuevo para cada muestra para evitar contaminación cruzada.

RECOLECCION DE MUESTRA Y PREPARACIÓN

La orina fresca no requiere de ninguna manipulación especial o pretratamiento. Una muestra de orina
fresca debe ser recolectada en un contenedor de platico o vidrio limpio y seco. Si la muestra de orina es
recolectada en el frasco, puede ser refrigerada a 2-8 °C o congelada por 7 días previos a la ejecución de
la prueba. La muestra debería ser estabilizada a temperatura ambiente antes de su uso. Si la muestra de
orina presenta una gran cantidad de precipitado o turbidez, debería ser centrifugada o permitir que se
disuelva antes de realizar la prueba. Evitar el contacto con la piel mediante el uso de guantes y
vestimenta de laboratorio adecuada.

CONTROL DE CALIDAD
Las buenas prácticas de laboratorio recomiendan el uso diario de materiales de control para validar la
confiabilidad del test. Los materiales de control deben analizarse como muestras clínicas y ponerse a
prueba a la concentración de corte del ensayo, por ejemplo, 50 % por encima y por debajo de la
concentración del punto de corte. Si los valores de control no se encuentran dentro del rango
establecido, los resultados del ensayo no son válidos. Los materiales de control que no se proporcionan
con este kit están disponibles comercialmente. La prueba rápida de marihuana (THC) proporciona un
control de procedimiento incorporado con una reacción de antígeno/anticuerpo diferente en la región
de control (C). Esta línea de control siempre debe aparecer independientemente de la presencia del
fármaco y sus metabolitos. Si la línea de control no aparece, el dispositivo de prueba debe desecharse y
el resultado obtenido no es válido. La presencia de esta banda de control en la región de control sirve
como 1) verificación de que se agrega suficiente volumen, 2) que se obtiene el flujo adecuado.

PROCEDIMIENTO
Para la tira de prueba THC (nuero de catálogo: 1L1453)

17
1. Lleve el dispositivo de prueba y las muestras a temperatura ambiente (15-28 °C) si se han refrigerado.
2. Retire la tira reactiva de la bolsa de aluminio sellada y utilícela lo antes posible.
3. Con las flechas apuntando hacia la muestra de orina, sumerja el extremo de la tira reactiva en la
muestra de orina.
4. Sostenga la tira reactiva en posición vertical durante al menos 10 segundos.
5. Retire la tira reactiva de la orina. Mientras retira la tira reactiva, pase el borde de la tira contra el
borde del recipiente de la muestra para eliminar el exceso de orina.
6. Coloque la tira reactiva sobre una superficie limpia, seca y no absorbente.
7. Lea los resultados 5 minutos después de que se agregó la muestra.

Para tarjeta de prueba THC (Número de catálogo: 1L14C3)

1. Lleve todos los materiales y muestras a temperatura ambiente.
2. Retire la tarjeta de prueba de la bolsa de aluminio sellada.
3. Etiquete la tarjeta de prueba con la identificación de la muestra en el "área de identificación del
casete".
4. Coloque la tarjeta de prueba en una superficie horizontal plana.
5. Uso de la pipeta de transferencia para extraer la muestra.
6. Sostenga la pipeta en posición vertical sobre el pocillo de la muestra marcado como "S" en la tarjeta
de prueba y gotee 2-3 gotas (80-120 µl) de muestra en el pozo de muestra.
7. Lea los resultados 5 minutos después de agregar la muestra.
Nota: No interprete los resultados después de 10 minutos.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Tira de test:

Negativo:
Se forman dos bandas de colores. La aparición de dos
bandas de colores, una en la zona de la línea de prueba
y la otra en la zona de la línea de control, indica un
resultado negativo para esa(s) prueba(s) en particular.
El resultado negativo no indica la ausencia del fármaco
y sus metabolitos en la muestra, solo indica que el nivel
del fármaco analizado y sus metabolitos en la muestra
es inferior al punto de corte.
Positivo:
Se forma una banda de color. Aparece una banda de
color en la zona de la línea de control. No se encuentra
ninguna banda de color en la zona de la línea de
prueba. Esta es una indicación de que el nivel del
fármaco analizado y sus metabolitos en la muestra está
por encima del nivel de corte.

18
Tarjeta de test:

Inválido
Si no hay una banda de color en la zona de la línea de
control de ninguna tira, el resultado de la prueba no es
válido. Vuelva a probar la muestra con un dispositivo
nuevo. Nota: una línea tenue (+/-) en la zona de la línea
de prueba debe considerarse un resultado negativo.

LIMITACIONES DE PROCEDIMIENTOS
El ensayo está diseñado para usarse únicamente con orina humana. Un resultado positivo con la prueba
indica solo la presencia de droga/metabolito y no indica ni mide intoxicación. Existe la posibilidad de que
un error técnico o de procedimiento, así como otras sustancias en ciertos alimentos y medicamentos,
interfieran con la prueba y provoquen resultados falsos. Consulte la sección "ESPECIFICIDAD" para ver las
listas de sustancias que producirán resultados positivos o que no interfieren con el rendimiento de la
prueba. Si la droga/metabolito se encuentra presente en la muestra de orina, el ensayo no indica la
frecuencia de uso de la droga ni distingue entre la droga de abuso y ciertos alimentos y medicamentos.

RESULTADOS ESPERADOS
La prueba rápida de marihuana (THC) es un ensayo cualitativo. Identifica el fármaco y sus metabolitos en
la orina humana en su concentración límite o superior. La concentración del fármaco y sus metabolitos
no se puede determinar mediante este ensayo. La prueba está destinada a distinguir un resultado
negativo de un presunto resultado positivo. Todos los resultados positivos deben confirmarse utilizando
un método alternativo, preferiblemente GC/MS.

CARACTERISTICAS DE EJECUCIÓN
A. Precisión
La precisión de la prueba de marihuana (THC) se evaluó en comparación con el método GC/MS y los kits
comerciales con un límite de 50 ng/ml de 11-nor-Δ9-THC-9-COOH. En este estudio se evaluaron
trescientas cuarenta y cuatro (344) muestras de orina que se componían de setenta y ocho (78) muestras
positivas para THC y doscientas sesenta y seis (266) muestras negativas. Los resultados se resumen a
continuación:
% de acuerdo positivo: 100, % de acuerdo negativo: 99%

B. Sensibilidad
Se determina que la concentración límite (nivel de sensibilidad) de la prueba de marihuana (THC) es: THC
50 ng/ml.

C Precisión
La precisión de la prueba de marihuana (THC) se determinó realizando la prueba con controles
enriquecidos y tres personas interpretaron los resultados para verificar el error aleatorio de

19
interpretación visual. Los resultados de 40 muestras, cada una con un 50 % por encima y un 50 % por
debajo de los especímenes de corte, están 100 % de acuerdo con tres observadores. Se encontró que los
resultados de la prueba no tenían diferencias significativas entre estos tres observadores.

D. Especificidad
La especificidad de la prueba rápida de marihuana (THC) se probó agregando varias drogas, metabolitos
de drogas y otros compuestos que probablemente estén presentes en la orina. Todos los compuestos se
prepararon en orina humana normal libre de drogas.

1. Prueba de interferencias
El rendimiento de la prueba rápida de marihuana (THC) en el nivel de corte no se ve afectado cuando los
rangos de pH y densidad específica de la muestra de orina están entre 4,0 y 9,0 y entre 1,005 y 1,035.
Se probaron las siguientes sustancias y se confirmó que no interfirieron con la prueba rápida de
marihuana (THC) en las concentraciones indicadas:
Glucosa 2000 mg/dl,
Albúmina humana 2000 mg/dl
Hemoglobina humana 10 mg/dl,
Urea 4000 mg/dl
Ácido úrico 10 mg/dl

2. Especificidad
La siguiente tabla enumera los compuestos que pueden producir resultados positivos cuando se prueban
a niveles iguales o mayores que las concentraciones que se enumeran a continuación:

Prueba Componente Punto de corte (ng/ml)

THC 11-nor-Δ8-THC-9COOH 37,5
11-nor-Δ9-THC-9COOH 50
11-hidroxi-Δ9-THC 5.000
Δ8-THC 15.000
Δ9-THC 25.000

Los siguientes compuestos no muestran reactividad cruzada a concentraciones de hasta 100 ug/ml, a
menos que se especifique en la tabla anterior.

Acetamidophenol Acetaminophen Imipramine Pentobarbital

Alfentanil HCL 6-Acetylmorphine Hydrochloride Perphenazine
7-Aminonitrazepam Acetylsalicyclic acid Lidocaine Phencyclidine (PCP)
Ascorbic acid Alprazolam Lorazepam B-Phenylethylamine
Bromazepam 7-Aminoclonazepam7- (+)-MBDB Phenylpropanolamine
Cannabidiol Aminoflunitrazepam (+)-MDA Prazepam
Chlorpheniramine Amitriptyline (+)MDEA Propoxyphene
Clonazepam Hydrochloride Meperidine (+)-Propranolol
Cotinine Amobarbital Sodium (4)Methadone Protriptyline
Dextromethorphan (+)Amphetamine (+)Methamphetamine R(-)-Epinephrine
Dihydrocodeine Benzoylecgonine Methaqualone R(-)-Methamphetamine
d-Pseudoephedrine Atenolol Methylphenidate Ranitidine

20
Ethylmorphine Atropine Midazolam S(-)-Nicotine
Fluoxetine Buprenorphine Morphine-3-8- Salicyclic acid
Heroin Butalbital glucuronide Secobarbital
(+/-)-11-Hydroxy- Caffeine Nalbuphine Temazepam
delta9-THC Cannabinal Nalorphine Tetracycline
isoproterenol Chlordiazepoxide Natrexone Tetrahydrozoline
Lormetazepam Chloroquine N-Desmethyl-cis Thioridazine
(+/-)-MDMA Cis-Tramadol tramadol Triazolam
(+)-Methamphetamine Citalopram HBr Codeine Neomycin Trimipramine
Morphine Clobazam Nitrazepam Venlafaxine
Naloxone Cocaine Hydrochloride Norbuprenorphine Verapamil
Niacinamide (-)-delta8-THC (-)-11-nor-9-Carboxy- EDDP Perchlorate
Narcodeine Cortisone delta 9-THC EMDP (-)Ephedrine
Norpropoxyphene (-)-delta9-THC Nordiazepam Hydrochloride Fentanyl
Orphenadine Desipramine (+/-)-Norketamine Flunitrazepam
Oxymorphone Diazepam Normorphine Flurazepam
Phenobarbital Digitoxin Norsertraline Gentisic acid
Promethazine Digoxin Nortriptyline Guaiacol glycer ester
Quetiapine fumarate Diphenhydramine O-Desmethyl-cis Hydrochlorothiazine
Ritalinic acid Doxepin tramadol Hydroxyzine
Sertraline Doxylamine succinate Oxazepam Hydrocodone
Theophyline Estazolam Oxcarbazepine Hydromorphone
Tyramino Ketamine Oxycodone Ibuprofen

FIN DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “RAPID MARIJUANA(THC) TEST”

21
PROCEDIMIENTOS DE LAVADO EN EL LABORATORIO

Algunos procedimientos inmunológicos requieren de una etapa denominada “lavado”. Este lavado tiene
como objetivo eliminar el exceso de moléculas (antígenos o anticuerpos) que no reaccionaron con los
componentes presentes en la fase sólida o bien con el componente particulado (dependiendo del tipo de
análisis efectuado). El proceso de lavado se asocia principalmente a las pruebas de ELISA, sin embargo,
todos los procedimientos basados en la reacción antígeno anticuerpo de fase sólida que tengan dos o
más pasos es probable que requieran de lavados.

La eliminación de los elementos que no reaccionaron con la fase solida se hace porque en etapas
posteriores se deben adicionar anticuerpos (como el anticuerpo secundario) que pueden específicos
contra una clase de inmunoglobulina. Como el suero humano posee grandes cantidades de anticuerpos,
si la placa no se lava o se realiza de forma insuficiente esos anticuerpos específicos contra una clase de
inmunoglobulina reaccionaran contra la presente en el suero provocando resultados falsos negativos en
casos de técnicas con punto de corte o resultados falsamente disminuidos en técnicas de cuantificación.

Imagen representativa que muestra que las técnicas de lavados ejecutadas de forma insuficiente pueden provocar
efectos como por ejemplo tener resultados de concentración falsamente disminuida o resultados negativos si se
trata de técnicas que aplican punto de corte. La fila superior muestra el ejemplo con una correcta ejecución de las
etapas de lavado, mientras que la final inferior muestra ejemplo que aplicaría a que no ocurra los lavados o bien
que sean de forma insuficiente. La insuficiencia de lavados provocará que los anticuerpos secundarios conjugados
con enzima mayoritariamente se unan a su blanco que están en la fase soluble y no en la fase sólida, por lo que,
en la siguiente etapa de lavado, esos anticuerpos secundarios se eliminarán provocando que, al revelar la
reacción, se produzca una formación de color baja de como debió haber sido realmente si se hubieran realizado
de forma correcta los lavados.

22
 La imagen representa el primer
paso de lavado de un protocolo de
ELISA. Primero se debe eliminar lo
que no reaccionó con la fase sólida.
Se recomienda que el contenido sea
eliminado en solución de hipoclorito
de sodio al 5%, especialmente si se
trata de patógenos trasmisibles*.

Al final de esta etapa quedará en la

fase solida los complejos antígenos
y anticuerpos que reaccionaron y se
requiere cuantificar, además de un
líquido remante que posee
moléculas que podrían reaccionar,
es por eso que se debe continuar
con el procedimiento de lavado.

Para diluir el contenido del líquido

remanente se debe completar el
volumen del pocillo con una
solución de lavado idónea. Luego
se debe esperar un tiempo para
para finalmente eliminar el nuevo
contenido del pocillo.
Nuevamente en la fase sólida
quedarán los complejos antígenos
y anticuerpos formados, además
de un líquido remante pero con
una concentración disminuida de
moléculas que podrían reaccionar.
Para asegurar una completa
eliminación de cualquier molécula
interferente para las reacciones
posteriores, se debe repetir 4
veces el procedimiento de la imagen.

El ejemplo de lavado de este caso corresponde a un lavado de placas de 96 pocillos similar al de la página
31. Puede tener leves modificaciones de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit utilizado

* Debe reposar en la solución mínimo 60 minutos antes de eliminar.

23
 CUANTIFICACIÓN POR ELISA

Hasta el momento se han estudiados técnicas inmunológicas que solo se limitan a indicar las presencia o
ausencia de alguna molécula o analito por encima de un valor establecido por el fabricante. Por otra
parte existen técnicas inmunológicas pueden cuantificar antígenos o anticuerpos de acuerdo a la
necesidad. Una de las técnicas mayormente usada hoy en día en la práctica clínica son las pruebas de
ELISA. El concepto ELISA es una sigla de Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, que en español significa
Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas.

Los inmunoensayos, incluyendo los inmunoensayos enzimáticos se puede categorizar de acuerdo si es o

no necesario separar los reactante unidos de los que están libres. Esta separación involucra los
conceptos de inmunoensayos homogéneos y heterogéneos. Les inmunoensayos heterogéneos
requieren de un paso para separar fiscalmente los analitos libres de los unidos. En estos casos el
antígeno o anticuerpos está unido por adsorción física. Cuando ocurre una unión específica, el complejo
queda unido a la fase sólida, requiriendo de un proceso simple de separación por medio de lavados. Los
inmunoensayos homogéneos por otra parte no requieren de pasos de separación. En estos casos el
marcaje unido al antígeno disminuye cuando se une un anticuerpo. Los ensayos homogéneos por lo
general involucran marcaje por enzimas, por lo que la enzima es inactivada cuando ocurre la unión del
anticuerpo. Los ensayos homogéneos son menos sensibles que los heterogéneos.

Los inmunoensayos heterogéneos a su vez se pueden separar en inmunoensayos de tipo competitivo y

no competitivos. Los inmunoensayos competitivos se basan en el principio inicial del
radioinmunoensayo en donde antígenos conjugados a enzimas compiten con antígenos sin conjugar del
paciente por los sitios de unión limitados de los anticuerpos unido a la fase sólida. Los inmunoensayos
no competitivos son más sensibles que los ensayos no competitivos y como su nombre ocurre la
reacción no está limitada por una cantidad limitante de molécula presente en la fase sólida. La mayoría
de los ensayos no competitivos comprenden a los ELISA de tipo indirecto, en el cual la molécula unida a
la fase solida corresponde a antígenos con el fin de buscar anticuerpos específicos para esa molécula en
el suero humano. Otro ensayo no competitivo se denominan ensayos de captura o a menudo
denominado como ELISA Sándwich donde la fase solida tiene unido anticuerpos de captura.

Clasificación de los Inmunoensayos en donde se encuentran clasificados las técnicas de ELISA.

24
ENSAYO POR INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (ELISA)

La técnica de ELISA se basa en dos fenómenos:

1. Alta especificidad de un anticuerpo por un antígeno (reacción inmunológica).
2. Amplificación por una reacción química desarrollada por una enzima actuando sobre un sustrato que
produce productos coloreados (reacción indicadora).

En el ELISA se combina la especificidad de reconocimiento de un antígeno por un anticuerpo, estando

uno de los componentes de la reacción conjugado a una enzima y otro adherido en el fondo de un
soporte sólido en forma de vaso. La enzima, en condiciones adecuadas de reacción, producirá el cambio
de color de un compuesto y este cambio puede cuantificarse mediante espectrofotometría.

La amplia utilización de ELISA desde su introducción por Avrameas y Uriel (1966) se debe a su alta
sensibilidad y especificidad, comparables a un radioinmunoensayo, con la ventaja adicional de no
requerir el manejo de isótopos radioactivos. Además, tiene la fortaleza de poseer un bajo costo relativo,
flexibilidad y la posibilidad de manejar un gran número de muestras en un corto tiempo. Actualmente se
encuentran en el mercado innumerables kits que utilizan esta técnica y permiten la cuantificación de
antígenos o anticuerpos en suero o plasma, con fines diagnósticos.

TIPOS DE ELISA
1. ELISA Directo
Es una forma simple de ELISA en donde el antígeno de interés se adhiere de forma pasiva al fondo de la
placa de poliestireno. Un paso posterior consiste en el lavado de la placa para eliminar el exceso de
elementos que no se adhirieron, para continuar agregando el un anticuerpo especifico contra el
antígeno de interés. Este anticuerpo tiene conjugado una enzima, con el fin de agregar un substrato
que será catalizado por dicha enzima y formará un producto de color. La cantidad de color es
directamente proporcional a la concentración del antígeno que se adhirió a la placa.

Esquema de los pasos de un ELISA directo

Este tipo de ELISA se usa también para detectar la respuesta inmune frente a diferentes patógenos. En
los kits comerciales los pocillos de ELISA ya están recubiertos de moléculas recombinantes del patógeno.
Los pasos posteriores involucran agregar la muestra a estudiar, eliminar el exceso no unido para finalizar
adicionando un anticuerpo anti clase de inmunoglobulina el cual está conjugado a enzima para revelar la
reacción. En este caso la cantidad de color es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos

25
frente al patógeno presente en esa muestra. Los ELISA directo hoy en día no se utilizan en la práctica
clínica por la cantidad de pasos y estandarización que requieren, por lo que han sido reemplazados por
los ELISA indirectos en los cuales ya se encuentran adheridos los antígenos de ciertos patógenos en la
placa y se busca anticuerpos específicos contra ese patógeno en suero humano.

2. ELISA tipo Sándwich

Para las técnicas de ELISA también se adopta el concepto Sándwich debido a que la molécula de interés
queda entre 2 capas de anticuerpos. También estos ensayos se conocen como ELISA de captura. En
estos ensayos el fondo de los pocillos de ELISA posee anticuerpos contra un epítope de la molécula de
interés. Paso seguido se agrega la muestra que debe poseer el antígeno de interés más un anticuerpo
contra otro epítope de la molécula a estudiar conjugado a una enzima. Se continúa eliminando el exceso
que no reaccionó para finalizar adicionando el substrato de la enzima y cuantificando el color generado
por espectrofotometría. En este ensayo la existe una relación directa entre la absorbancia cuantificada y
la concentración del antígeno de interés.

Esquema de los pasos de un ELISA tipo sándwich.

3. ELISA Indirecto
La denominación de indirecto radica en que existe el uso de un anticuerpo específico contra el antígeno
de interés sin conjugar a enzima. El revelado de la reacción se realiza usando un anticuerpo secundario
contra la clase de inmunoglobulina el cual está conjugado a una enzima, a la que se le agrega su sustrato
y se genera un producto de color cuantificable. Un ejemplo de este ensayo es la prueba de ELISA para el
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), la que en realidad cuantifica anticuerpos contra el VIH
(ensayo de tercera generación). El diagnostico indirecto de patógenos utilizan soportes que se basan en
la técnica de ELISA indirecto.

26
Esquema de los pasos de un ELISA indirecto para la detección de anticuerpos específicos frente a algún antígeno.

4. ELISA competitivo
Los ELISA de tipo competitivo se usan para antígenos de tamaño pequeño y que tiene un solo epítope.
Estos ensayos se basan en el uso de una cantidad contante del mismo antígeno que se cuantificará,
conjugado a una enzima. El fondo del pocillo de ELISA posee el anticuerpo específico para ese antígeno,
por lo que al incubar la muestra con el reactivo que posee el complejo antígeno-enzima, existirá una
competencia por la unión a los anticuerpos. Para finalizar se adiciona el substrato para la enzima y así se
formará el producto de color. Para los ensayos competitivos existe una relación inversa entre el color
producido y la concentración del antígeno a cuantificar.

Esquema de los pasos de un ELISA competitivo. El esquema muestra 2 casos, el primero cuando existe alta
concentración del antígeno a cuantificar, existe una baja producción de color. El segundo caso, cuando existe una
concentración baja de Ag. X, la señal de color producida al final es mayor

27
Entre las enzimas más utilizadas se encuentran:
1. Fosfatasa alcalina
Su sustrato es para-nitrofenil-fosfato y se lee a 405 nm
2. Peroxidasa
Sus sustratos son orto-fenilen-diamina/H2O2, 3,3´,5,5´-tetrametil-benzidina (TMB)/H2O2 y 2,2´-di-
azino(3-etilbenzotiazolina 6-ácido sulfónico (ABTS)/H2O2), cuyos productos poseen un máximo de
absorción de 492, 450 y 415 nm respectivamente.
3. Beta-galactosidasa.
Su sustrato es orto-nitrofenil-beta-D-galactopiranósido (oNPG), y se lee a 420 nm.

HORMONA ESTIMULADORA DE LA TIROIDES (TSH)

Las TSH es la hormona estimulante de la tiroides, es secretada por la adenohipófisis en respuesta a la
hormona TRH liberada por el hipotálamo. La TSH es un heterodímero compuesto de una subunidad α,
también conocía como subunidad glicoproteica α, y una subunidad β (β-TSH). La subunidad α es común
para hormonas como la TSH, FSH y LH, mientras que la subunidad β es específica para la hormona TSH.
Debido a esto es que las estrategias para cuantificar la hormona TSH usan anticuerpos conjugado con
enzima contra la β-TSH, mientras que para capturar a la hormona en la fase solida se usan anticuerpos
anti α-TSH. La hormona TSH puede ayudar al diagnóstico de hipotiroidismo, pero siempre se requerirá
de la cuantificación de las hormonas de la tiroides T3 y T4 para descifrar la dinámica hormonal y saber si
puede ser un caso de hipotiroidismo (TSH elevada) o hipertiroidismo (TSH baja).

Referencias
1. Dorresteyn Stevens C, Miller LE. Clinical Inmmunology ans Serology: A laboratory Perspective (2017).
fourth edition. F.A. Davis company, Philadelphia, PA, United States.
2. Endocrineweb. Understanding TSH Levels: Low to High. Disponible en:
https://www.endocrineweb.com/thyroid-what-are-t3-t4-tsh/high-low-tsh-levels

28
KIT: TSH (THYROTROPIN) - HUMAN
INICIO DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “TSH (Thyrotropin)”
TSH (Thyrotropin)
Prueba ELISA para la determinación cuantitativa de Tirotropina (TSH) en suero humano.

Utilidad
La tirotropina (TSH) es una hormona glicoproteínica de aprox. 28 kD, secretada por la glándula pituitaria anterior.
Es generalmente considerada el indicador más sensible, disponible, para el diagnóstico del hipotiroidismo primario
y secundario. El aumento de la concentración de TSH es un indicador sensible y temprano de disminución de la
reserva tiroidea y en conjunto con la disminución de la T4 se diagnostica hipotiroidismo primario. Se espera
incremento de TSH al demostrar la clásica retroalimentación negativa del sistema entre las glándulas tiroides y
pituitaria. Además, la determinación de TSH es útil en la diferenciación del hipotiroidismo secundario y terciario
de la enfermedad tiroidea primaria. En el hipotiroidismo secundario y terciario, las concentraciones de T4 son
usualmente bajas y los niveles de TSH son generalmente bajos o normales.

Principio
La prueba TSH ELISA de Human basa en la técnica clásica de sándwich. Es una prueba de segunda generación que
usa un anticuerpo monoclonal altamente específico anti-TSH que recubre la superficie de los pocillos de
poliestireno. En el primer paso de incubación las muestras problema, los calibradores o controles y el conjugado
enzimático (anti-TSH marcado con peroxidasa) se mezclan y se forma el complejo tipo sándwich el cual se une a la
superficie de los pocillos ya que son fijados por el anticuerpo inmovilizado. Al final de la incubación, el exceso de
conjugado enzimático es eliminado mediante una etapa de lavado. A continuación, se agrega el reactivo substrato
(segunda etapa) para peroxidasa y el color resultante, que se torna amarillo después de detener la reacción con la
solución stop, es medido espectrofotométricamente. La intensidad del color es directamente proporcional a la
concentración de TSH en la muestra.
La absorbancia de los calibradores y muestras es determinada mediante un lector de pocillos ELISA o sistemas
automático ELISA. La concentración es evaluada por medio de una curva de calibración que se realiza con los
calibradores entregados en el kit.

Reactivos y contenido
[MIC] 12 Tiras micropocillo (en portatiras)
Tiras divisibles en 8 pocillos, recubiertos con anti-TSH (monoclonal, ratón)
[CAL] A–F Calibradores
Tapas y etiquetas coloreadas (A: blanco, B: amarillo, C: verde, D: rojo, E: azul, F:
negro)
6 x 20 ml listos para usar (humanos)
Concentraciones de TSH: 0 (A), 0,5 (B), 3,0 (C), 6,0 (D), 15,0 (E) y 30,0 (F) mUI/l
[CON] 13 ml Conjugado enzimático (tapa blanca) pH 6,25 ± 0,1
Listo para usar, coloreado rojo
Anti TSH (cabra), marcado con peroxidasa
[WS][ 20X] 50 ml Solución de lavado (tapa blanca)
5102 Concentrado para 1000 ml pH 7,2 ± 0,2
Buffer TRIS 10 mmol/l
NaCl 8 g/l
[SUB] 13 ml Reactivo sustrato (tapa negra)
5103 Listo para uso, sin color a azulado. pH 3,6 ± 0,25
3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) 1,2 mmol/l
Peróxido de hidrógeno ≤ 6,0 mmol/l
[STOP] 15 ml Solución de parada (tapa roja)

29
5104 Ácido sulfúrico 0,5 mol/l
1 Tira adhesiva
Agentes preservantes: concentración total < 0,1%

Notas de seguridad
Todas las muestras de pacientes y CAL deberían ser manipulados como posibles agentes potenciales infecciosos.
CAL han sido encontrados negativos para HBsAg y anticuerpos contra VHC y VIH 1 + 2 en los donantes. Use ropa
protectora y guantes desechables según las buenas prácticas de laboratorio.

Todos los materiales contaminados con muestras o CAL deben inactivarse por métodos probados (autoclavado o
tratamiento químico) según las regulaciones aplicables.

Estabilidad
Los reactivos son estables hasta la fecha de expiración señaladas en las etiquetas individuales cuando se almacena
a 2 - 8ºC.
Después de abiertos, los reactivos deben almacenarse a 2 – 8 °C y utilizarse dentro de los siguientes 60 días (ver
“Nota”).

MIC (Código: TSH)

- Están selladas en un envase de aluminio con un desecante.
- Antes de abrir, las tiras deben estar a temperatura ambiente.
- Las tiras no utilizadas deben ser devueltas al envase con cierre y almacenadas con el
desecante. Las tiras almacenadas de esta manera a 2 – 8 °C pueden ser usadas hasta la fecha
de caducidad (ver “Nota”).
- No toque el borde superior o el fondo de los micropocillos con los dedos.

Preparación del reactivo

Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (15 - 25ºC) antes de usar. Los reactivos que no se están
en uso deberían siempre estar almacenados a 2 - 8°C.

Notas especales
Los reactivos de propósito general con las denominaciones WS 20x 5102, SUB 5103, STOP 5104 de diferentes lotes
y pruebas son intercambiables entre estos lotes y pruebas

Solución de lavado de trabajo WASH

- Diluya una porción de WS 20X con 19 porciones de agua desionizada fresca, por ejemplo: 50
ml de WS 20X + 950 ml = 1000 ml.
- Estabilidad: 60 días a 15-25 °C

Muestra
Suero
No usar muestras hiperlipémicas o hemolizadas.
Las muestras pueden ser almacenadas por 5 días a 2 - 8°C, o por hasta 30 días a -20°C. Congele y descongele una
sola vez. Al descongelar una muestra debe ser homogeneizada. Elimine el material particulado por filtración o
centrifugación.

Procedimiento de la prueba:
Sigua el procedimiento tal cual como se describe.

30
Notas de uso
U1 No mezcle o usar componentes de diferente número de lote. No mezcle tapas de envases
(riesgo de contaminación). No use reactivos después de su fecha de expiración.
U2 No use reactivos que pueden ser contaminados o que tienen aspecto diferente o huelen
diferente de lo normal.
U3 Registrar la distribución de CAL, las muestras o controles en la hoja de registros.
U4 MIC – Saque el número necesario y colóquelos firmemente en el portatiras.
U5 Analice cada CAL, control o muestra por duplicado; pipetéelos en el fondo de los
micropocillos.
U6 Siempre deben agregarse los reactivos en el mismo orden y tiempo para minimizar
diferencias en los tiempos de reacción entre los micropocillos. Es importante para obtener
resultados reproducibles. El pipeteo de las muestras no debería exceder los 10 minutos. De
lo contrario pipetée la curva CAL en las posiciones indicadas en la mitad del intervalo de la
serie. Si se emplea más de una placa, repita la curva de calibración para cada placa.
U7 Evite/remueva burbujas de aire antes de las incubaciones y lecturas de absorbancia.
U8 El reactivo SUB inicia y STOP termina la reacción cinética. Evitar la luz intensa durante el
desarrollo del color.
U9 MIC - Después de cada pipeteo agitar suavemente el portatiras durante 20-30 segundos
sin verter las soluciones, para asegurar una buena mezcla. Si está disponible, mezcle en una
mezclador de pocillos.

Procedimiento de lavado
El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente producirá una mala precisión, o absorbancias
falsamente elevadas.

L1: Remueva las tiras adhesivas y aspire el contenido, agregue WASH, aspire después de
aproximadamente 30 segundos de enjuague y repita el lavado 4 veces más.
L2: En el caso de lavadores automáticos, se deben llenar y enjuagar con WASH y después lavar
los pocillos 5 veces. Asegúrese que el lavador llene los pocillos completamente y aspire
eficientemente después de 30 segundos (líquido remanente < 15 µl).
L3: Después del lavado, remueva el líquido remanente invirtiendo los micropocillos sobre papel
absorbente.

Esquema de pipeteo
Los reactivos y las muestras deben estar a temperatura ambiente antes del uso.
Etapa 1 Pocillo (µl)
Calibradores Muestras
CAL A al F; en duplicado 50 --
Muestras o controles en duplicado -- 50
CON 100 100
Mezcle y cubra MIC con tira adhesiva
Incubar por 60 minutos a 20-25°C.
Lavar 5 veces como se describe (ver L1 – L3)
WASH 300 300

31
 Etapa 2
SUB 100 100
Incubar por 15 minutos a 20-25°C (ver U8)
STOP 100 100
Mezclar cuidadosamente
Medir la absorbancia a 450 nm lo más pronto posible o dentro de 30 minutos después de
terminar la reacción usando una longitud de onda de referencia de 630-690 nm (si está
disponible).

Validación de la prueba
Los resultados de la prueba son válidos si cumple los siguientes criterios:

La absorbancia media (DO) de CAL F es mayor o igual a 1,2

La diferencia entre los duplicados de CAL F no excede de un 10%

Cálculos
Grafique las absorbancias medidas contra las concentraciones de CAL en papel milimetrado lineal. La interpolación
apropiada de los puntos medidos graficados da lugar a una cura de calibración desde la cual puede determinarse
la concentración del analito en la muestra.
Para calcular las concentraciones del analito, seleccione una opción apropiada y validada para el cálculo de la
curva (recomendación: punto a punto)

Control de calidad
Según las buenas prácticas del laboratorio deben analizarse controles con cada curva de calibración. Para asegurar
el funcionamiento adecuado de la prueba, debe efectuarse un número estadísticamente significativo de controles
para establecer los valores medios y rangos aceptables. Las muestras de control de calidad deben analizarse según
las regulaciones locales. Los resultados deben estar dentro de los rangos establecidos.

Interpretación de los resultados:

La concentración de TSH en el suero es dependiente de una diversidad de factores: función del hipotálamo,
función de la tiroides, y la respuesta de la pituitaria a TRH. Así, la concentración de la tirotropina por sí sola no es
suficiente para llegar a un diagnóstico definido. TSH puede estar elevada por acción farmacológica.
Domperiodona, amdazona, yodo, fenobarbital, y fenitoína han sido reportadas que incrementan los niveles de
TSH. Una disminución de TSH ha sido reportada con la administración de propanolol, dopamina, metimazol y D-
tiroxina. Variaciones genéticas o degradación de TSH en las subunidades puede afectar las uniones características
de los anticuerpos e influir en el resultado final. Tales muestras normalmente dan diferentes resultados con varias
técnicas debido a la reactividad de los anticuerpos involucrados.

Valores Esperados
Valores de referencia de una población eutiroidea:
Valores de Referencia: 0,3 – 4,0 mUI/l TSH

Cada laboratorio debe determinar sus propios rangos de referencia utilizando los instrumentos/equipos, métodos
de colección de sangre y técnicas de análisis usuales empleados normalmente en dicho laboratorio.

Características de la ejecución
La prueba TSH ELISA como análisis de la segunda generación tiene una sensibilidad analítica de < 0,10 mUI/ml TSH
y puede por lo tanto distinguir la población hipertiroide de la población eutiroide.

32
El análisis se estandarizó según el estándar OMS 2° IRP (80/558) ara TSH.
Las características de ejecución de la prueba pueden consultarse en el informe de verificación accesible vía:
www.human.de/data/gb/vr/el-tsh.pdf o
www.human-de.com/data/gb/vr/el-tsh.pdf
Si no puede acceder a las características de la ejecución de vía internet, póngase en contacto con su distribuidor
local quien se las proporcionará sin costo alguno.

Nota
Los componentes del estuche son estables hasta la fecha de caducidad aun después de abiertos. Sin embargo, la
posibilidad de una contaminación está directamente relacionada con el número de usos del reactivo. Por lo tanto,
el límite de 60 días en viles abiertos se fijó por razones de seguridad.
La manipulación debería siempre estar de acuerdo con las venas prácticas de laboratorio*. ¡Los criterios de
validación del análisis deben cumplirse siempre!

* Esto incluye: coloque la tapa debida en el vial y ciérrelo firmemente / saque de los viales de stock solamente los
reactivos necesarios para la corrida si entran en contacto con otras soluciones contaminantes como son las
muestras, etc. / Las soluciones de stock siempre deben regresarse a 2 - 8 °C si no se usan.

Referencias
1. Barker, S.B. (1948) Determination of Protein Bound Iodine. J Biol Chem 173-175.
2. Chopra I. et al. (1971), J Clinical Endocrinol 33: 865
3. Young, D. S. (1971). Clin Chem 21: 3660.
4. Sterling L. Diagnosis and treatment of thyroid disease (1975), Cleveland CRC Press, p. 19 – 51.
5. Demers L.M. et al. NACB Laboratoy medicina practice guidelines (2002), Laboratory support for the diagnosis of
thyroid disease 13: 33
6. Kratzch, J. (2005). Clin Chem 51: 1948.

FIN DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “TSH (Thyrotropin)”

33
 ANOTACIONES PARA IDENTFICACION DE POCILLOS DE ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

H
34
 Papel milimetrado para graficar Curva de Calibración

0 5 10 15 20 25 30 35
TSH (mUI/L)

35
 DETECCIÓN DE INDIRECTA DE PATÓGENOS

La detección indirecta de patógenos hace referencia a la respuesta inmune humoral que este
desencadena en el huésped. El objetivo de estas técnicas es detectar la presencia de anticuerpos
específicos contra el agente patógeno, ya sean IgG o IgM. Se buscan anticuerpos específicos de clase IgM
ya que son los primeros en aparecer durante la respuesta inmune, por lo que son indicadores de
infección reciente o aguda, en cambio la determinación de anticuerpos de clase IgG, indican infecciones
pasadas, debido a que esta clase de anticuerpos aparecen en respuestas inmunes tardías y puede
perdurar durante años.

Existen diversas técnicas para detectar la respuesta inmune pero las pruebas en fase sólida son las más
usadas hoy en día. Las pruebas fase sólida, aplicadas a este caso en particular, se caracterizan porque
pueden cuantificar anticuerpos, sin embargo, la utilidad de estas determinaciones se basa en su
sensibilidad, ya que finalmente se necesita de establecer si la persona posee niveles realmente elevados
de esos anticuerpos. De todas las pruebas de fase sólida, las pruebas de ELISA son las mayormente
usadas.

ELISA EN DETECCION INDIRECTA DE PATOGENOS

Los ELISA para la detección indirecta de patógeno son de preferencia la variante indirecta. Los ELISA
indirecto ya tienen depositados los antígenos del patógeno en el fondo del pocillo (directamente o de
forma recombinante), por lo que al agregar la muestra sospechosa de infección que posee anticuerpos
específicos, ocurre la unión antígeno-anticuerpo. Dependiendo si se desea buscar anticuerpos de clase
IgG o IgM, se agrega un anticuerpo secundario contra la clase de la inmunoglobulina a detectar, el que
está conjugado a una enzima. Gracias a la enzima presente, se debe agregar su substrato para que esta
forme un producto de color, cuya intensidad es proporcional a los niveles de anticuerpos específicos que
se unieron a los antígenos depositados en los pocillos.

Si bien con ELISA se pueden cuantificar los niveles de anticuerpos frente a patógenos, su utilidad radica
en la sensibilidad que posee la técnica para detectar cantidades pequeñas de los anticuerpos. Esta
cuantificación no se traduce en unidades convencionales de medida como mg/dl o UI/ml, si no en poder
determinar puntos de corte para saber si una persona realmente está produciendo anticuerpos en
respuesta al patógeno o no.

Los puntos de corte son exclusivos para cada metódica y dependen de que se esté midiendo y la unidad
de medida. Para poder determinar un punto de corte de una metódica se requiere de estudios
poblacionales: Las personas ya están catalogadas como “sanas” o “enfermas” por medio de la mejor
metódica existente (Gold standard). A estas personas se les realiza la medición con la metódica en
estudio para establecer su punto de corte, obteniendo diferentes resultados. Con los datos obtenidos y
por medio de algoritmos, se puede establecer el punto de corte. A continuación, se muestra la figura de
distribución de los datos del denominado “punto de corte ideal”.

36
Gráfico de distribución de datos de una metódica para detectar punto de corte en individuos sanos o enfermos. Esta figura
representa a un punto de corte idea en el cual los valores menores serían los individuos sanos y los mayores o iguales al punto
de corte, serían los individuos enfermos.

Lamentablemente en sistemas biológicos el punto de corte ideal es falso y siempre habrá algún grado de
incertidumbre en valores cercanos a este punto. El grado de incertidumbre generalmente se denomina
como zona gris y representa al sector del gráfico donde se solaparían los resultados obtenidos entre
individuos sanos y enfermos.

Gráfico de distribución de datos de una metódica para detectar punto de corte en individuos sanos o enfermos. La figura
muestra que en el punto de corte pueden existir tanto individuos sanos como enfermos. Estos datos solapados o de
incertidumbre se denominan como zona gris. Los segmentos que continúan con la zona gris se pueden considerar como
individuos verdaderamente sanos y verdaderamente enfermos.

La explicación anterior de puntos de cortes se puede aplicar al estudio de patógenos de forma indirecta,
en donde los individuos sanos serían personas que poseen ciertos niveles de los anticuerpos a detectar,
pero esos niveles son normales y pueden aparecer por inmunizaciones normales, vacunas, reacciones
cruzadas, niveles de lectura de equipo etc. Para este caso los individuos enfermos son los que poseen
niveles realmente elevados esos anticuerpos producto de una infección por el patógeno.

Desde un punto de vista práctico, los kits de detección en base a puntos de corte en ELISA, incluyen
controles positivos y negativos con los cuales se puede calcular el punto de corte intra-ensayo junto con
su respectiva zona gris. Si un resultado aparece en la zona gris, no puede ser validado como positivo o
negativo (enfermo o sano respectivamente) y se recomienda realizar la detección en días posteriores a la
medición y en paralelo a la muestra a analizada. Con esta segunda medida se espera obtener un
resultado concluyente.

37
Las metódicas como ELISA, que tienen la capacidad de lograr cuantificaciones, se puede utilizar el
lenguaje de positivo y negativo, ya que se pueden generar puntos de corte en las absorbancias
determinadas. Con este punto se podría determinar los resultados positivos y negativos, sin embargo, los
términos correctos a utilizar son resultados “reactivos” y “no reactivos”, debido a que si se está
determinando la presencia de anticuerpos contra un patógeno, solo se observa la “reacción” de los
anticuerpos de la muestra con los antígenos depositados en los pocillos y en ningún caso puede asegurar
en un 100% que la persona presente el patógeno en el momento. Además, existe una tercera opción a
parte de resultados “reactivos y “no reactivos”, se trata de resultados “indeterminados” que son lo que
tienen medidas contempladas dentro de la zona gris.

SEROLOGÍA

La serología se refiere a pruebas de laboratorio que buscan anticuerpos específicos en suero. Para el
diagnóstico de patógenos, la serología se refiere a la búsqueda de anticuerpos específicos contra algunos
antígenos de esos patógenos.

Desde el punto de vista de la respuesta inmune generalmente la dinámica entre presencia de

anticuerpos clase IgM e IgG puede indicar una exposición reciente o previa respectivamente a algún
patógeno. Además, la medición de los títulos de esos anticuerpos puede ser útil para medir reactivación
o reexposición al agente patógeno. El uso de la serología para el diagnóstico de infección por
microorganismos tiene la desventaja que existe un periodo de ventana entre que comienza la infección y
se producen anticuerpos. La IgM por lo general aparece rápidamente entre el día 7 a 10 después de
exposición, pero podría ser un problema esperar esos días en casos de infecciones con cuadros clínicos
de curso rápido que requieran iniciar pronto su terapia.

Tabla. Presencia de anticuerpos clase IgM e IgG contra patógenos y su interpretación general
Anticuerpos clase IgM Anticuerpos clase IgG Interpretación
• Ausencia de infección por el patógeno
No reactivo No reactivo investigado
• Periodo de ventana inicial
• Diagnóstico de infección por patógeno en
Reactivo No reactivo
etapa temprana de la infección primaria
• Memoria inmunológica frente al patógeno
No reactivo Reactivo
investigado
• Periodo avanzado de infección primaria
Reactivo Reactivo
• Reinfección

La explicación de la dinámica de los anticuerpos clase IgM e IgG se debe a las fases de la respuesta
inmune normal donde los primeros anticuerpos secretados son clase IgM. Posteriormente cuando la
respuesta se especializa, se producen eventos de hipermutación somática y también cambio de clase, en
el cual la célula productora de anticuerpos secretará anticuerpos clase IgG.

38
Dinámica de anticuerpos IgM e IgG frente a un proceso infeccioso. El predominio de anticuerpos clase IgG em la
respuesta inmune tardía se debe a eventos de cambio de clase en donde la célula B deja de producir anticuerpos
clase IgM y produce anticuerpos clase IgG.

El problema del diagnóstico inicial en base a IgM tiene dificultas porque estos anticuerpos, luego de una
infección reciente, pueden mantenerse detectables por meses, hasta por un año o más. En algunos
casos, la demostración de un título alto de anticuerpos IgG en la etapa inicial de la infección es
diagnóstico; sin embargo, el título alto puede deberse a una infección anterior (memoria inmunológica) y
los síntomas del paciente pueden tener una causa completamente diferente. Cuando se analiza la
presencia de anticuerpos IgG, es ideal recolectar muestras de suero durante las fases aguda y
convaleciente de la enfermedad para que se pueda observar un título creciente del patógeno
sospechoso. Otra limitación de la serología es que los pacientes inmunodeprimidos pueden ser incapaces
de generar una respuesta de anticuerpos.

Para solucionar problemas de solapamiento de la producción de anticuerpos IgG e IgM para diagnóstico
se puede hacer determinando la avidez de IgG. La "Avidez" se expresa como la fuerza de unión de un
antisuero con un antígeno multivalente. Ella incrementa con el tiempo de la estimulación antigénica.
Este término se debe distinguir de la "Afinidad" de un anticuerpo, el cual se refiere a la unión de un
anticuerpo con un antígeno monovalente.

39
La prueba de avidez IgG utiliza un agente desestabilizante de puentes de hidrógeno, como la Urea. La
Urea se usa para disociar la unión entre las IgG específicas y el antígeno, de tal forma que en infecciones
recientes las IgG de baja avidez son casi totalmente disociadas del complejo antígeno-anticuerpo,
mientras que en infecciones crónicas las IgG de alta avidez permanecen mayormente unidas a los
antígenos.

TABLA. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE

AVIDEZ DE IgG
Avidez Resultado interpretación
<40% Baja avidez Infección
reciente (< 3
semanas)
40 – 60% Zona gris No se puede
interpretar
>60% Alta avidez Infección
pasada

Principio e interpretación de la técnica de avidez de IgG para detección indirecta de patógenos. A la izquierda se observa el
principio de la técnica y el rol de la urea en disociar uniones débiles que ocurren en etapas tempranas de infección. A la
derecha se observan valores para interpretar la prueba.

Considerando los resultados de avidez la dinámica de diagnóstico indirecto de patógenos quedaría de

acuerdo a la siguiente tabla:

Tabla. Utilidad de la determinación de la avidez de IgG para diferencias diferentes etapas de una
infección
Anticuerpos clase Anticuerpos clase Avidez IgG Interpretación
IgM IgG
• Ausencia de infección por el
No reactivo No reactivo No aplica patógeno investigado
• Periodo de ventana
Reactivo No reactivo No aplica • Infección primaria
Reactivo Reactivo Baja avidez • Infección primaria
Reactivo Reactivo Alta avidez • Reinfección

40
VARICELA

La varicela es una enfermedad aguda benigna causada por el Virus Varicella Zoster (VVZ). El VVZ
pertenece a la subfamilia Alphaherpesvirinae. Se trata de virus neurotrópicos que infectan
exclusivamente al ser humano. La infección primaria causa varicela, entidad altamente contagiosa que se
transmite por contacto directo a través de aerosoles de secreciones respiratorias. Afecta
primordialmente a niños de 1 a 9 años; sin embargo, se puede presentar en adultos. La enfermedad es
autolimitada y moderada en niños. En adultos la infección es más severa con mayor compromiso
cutáneo y fiebre prolongada. Se diagnostica clínicamente por fiebre y lesiones cutáneas caracterizadas
por máculas, pápulas y vesículas, así como por lesiones en mucosas.

La varicela ha sido considerada una enfermedad propia de la infancia, habitualmente benigna; no

obstante, a menudo se presentan complicaciones. La más frecuente es la infección de piel y tejidos
blandos, que por lo general resulta del rascado constante de las lesiones. Otras complicaciones incluyen
neumonía, encefalitis, cerebelitis y coagulopatías, que requieren hospitalización. Se informan tasas de
complicaciones que van de 40,7 a 83,3%, así como de mortalidad de 2 a 3 por cada 100 000 enfermos en
los distintos hospitales, principalmente pediátricos. La razón de que las complicaciones sean más
comunes en pacientes pediátricos se debe a que en varios países no se cuenta con indicación de
vacunación universal. Después de un cuadro de varicela como primoinfección, el VVZ permanece latente
en las neuronas de los ganglios de las raíces dorsales, los ganglios autónomos (incluyendo intestinales) y
los nervios craneales. Este fenómeno de latencia se debe a que, de los 71 genes del virus, únicamente se
transcriben seis, lo que no permite que exista replicación y, por consiguiente, no se presenta efecto
citopático. Una alteración de la respuesta inmunitaria o la edad avanzada favorecen la reactivación del
VVZ, que, al replicarse, condiciona la aparición de herpes zóster.

La infección primaria produce anticuerpos IgG, IgM e IgA anti VVZ, los cuales se unen a proteínas virales,
principalmente glicoproteínas, proteínas reguladoras y estructurales y enzima virales. Los anticuerpos
clase IgM disminuyen dentro de pocos meses, pero los anticuerpos IgG persisten por años después de la
infección primaria, lo cual demuestra la respuesta inmune prolongada anti VVZ que posee nuestro
organismo.

Para el diagnóstico de infección aguda por VVZ se debe estudiar el incremento significativo de
anticuerpos clase IgM y/o IgG anti VVZ. Los anticuerpos clase IgM anti VVZ debe ser usado
cuidadosamente, debido a que pueden carecer de sensibilidad y especificidad en este caso en especial;
Se han observado falsos positivos de anticuerpos clase IgM cuando existen títulos muy altos de
anticuerpos clase IgG. Este falso positivo no se refiere a que exista infección contra otro virus, si no que
probablemente el incremento de IgM se deba a una reactivación de una infección latente, por lo que la
elevación o positividad a anticuerpos anti VVZ IgM por sí solo no puede diferenciar de una infección
primaria o recurrente. Sin embargo, la probabilidad que se trate de una reactivación del virus es baja,
debido a que se necesita que el paciente tenga una inmunodepresión para que el virus se pueda
reactivar. De todos modos, lo más correcto sería diagnosticar infección por VVZ detectando anticuerpos
específicos de clase IgM e IgG. Una posible opción de falso positivo de anticuerpos anti VVZ IgM, se
puede deber a la existencia de títulos muy altos de IgG anti VVZ, debido a una concentración elevada de
VVZ en donde funcionan en paralelo la respuesta inmune adaptativa e innata.

41
Los inmunoensayos enzimáticos para determinar anticuerpos anti VVZ son altamente específicos y
generan pocos resultados falsos positivos, pero no son tan sensibles como el ensayo de antígeno de
membrana por anticuerpo fluorescente u otro método asociado a investigación.

Referencias:
1. Arvin A, 1996. Clinical Microbiology Reviews 9(3): 361-381.
2. Rodriguez M, Graciano S, Anaya J, Pizzariello, 2005. Arch Agent Dematol 55: 183-187.
3. MBL Lifescience. Structure and characteristics of antibody isotypes. Disponible en
https://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/antibody-isotype.html
4. Dorresteyn Stevens C, Miller LE. Clinical Inmmunology ans Serology: A laboratory Perspective (2017).
fourth edition. F.A. Davis company, Philadelphia, PA, United States.

42
KIT: VZV IgM - HUMAN
INICIO DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “VZV IgM"
VZV IgM
Prueba ELISA para la detección de anticuerpos IgM contra Varicela Zoster Virus en suero humano

Uso esperado
La prueba ELISA VZV IgM está destinada a la detección de anticuerpos clase IgM contra el virus varicela
zoster en suero humano. El cuerpo humano es el único reservorio conocido para VZV. Aproximadamente
3 millones de casos de varicela ocurren anualmente. La enfermedad en niños tiene generalmente un
curso benigno. Típicamente se presenta con fiebre, malestar, y erupción generalizada en la piel. En
adultos la infección es más severa que en la infancia, siendo la neumonitis a varicela una importante
preocupación.
Shingels (zoster) es también un desorden comúnmente causado por VZV, con aproximadamente un 10%
de la población general afectada en alguna oportunidad. La serología provee una herramienta
diagnóstica rutinaria y es también utilizada para monitorear el progreso de la infección.

Principio - EIA clásico -

La prueba HUMAN ELISA VZV IgM está basada en la clásica técnica ELISA. Los micropocillos ELISA son
recubiertos con antígenos VZV (VZV-Ag) derivados de cultivos celulares. En la primera etapa de
incubación, los anticuerpos contra VZV (anti-VZV-Ac) contenidos en la muestra o controles se fijan
específicamente a los antígenos inmovilizados. El buffer de dilución contiene anti IgG humana para
prevenir interferencia por Factor Reumatoide y competencia de IgG específica presente en la muestra. Al
final de la incubación, los componentes excesivos son eliminados por lavado. En la segunda etapa de
incubación, se añade un conjugado anti-IgM (anticuerpos anti-IgM-humana, marcados con peroxidasa)
que se fija específicamente a los anticuerpos IgM. Se forman inmunocomplejos típicos. Después de
eliminar el conjugado excesivo por lavado (segunda etapa de lavado) y añadir TMB/Substrato (etapa 3),
se forma un color azul que se transforma a amarillo después de parar la reacción. La intensidad de este
color es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos anti-VZV IgM en la muestra.

Reactivos y contenidos
[MIC] 12 Micropocillos en portatiras
(Código VZV M)
Tiras (desprendibles) de 8 micropocillos cada uno, recubiertas con antígeno
VZV (derivados de cultivo celular)
[NC] 2,5 ml Control VZV IgM negativo (tapa verde)
listo para el uso, humano
[PC] 2,5 ml Control VZV IgM positivo (tapa roja)
listo para el uso, humano
[DIL-M] 100 ml Buffer de dilución IgM (tapa azul)
5111 listo para el uso, color verde pH 6,5 ± 0,2
Buffer Fosfato 10 mmol/l
NaCl 8 g/l
Albúmina 10 g/l

43
 Anti-IgG humana (oveja)
[CON] 12 ml Conjugado Anti IgM (tapa blanca)
listo para el uso, color rojo
Anticuerpos anti-IgM-humano, marcados con peroxidasa
(conejo)
[WS][20X] 50 ml Solución de lavado (tapa blanca)
5102 Concentrado para aprox. 1000 ml pH 7,2 ± 0,2
Buffer TRIS 10 mmol/l 10 mmol/l
NaCl 8 g/l 8 g/l
[SUB] 13 ml Reactivo Substrato (tapa negra)
5103 listo para el uso, sin color a azulado pH 3,7 ± 0,2
3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) 1,2 mmol/l
Peróxido de Hidrógeno 3 mmol/l
[STOP] 15 ml Solución de parada (tapa roja)
5104 Ácido sulfúrico, listo para el uso 0,5 mol/l
2 Tiras adhesivas
Preservantes: Concentración total < 0,1%

Material suplementario recomendado pero no provisto en el estuche

Micropipetas, lavadora ELISA, lector de microplaca equipado con filtro 450 nm o con filtros 450/630–690
nm, agua desionizada.

Estabilidad
Los reactivos son estables hasta las fechas de caducidad señaladas en las etiquetas individuales cuando
se almacenan a 2...8°C. Después de abierto los reactivos deben almacenarse a 2...8°C y utilizarse dentro
de 60 días.

[MIC] (Código VZV M)

- están envasadas en bolsas de aluminio selladas con un desecante
- deben estar a temperatura ambiente antes de abrir
- no utilizados: devolver junto con el desecante en las bolsas de aluminio y almacenar de 2...8°C.
- No tocar el borde superior o el fondo de los micropocillos con los dedos.

Preparación de reactivos
Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (15...25°C) antes del uso. Los reactivos que no
están en uso deben siempre estar almacenados a 2...8°C.

Notas especiales
Los reactivos de propósito general con las denominaciones [DIL-M] 5111, [WS] 5102, [SUB] 5103, [STOP]
5104 de diferentes lotes y pruebas son intercambiables entre estos lotes y pruebas. Para análisis IgM
usar solamente Buffer de Dilución IgM [DIL-M] 5111.

44
Todos los demás reactivos son específicos para los lotes individuales y no deben ser intercambiados con
otros lotes u otras pruebas. Ningún reactivo de otra procedencia debería utilizarse junto con los
reactivos de este estuche.

Solución de lavado de trabajo [WASH]

- Diluir 1 porción de [WS]20x] 5102 con 19 porciones de agua desionizada fresca, por ejemplo: 50 ml
[WS]20x] 5102 + 950 ml = 1000 ml.
- Estabilidad: hasta 60 días a 15...25°C.

Muestra
Suero
No usar muestras altamente lipémicas o hemolíticas.
Muestras pueden almacenarse hasta por 7 días de 2...8°C o por más largo tiempo a -20°C. Congelar y
descongelar solamente una vez. Al descongelar una muestra debe ser homogeneizada. Eliminar el
material particulado por centrifugación o filtración.

Procedimiento
Seguir el procedimiento exactamente como se describe.

Notas de uso
U1: No mezclar tapas de envases (riesgo de contaminación). No usar reactivos después
de sus fechas de caducidad.
U2: No usar reactivos que pueden ser contaminados (turbidez u olor).
U3: Notar el reparto de las muestras y de los controles cuidadosamente en la hoja
provista en el estuche.
U4: [MIC] – colocar el número requerido firmemente en el portatiras.
U5: U5: Analizar los controles en duplicado. Pipetear los controles y las muestras en el
fondo de los micropocillos.
U6: Siempre deben agregarse los reactivos en el mismo orden para minimizar
diferencias en los tiempos de reacción entre los micropocillos y obtener resultados
reproducibles. El pipeteo de las muestras no debería exceder de 5 minutos para
evitar diferencias en los tiempos. De lo contrario pipetear los controles en las
posiciones indicadas en la mitad del intervalo de la serie. Si se emplea más de una
placa, repetir los controles.
U7: Remover burbujas de aire antes de las incubaciones y lecturas de absorbancia.
U8: Incubar [SUB] en la oscuridad. [SUB] inicia y [STOP] termina la reacción enzimática.
U9: [DIL-M] – Turbidez, luego de la adición del suero, no interfiere con el resultado
U10: Cierre firmemente los viales con las tapas respectivas después del uso.

Procedimiento de lavado
El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente producirá una mala precisión o
absorbancias falsamente elevadas.
L1: Remover las tiras adhesivas, aspirar el contenido (en un envase con solución de Hipoclorito de Sodio
al 5%), agregar [WASH], aspirar después de aproximadamente 30 sec. y repetir el lavado 3 ó 4 veces.

45
L2: En el caso de lavadores automáticos, se deben llenar y enjuagar con [WASH] y después lavar los
pocillos 4 ó 5 veces con [WASH]. Asegurarse que los pocillos son llenados completamente y espirados
después de 30 sec. (Líquido remanente: < 15 μl).
L3: Después del lavado, remover el líquido remanente invirtiendo los micropocillos sobre papel
absorbente.

Esquema de pipeteo
Los reactivos y las muestras debería estar a temperatura ambiente antes del uso
Preparación de muestras:
Diluir el suero del paciente 1 + 100 con [DIL-M] 5111, por ejemplo 10 µl de suero + 1 ml
de [DIL-M] 5111 y mezclar vigorosamente, ver U9.
Incubar las muestras diluidas antes del uso por lo menos 5 minutos.
Las muestras diluidas se pueden almacenar hasta 24 horas entre 2 – 8 °C.
Los controles están listos para usar.
Etapa 1 Pocillo (µl)
A1 B1/C1 D1/E1 F1…
Blanco [NC] [PC] Muestra
[NC] en duplicado -- 100 -- --
[PC] en duplicado -- -- 100 --
Muestra diluida -- -- -- 100
Cubrir [MIC] con tiras adhesivas
Incubar por 30 minutos a 17 – 25 °C
Lavar 4 veces como se describe (ver L1 – L3)
[WASH] 350 350 350 350
Etapa 2
[CON] -- 100 100 100
Cubrir [MIC] con tiras adhesivas
Incubar por 30 minutos a 17 – 25 °C
Lavar 5 veces como se describe (Ver L1 – L3)
[WASH] 350 350 350 350
Etapa 3
[SUB] 5103 100 100 100 100
Incubar por 15 minutos a 17 – 25 °C
[STOP] 5104 100 100 100 100
Mezclar cuidadosamente
Llevar a cero de absorbancia el instrumento lector de ELISA con el blanco de subtrato del
pocillo A1.
Medir la absorbancia a 450 nm usando una longitud de onda de referencia de 630 – 690
nm (si está disponible), lo más pronto posible o dentro de 30 minutos.

La absorbancia de los controles y muestras se determina haciendo uso de un lector de micropocillos

ELISA o sistemas completamente automatizadas (p.ej. instrumentos de las líneas HumaReader o ELISYS
de HUMAN). Los resultados de los pacientes se obtienen por comparación con un valor de punto de
corte (cut-off value).
46
Cálculos de valores de control y punto de corte (Cut-off)
Valores promedio de Absorbancia del [NC] en pocillos B1 y C1 (MNC) y del [PC] en pocillos D1 y E1 (MPC)
se calculan de acuerdo a:

A450 (B1)+ A450 (C1) A450 (D1) + A450 (E1)

MNC = ; MPC =
2 2

El punto de corte o valor cut-off (COV) se calcula usando la fórmula:

COV = MNC + (0,2 x MPC)

La serie analítica puede considerarse válida si se cumple con los siguientes criterios:
1. Blanco substrato en pocillo A1 < 0,150
2. MNC ≤ 0,250
3. MPC ≥ 0,400
4. MPC : MNC ≥ 3

Interpretación de resultados
A450 (paciente) > COV + 15%: Ac anti-VZV-IgM positivo
A450 (paciente) < COV - 15%: Ac anti-VZV-IgM negativo

Debido a variaciones fisiológicas y analíticas los resultados de los pacientes un 15% arriba o abajo del
valor calculado como cut-off son equívocos. Es recomendable medir estas muestras en paralelo con una
muestra fresca tomada de 7 a 14 días después cada una en duplicado. El cambio de la concentración
específica de anticuerpos deberá ser evaluado, si es necesario, tomando en cuenta la concentración
específica de IgG (HUMAN ELISA IgG), la anamnesis del paciente, así como los resultados de más
exámenes.

Si los resultados son repetidamente reactivos o equívocos, las muestras pueden ser sometidas a un
análisis de confirmación. Debido a reactividad serológica cruzada entre VZV and Herpes Simplex virus, y
por posible reactivación de una infección latente a VZV, causada por una infección con virus Epstein Barr,
resultados positivos IgM puede aparecer en el suero de pacientes con infección debido a otros miembros
de la familia Herpes viridae. Debería investigarse la posibilidad de infección con otros agentes
patógenos.

Características de la ejecución
Los datos de rendimiento típicos se encuentran en el Verification Report que está disponible en
www.human.de/data/gb/vr/el-vzvm.pdf o
www.human-de.com/data/gb/vr/el-vzvm.pdf.

Si no puede acceder a las características de la ejecución vía internet, póngase en contacto con su
distribuidor local quien se las proporcionará sin costo alguno.

Nota

47
Los componentes del estuche son estables hasta la fecha de caducidad aún después de abiertos. Sin
embargo, la posibilidad de una contaminación está directamente relacionada con el número de tomas
del reactivo. Por lo tanto, el límite de 60 días en viales abiertos se fijó por razones de seguridad.
La manipulación debería siempre estar de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio (GLP*). ¡Los
criterios de validación del análisis deben cumplirse siempre!
(*Esto incluye: Colocar la tapa debida en el vial y cerrarlo firmemente / Sacar de los viales de stock solamente los reactivos
necesarios para la corrida si entraran en contacto con otras soluciones contaminantes como lo son las muestras, etc. / Las
soluciones de stock siempre deben regresarse a 2...8°C si no se usan.)

Notas de seguridad
[STOP] Atención
· Indicaciones de peligro
H315 Provoca irritación cutánea.
H319 Provoca irritación ocular grave.

[SUB] Peligro
· Indicaciones de peligro
H360D Puede dañar al feto.

· Consejos de prudencia
[NC] [PC] [DIL-M] [CON] [WS]20x] [SUB] [STOP]
P234 Conservar únicamente en el recipiente original.
P260 No respirar el polvo/el humo/el gas/la niebla/los vapores/el aerosol.
P262 Evitar el contacto con los ojos, la piel o la ropa.
P281 Utilizar el equipo de protección individual obligatorio.
P303+P361+P353 EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quitarse inmediatamente las prendas
contaminadas. Aclararse la piel con agua o ducharse.
P305+P351+P338 EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante
varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando.
P337+P313 Si persiste la irritación ocular: Consultar a un médico.
P401 Almacenar de acuerdo con las regulaciones locales/regionales/ nacionales/ internacionales.
P501 Eliminar el contenido/el recipiente de acuerdo con las regulaciones
locales/regionales/nacionales/internacionales.
Los controles han sido encontrados negativos para HBsAg y anticuerpos contra VHC y VIH 1 + 2 en los
donantes.

Referencias
1. Engvall, E., Perlmann, P., Immunochemistry 8, 871-874 (1971)
2. Engvall, E., Perlmann, P., J. Immunol. 109, 129-135 (1972)
3. Remington, J.S., Klein, J.O., Infectious diseases of the fetus and newborn
infant. Sanders, Philadelphia, London, Toronto (1976)
4. Bidwell, D.E. et al., J. Infect. Dis. 136, Supplement 274-278 (1977)
5. Volk, W.A., Essentials of Medical Microbiology. Second ed., J.B. Lippincott
Company, Philadelphia, New York, San Jose, Toronto, 576-578 (1982)
6. Schmidt, N.J., J. Med. Virol. 9, 27-36 (1982).
FIN DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “VZV IgM"
48
KIT: VZV IgG - HUMAN
INICIO DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “VZV IgG"
VZV IgG
Prueba ELISA para la detección de anticuerpos IgG contra Varicela Zoster Virus en suero humano

Uso esperado
La prueba ELISA VZV IgG está destinada a la detección de anticuerpos clase IgG contra Varicela Zoster
Virus en suero humano.

El cuerpo humano es el único reservorio conocido para VZV. Aproximadamente 3 millones de casos de
varicela ocurren anualmente. La enfermedad en niños tiene generalmente un curso benigno.
Típicamente se presenta con fiebre, malestar, y erupción generalizada en la piel. En adultos la infección
es más severa que en la infancia, siendo la neumonitis a varicela una importante preocupación.
Shingels (zoster) es también un desorden comúnmente causado por VZV, con aproximadamente un 10%
de la población general afectada en alguna oportunidad.
La serología provee una herramienta diagnóstica rutinaria y es también utilizada para monitorear el
progreso de la infección.

Principio - EIA clásico -

La prueba HUMAN ELISA VZV IgG está basada en la clásica técnica ELISA. Los micropocillos ELISA son
recubiertos con antígenos VZV (VZV-Ag) derivados de cultivos celulares. En la primera etapa de
incubación, los anticuerpos contra VZV (anti-VZV-Ac) contenidos en la prueba o el control se fijan
específicamente a los antígenos inmovilizados. Al final de la incubación, los componentes excesivos son
eliminados por lavado. En la segunda etapa de incubación, se añade un conjugado anti-IgG (anticuerpos
anti-IgG-humana, marcados con peroxidasa) que se fija especificamente a los anticuerpos IgG. Se forman
inmunocomplejos típicos. Después de eliminar el conjugado excesivo por lavado (segunda etapa de
lavado) y añadir TMB/Substrato (etapa 3), se forma un color azul que se transforma a amarillo después
de parar la reacción. La intensidad de este color es directamente proporcional a la cantidad de
anticuerpos anti-VZV IgG en la muestra.

Reactivos y contenidos
[MIC] 12 Micropocillos en portatiras
(Código VZV G)
Tiras (desprendibles) de 8 micropocillos cada uno, recubiertas con antígeno
VZV (derivados de cultivo celular)
[NC] 2,5 ml Control VZV IgG negativo (tapa verde)
listo para el uso, humano
[PC] 2,5 ml Control VZV IgG positivo (tapa roja)
listo para el uso, humano 20 mIU/ml +/- 10%
Calibrado contra la preparación internacional de la OMS para inmunoglobulina
anti-Varicela Zoster (el contenido del control positivo esta listo para el uso
Corresponde a una concentración de 2UI/ml en suero nativo

49
[DIL-G] 100 ml Buffer de dilución IgG (tapa azul)
5121 listo para el uso, color verde pH 6,5 ± 0,2
Buffer Fosfato 10 mmol/l
NaCl 8 g/l
Albúmina 10 g/l
[CON] 12 ml Conjugado Anti IgG (tapa blanca)
listo para el uso, color rojo
Anticuerpos anti-IgG-humano, marcados con peroxidasa
(conejo)
[WS][20X] 50 ml Solución de lavado (tapa blanca)
5102 Concentrado para aprox. 1000 ml pH 7,2 ± 0,2
Buffer TRIS 10 mmol/l
NaCl 8 g/l 8 g/l
[SUB] 13 ml Reactivo Substrato (tapa negra)
5103 listo para el uso, sin color a azulado pH 3,7 ± 0,2
3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) 1,2 mmol/l
Peróxido de Hidrógeno 3 mmol/l
[STOP] 15 ml Solución de parada (tapa roja)
5104 Ácido sulfúrico, listo para el uso 0,5 mol/l
2 Tiras adhesivas
Preservantes: Concentración total < 0,1%

Material suplementario recomendado pero no provisto en el estuche

Micropipetas, lavadora ELISA, lector de microplaca equipado con filtro 450 nm o con filtros 450/630–690
nm, agua desionizada.

Estabilidad
Los reactivos son estables hasta las fechas de caducidad señaladas en las etiquetas individuales cuando
se almacenan a 2...8°C.
Después de abierto los reactivos deben almacenarse a 2...8°C y utilizarse dentro de 60 días.

[MIC] (Código VZV G)

- están envasadas en bolsas de aluminio selladas con un desecante
- deben estar a temperatura ambiente antes de abrir
- no utilizados: devolver junto con el desecante en las bolsas de aluminio y almacenar de 2...8°C.
- No tocar el borde superior o el fondo de los micropocillos con los dedos.

Preparación de reactivos
Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (15...25°C) antes del uso. Los reactivos que no
están en uso deben siempre estar almacenados a 2...8°C.

Notas especiales

50
Los reactivos de propósito general con las denominaciones [DIL-G] 5121, [WS] 5102, [SUB] 5103, [STOP]
5104 de diferentes lotes y pruebas son intercambiables entre estos lotes y pruebas. Para análisis IgG usar
solamente Buffer de Dilución IgM [DIL-G] 5121.
Todos los demás reactivos son específicos para los lotes individuales y no deben ser intercambiados con
otros lotes u otras pruebas. Ningún reactivo de otra procedencia debería utilizarse junto con los
reactivos de este estuche.

Solución de lavado de trabajo [WASH]

- Diluir 1 porción de [WS]20x] 5102 con 19 porciones de agua desionizada fresca, por ejemplo: 50 ml
[WS][20x] 5102 + 950 ml = 1000 ml.
- Estabilidad: hasta 60 días a 15...25°C.

Muestra
Suero
No usar muestras altamente lipémicas o hemolíticas.
Muestras pueden almacenarse hasta por 7 días de 2...8°C o por más largo tiempo a -20°C. Congelar y
descongelar solamente una vez. Al descongelar una muestra debe ser homogeneizada. Eliminar el
material particulado por centrifugación o filtración.

Procedimiento
Seguir el procedimiento exactamente como se describe.

Notas de uso
U1: No mezclar tapas de envases (riesgo de contaminación). No usar reactivos después
de sus fechas de caducidad.
U2: No usar reactivos que pueden ser contaminados (turbidez u olor).
U3: Notar el reparto de las muestras y de los controles cuidadosamente en la hoja
provista en el estuche.
U4: [MIC] – colocar el número requerido firmemente en el portatiras.
U5: U5: Analizar los controles en duplicado. Pipetear los controles y las muestras en el
fondo de los micropocillos.
U6: Siempre deben agregarse los reactivos en el mismo orden para minimizar
diferencias en los tiempos de reacción entre los micropocillos y obtener
resultados reproducibles. El pipeteo de las muestras no debería exceder de 5
minutos para evitar diferencias en los tiempos. De lo contrario pipetear los
controles en las posiciones indicadas en la mitad del intervalo de la serie. Si se
emplea más de una placa, repetir los controles.
U7: Remover burbujas de aire antes de las incubaciones y lecturas de absorbancia.
U8: Incubar [SUB] en la oscuridad. [SUB] inicia y [STOP] termina la reacción enzimática.
U9: Cierre firmemente los viales con las tapas respectivas después del uso.

Procedimiento de lavado
El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente producirá una mala precisión o
absorbancias falsamente elevadas.
L1: Remover las tiras adhesivas, aspirar el contenido (en un envase con solución de Hipoclorito de Sodio
al 5%), agregar [WASH], aspirar después de aproximadamente 30 sec. y repetir el lavado 3 ó 4 veces.
51
L2: En el caso de lavadores automáticos, se deben llenar y enjuagar con [WASH] y después lavar los
pocillos 4 ó 5 veces con [WASH]. Asegurarse que los pocillos son llenados completamente y espirados
después de 30 sec. (Líquido remanente: < 15 μl).
L3: Después del lavado, remover el líquido remanente invirtiendo los micropocillos sobre papel
absorbente.

Esquema de pipeteo
Los reactivos y las muestras deberían estar a temperatura ambiente antes del uso
Preparación de muestras:
Diluir el suero del paciente 1 + 100 con [DIL-G] 5121, por ejemplo 10 µl de suero + 1 ml de
[DIL-M] 5111 y mezclar vigorosamente. Las muestras diluidas se pueden almacenar hasta
48 horas entre 2 – 8 °C.
Los controles están listos para usar.
Etapa 1 Pocillo (µl)
A1 B1/C1 D1/E1 F1…
Blanco [NC] [PC] Muestra
[NC] en duplicado -- 100 -- --
[PC] en duplicado -- -- 100 --
Muestra diluida -- -- -- 100
Cubrir [MIC] con tiras adhesivas
Incubar por 30 minutos a 17 – 25 °C
Lavar 4 veces como se describe (ver L1 – L3)
[WASH] 350 350 350 350
Etapa 2
[CON] -- 100 100 100
Cubrir [MIC] con tiras adhesivas
Incubar por 30 minutos a 17 – 25 °C
Lavar 5 veces como se describe (Ver L1 – L3)
[WASH] 350 350 350 350
Etapa 3
[SUB] 5103 100 100 100 100
Incubar por 15 minutos a 17 – 25 °C
[STOP] 5104 100 100 100 100
Mezclar cuidadosamente
Llevar a cero de absorbancia el instrumento lector de ELISA con el blanco de subtrato del
pocillo A1.
Medir la absorbancia a 450 nm lo más pronto posible o dentro de 30 minutos. Espuesta
terminar la reacción usando una longitud de onda de referencia de 630 – 690 nm (si está
disponible).

La absorbancia de los controles y muestras se determina haciendo uso de un lector de micropocillos

ELISA o sistemas completamente automatizadas (p.ej. instrumentos de las líneas HumaReader o ELISYS
de HUMAN). Los resultados de los pacientes se obtienen por comparación con un valor de punto de
corte (cut-off value) o por expresión en unidades HUMAN o OMS por ml basándose en el control
positivo.
52
Cálculos de valores de control y punto de corte (Cut-off)
Valores promedio de Absorbancia del [NC] en pocillos B1 y C1 (MNC) y del [PC] en pocillos D1 y E1 (MPC)
se calculan de acuerdo a:

A450 (B1)+ A450 (C1) A450 (D1) + A450 (E1)

MNC = ; MPC =
2 2

El punto de corte o valor cut-off (COV) se calcula usando la fórmula:

COV = MNC + (0,1 x MPC)

La serie analítica puede considerarse válida si se cumple con los siguientes criterios:
1. Blanco substrato en pocillo A1 < 0,150
2. MNC ≤ 0,250
3. MPC ≥ 0,750
4. MPC : MNC ≥ 5

Interpretación de resultados
A450 (paciente) > COV + 15% : Ac anti-VZV-IgG positivo
A450 (paciente) < COV - 15% : Ac anti-VZV-IgG negativo

Debido a variaciones fisiológicas y analíticas los resultados de los pacientes un 15% arriba o abajo del
valor calculado como cut-off son equívocos. Es recomendable medir estas muestras en paralelo con una
muestra fresca tomada de 7 a 14 días después cada una en duplicado. El cambio de la concentración
específica de anticuerpos deberá ser evaluado, si es necesario, tomando en cuenta la anamnesis del
paciente, así como los resultados de más exámenes.
Si los resultados son repetidamente reactivos o equívocos, las muestras pueden ser sometidas a un
análisis de confirmación.
El significado clínico de cambios en los niveles de IgG especificas anti-VZV debe interpretarse
cuidadosamente.

Unidades para anticuerpos anti-VZV IgG

Los resultados positivos encontrados en sueros de pacientes pueden expresarse en unidades HUMAN
(HU/ml) u OMS (UI/ml).

A450 (Paciente) A450 (Paciente)

HU/ml = x 100 o UI/ml = x 2,0
MPC MPC

Características de la ejecución
Las características de ejecución de la prueba pueden consultarse en el informe de verificación accesible
vía
www.human.de/data/gb/vr/el-vzvg.pdf o
www.human-de.com/data/gb/vr/el-vzvg.pdf.
Si no puede acceder a las características de la ejecución vía internet, póngase en contacto con su
distribuidor local quien se las proporcionará sin costo alguno.

53
Nota
Los componentes del estuche son estables hasta la fecha de caducidad aún después de abiertos. Sin
embargo, la posibilidad de una contaminación está directamente relacionada con el número de tomas
del reactivo. Por lo tanto, el límite de 60 días en viales abiertos se fijó por razones de seguridad.

Notas de seguridad
[STOP] Atención
· Indicaciones de peligro
H315 Provoca irritación cutánea.
H319 Provoca irritación ocular grave.

[SUB] Peligro
· Indicaciones de peligro
H360D Puede dañar al feto.

· Consejos de prudencia
[NC] [PC] [DIL-G] [CON] [WS]20x] [SUB] [STOP]
P234 Conservar únicamente en el recipiente original.
P260 No respirar el polvo/el humo/el gas/la niebla/los vapores/el aerosol.
P262 Evitar el contacto con los ojos, la piel o la ropa.
P281 Utilizar el equipo de protección individual obligatorio.
P303+P361+P353 EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quitarse inmediatamente las prendas
contaminadas. Aclararse la piel con agua o ducharse.
P305+P351+P338 EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante
varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando.
P337+P313 Si persiste la irritación ocular: Consultar a un médico.
P401 Almacenar de acuerdo con las regulaciones locales/regionales/ nacionales/ internacionales.
P501 Eliminar el contenido/el recipiente de acuerdo con las regulaciones
locales/regionales/nacionales/internacionales.
Los controles han sido encontrados negativos para HBsAg y anticuerpos contra VHC y VIH 1+2 en los
donantes.

Referencias
1. Engvall, E., Perlmann, P., Immunochemistry 8, 871-874 (1971)
2. Engvall, E., Perlmann, P., J. Immunol. 109, 129-135 (1972)
3. Remington, J.S., Klein, J.O., Infectious diseases of the fetus and newborn
infant. Sanders, Philadelphia, London, Toronto (1976)
4. Bidwell, D.E. et al., J. Infect. Dis. 136, Supplement 274-278 (1977)
5. Volk, W.A., Essentials of Medical Microbiology. Second ed., J.B. Lippincott
Company, Philadelphia, New York, San Jose, Toronto, 576-578 (1982)

FIN DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “VZV IgG"

54
 CUANTIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS
Para esta actividad práctica se determinará la concentración de las inmunoglobulinas A, G y M. La
importancia de su cuantificación radica en que sus resultados son necesarios para el diagnóstico y
seguimiento de las inmunodeficiencias y otras enfermedades.

Existen 2 técnicas principales para cuantificarlas, la primera es la nefelometría y la segunda es la

inmunodifusión radial. Esta última es la que se realizará en la actividad práctica.

INMUNODIFUSIÓN RADIAL

Las técnicas de inmunodifusión radial entran en la categoría de pruebas de precipitación. Las pruebas de
precipitación ocurren cuando los antígenos y los anticuerpos se unen en concentraciones equivalentes
formando complejos antígenos-anticuerpos grandes. Estos complejos dejan de ser solubles separándose
de la parte liquida, lo cual provoca que precipiten. Para formar un complejo grande se requiere de la
multivalencia de los anticuerpos y que el antígeno posea más de 1 epítope de reconocimiento.

Ejemplo de reacción de equivalencia a partir de una concentración constante de anticuerpos. A la izquierda se ejemplifica la
existencia una baja concentración de antígeno, el exceso de anticuerpos provoca que solo algunos se puedan unir a sus
antígenos y en algunos casos solo se usaría 1 valencia, este fenómeno se denomina como “Prozona”. A la derecha es el caso
contrario donde existe un exceso de antígeno, esto provoca que distintos antígenos saturen las valencias de los anticuerpos
presentes, pero no habrá suficiente cantidad de anticuerpos para formar complejos inmunes, este fenómeno se denomina
como “Postzona”. En el centro se observa una reacción de equivalencia en donde los anticuerpos usan todas sus valencias
uniéndose a distintas moléculas de antígeno. Esto provoca una malla grade de complejo el cual pierde su solubilidad y puede
precipitar con facilidad a diferencia de los otros dos extremos.

La precipitación si ocurre en una matriz liquida, puede ser difícil de identificar por el ojo humano, sin
embargo Si la reacción de precipitación se lleva a cabo en un medio semisólido transparente como son
los geles de agar o agarosa, en el punto de encuentro entre antígeno y anticuerpo, se forma una línea
visible de precipitado blanco. Debido a esta característica es que las reacciones de precipitación son la
base de una gran cantidad de técnicas que permiten identificar y cuantificar tanto antígenos como
anticuerpos.

55
En 1965, Mancini desarrolló una técnica de precipitación, la inmunodifusión radial simple (IDR), que
permite la cuantificación exacta de antígenos en muestras desconocidas. La técnica consiste en colocar
el suero en estudio en pequeños pocillos presentes en un gel de agarosa. Este gel de agarosa ya
contiene, homogéneamente distribuido, anticuerpo específico para el antígeno a determinar.
Posteriormente, durante la incubación, los antígenos difunden radialmente desde el pocillo entrando en
el gel y allí se van encontrando con los anticuerpos, produciendo la reacción y formando complejos
antígeno-anticuerpo. Estos complejos al alcanzar un mayor peso molecular precipitan, formándose un
anillo de precipitación visible en torno al pocillo. A mayor concentración de antígeno, mayor distancia
entre el anillo y el centro del pocillo. Por ello es que el radio o diámetro del anillo de precipitación es
proporcional a la concentración antigénica. La relación entre la concentración y el radio o diámetro al
cuadrado del anillo de precipitación es lineal en el momento en que la reacción se ha completado.
Alternativamente se puede usar el logaritmo del diámetro medido, pero en la inmunodifusión radial es
más común de uso del cuadrado del diámetro.

Para poder cuantificar el antígeno presente en un muestra, se requiere de estándares de concentración

conocida para realizar una curva de calibración de concentración vs diámetro al cuadrado.

Determinación de la concentración de una molécula por inmunodifusión radial simple. A la izquierda se tienen 3 estándares
de concentración conocida que forman un anillo de precipitación. Con estos datos se forma una curva de calibración de la
concentración del calibrador vs el diámetro al cuadrado de los anillos de precipitación. A la derecha se observa un diámetro
de una muestra, cual al elevarse al cuadrado e interpolarse en la curva de calibración fabricada, se puede obtener la
concentración de la molécula.

Cuando se realiza la gráfica de la curva de calibración, normalmente al graficar con el diámetro del anillo
no se logra una relación lineal. Por otra parte al graficar usando el cuadrado del diámetro, se forma una
relación lineal con la concentración del analito. Esta relación lineal debe iniciar del punto de menor
concentración usada hasta el punto de mayor concentración, específicamente hasta donde se mantenga
la linealidad.

56
Graficas de curva de calibración para inmunodifusión radial simple. A la izquierda se observa una gráfica de concentración del
analito vs el diámetro del anillo de precipitación. La grafica no es lineal, por lo tanto no se debe usar para interpolar
resultados y obtener concentraciones. En la derecha se grafica la concentración del analito vs el diámetro al cuadrado. Esta
relación si es lineal. Con esta relación se puede realizar la interpolación elevando al cuadrado el diámetro de la muestra
problema, para así obtener la concentración real.

En algunos casos las muestras a determinar pueden no aparecer en el rango lineal usado es por ellos que
se pueden adoptar las siguientes medidas:

1. Si el diámetro al cuadrado obtenido es inferior al valor menor usado, se debe informar que la
concentración de la muestra es menor a la menor concentración usada en la curva.
2. Si el diámetro al cuadrado obtenido es superior al valor mayor usado, se debe diluir la muestra en un
buffer salino fosfato de pH cercano a 7. La dilución puede ser 1:2, o 1:4. El resultado obtenido debería
entrar dentro del rango lineal, por ello se podría obtener la concentración. La concentración del rango
lineal finalmente se debe multiplicar por el factor de dilución aplicado sobre la muestra.

La inmunodifusión radial, ensayos de aglutinación, entre otros, se basan en la observación de las etapas
finales de la reacción antígeno-anticuerpo para obtener un producto final medible o cuantificable y estas
etapas tardan horas y hasta días en desarrollarse para lograr un producto final estable. Debido a esta
limitante es que se utilizan inmunoensayos turbidimétrico (o nefelométricos) ya que las mediciones se
realizan en la etapa primaria de la reacción, la cual ocurre de segundos a minutos y puede ser medida
mediante el incremento de la luz incidente a un ángulo mayor con respecto a esta luz incidente.

Algunos proveedores ofrecen kits de inmunodifusión radial estandarizados, que, para cualquiera de sus
placas, se usarán los mismos volúmenes y requerirán de los mismos cuidados, solo cambiará el
anticuerpo presente en la matriz de gel de acuerdo a lo que se medirá. Este es el caso de la marca
Biocientifica que tiene placas para determinar inmunoglobulinas, complemento, transferrina,
ceruloplasmina, marcadores tumorales, etc y el inserto de las placas es el mismo para todas las
mediciones, solo incluye otros elementos extras que son tablas con los valores de concentración de
acuerdo al diámetro y papel milimetrado para graficar en caso de uso de curva de calibración.

INMUNOGLOBULINAS

Las inmunoglobulinas son moléculas de la inmunidad humoral específica y una de sus principales
funciones fisiológicas es la defensa contra los microorganismos extracelulares y las toxinas producidas
por los distintos agentes microbianos. La unidad estructural básica de estas inmunoglobulinas es una

57
glicoproteína de peso molecular de 150,000 Da compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas: dos
cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, las cuales están asociadas por cuatro puentes disulfuros.

La inmunoglobulina A (IgA) es producida principalmente por las células B en placas de Peyer, amígdalas y
otros tejidos linfoides asociados a mucosas. En seres humanos existen dos subclases de IgA: IgA1 e IgA2
siendo IgA1 la que predomina en suero predomina y constituye entre el 10 al 15% de las
inmunoglobulinas séricas totales. En suero la IgA tiene forma monomérica, pero en las secreciones
mucosas es abundante la IgA2, la cual es dimérica y en menor grado trimérica. Esta inmunoglobulina es
la responsable de la respuesta inmunitaria humoral de las mucosas, por tanto, constituye la primera
línea de defensa específica para la mayoría de las infecciones. La deficiencia de IgA tiene lugar en
aproximadamente 1:1.000 de la población y está frecuentemente asociada con la deficiencia de
inmunoglobulina G.

La inmunoglobulina G (IgG) es la clase más abundante en suero, constituyendo el 80% de las

inmunoglobulina totales. Existen cuatro subclases en humanos (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) que se
diferencian estructuralmente entre sí por el tamaño de la región bisagra y el número de puentes
disulfuro entre las cadenas pesadas. Es el anticuerpo más abundante durante la respuesta inmunitaria
secundaria de tipo humoral. Es la única clase de inmunoglobulina que puede atravesar la barrera
placentaria y es la responsable de proteger a los recién nacidos durante los primeros meses de vida,
mediante inmunidad pasiva natural. La IgG tiene la capacidad de unirse al antígeno, así como también
puede fijar el complemento (principalmente IgG1 e IgG3).

La inmunoglobulina M (IgM) supone del 5 al 10% de las inmunoglobulinas séricas, se secreta como
pentámero que contiene la cadena J, que une las 5 unidades. Los anticuerpos de tipo IgM predominan en
la respuesta inmunitaria temprana para la mayor parte de los antígenos, posteriormente su
concentración disminuye. La IgM se expresa en la superficie de las células B, en particular los linfocitos B
vírgenes donde actúa como receptor específico para el antígeno y es la inmunoglobulina más eficiente
para activar el complemento, ya que una molécula de IgM unida al antígeno es suficiente para iniciar la
cascada del complemento.

Las IgD es principalmente una inmunoglobulina de membrana presente en los linfocitos B cuando
maduran finalmente en el bazo. Su forma soluble no se tiene certeza cual es su función especifica y su
cantidad es muy inferior respecto a las inmunoglobulinas sérica. La IgE se asocia a respuestas contra
patógenos multicelulares y también a la respuesta alérgica.

58
Una de las pruebas obligatorias para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades inmunológicas
(inmunodeficiencias) y otras enfermedades asociadas a desórdenes del sistema inmune, es la
cuantificación de inmunoglobulinas en el suero. El perfil de inmunoglobulinas séricas cuantificable,
corresponde a las 3 mas abundantes: IgG, IgA e IgM. La IgD por sus niveles bajos y su acción desconocida
no está incluida. La IgE al estar involucrada las respuestas alérgicas, su utilidad clínica para cuantificar
son en esos casos. Los métodos de cuantificación de inmunoglobulina pueden ser mediante
turbidimetría, nefelometría o inmunodifusión radial, siendo la nefelometría la técnica preferida
actualmente.

Referencias
1. Alonso-Ramos V, Melchor-Rodríguez A, López-Cisneros R, et al., 2004. Bioquimia 29: 45-54.
2. Bergón-Jimenez E, Bergón-Sendín M, 1998. Quimia Clinica 17(5):372-379.
3. MBL Lifescience. Structure and characteristics of antibody isotypes. Disponible en
https://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/antibody-isotype.html

59
KIT: DIFFU-PLATE - BIOCIENTIFICA
INICIO DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “DIFFU-PLATE”
DIFFU-PLATE
Placa de inmunodifusión radial par la determinación de inmunoglobulinas y otras proteínas en líquidos
biológicos.

Uso del equipo

La inmunodifusión radial (IDR) en placa de agarosa contenido antisueros específicos constituye un
excelente recurso diagnóstico para la determinación cuantitativa de proteínas en líquidos biológicos
dentro del rango indicado en la tabla de referencia. Para concentraciones fuera de este rango, las
muestras a ensayar deben ser concentradas o diluidas apropiadamente (ver sección “preparación de la
muestra”).

Presentación de los equipos

Placas de inmunodifusión radial para 12 determinaciones conteniendo antisueros específicos para la
proteína a estudiar.

Instrucciones para la conservación

Las placas se conservan entre 2 a 8 °C en su envase original hasta la fecha de vencimiento indicada en la
etiqueta. Deben almacenarse en lugares planos e invertidas para evitar el acumulo de agua de
condensación en la superficie a sombrar. No deben congelarse.

Una vez abiertas y si fueron parcialmente usadas, pueden reutilizarse en posteriores determinaciones,
siempre y cuando sean colocadas nuevamente en el envase de aluminio, evitando el contacto con el aire,
y conservadas entre 2 a 8 °C. Para evitar la deshidratación del gel, colocar gasa o algodón humedecido en
el centro de la placa y luego cerrar firmemente. Si pasaron más de 4 semanas desde el primer uso, se
debe trazar una nueva curva de calibración ya que no corresponde usar los valores indicados en la Tabla
de Referencia.

Principio del método

El procedimiento consiste en una inmunoprecipitación en agarosa entre un antígeno a cuantificar y su
anticuerpo homólogo. Se realiza incorporando uno de los dos reactivos inmunes (generalmente
anticuerpo) uniformemente en una capa de agarosa y luego introduciendo el otro reactivo en pocillos
cavados en gel. El antígeno difunde radialmente en la mezcla gel-anticuerpo y se forma un disco o anillo
visible en un punto que depende de la relación estequiométrica antígeno-anticuerpo. A medida que más
antígeno difunde, el anillo se redisuelve y reaparece a una distancia mayor del pocillo. Este aumento en
el diámetro de precipitación continua hasta que el antígeno y anticuerpo reaccionan completamente.

Mientras que el precipitado se está expandiendo (16 a 20 horas) la relación entre el diámetro del anillo y
el logaritmo de la concentración del antígeno es aproximadamente lineal. Al completarse la reacción, la
relación entre el diámetro al cuadrado y la concentración es lineal.

El sistema Diffu-Plate permite el desarrollo de 3 métodos para el análisis de los resultados ya sea en:
A- Determinaciones de rutina
B- Determinaciones de alta precisión

60
C- Determinaciones de rápida orientación

Equipamiento necesario para el desarrollo de la técnica

1- Placa IDR para 12 determinaciones
2- Micropipetas o capilares que puedan medir 5 µl con precisión
3- Sueros testigos con 1 /o 3 niveles de a proteína determinar
4- Regla de lectura que permita leer con una precisión de 0,1 mm.
5- Tabla de conversión de diámetro vs concentración (uso opcional)

Procedimiento
Preparación del material
1- Sueros controles: se pueden presentar en un único nivel de concentración o en viales de alta, media y
baja concentración. Contiene azida sódica al 0,1% (evitar ingestión y contacto con la piel o mucosa). Son
estables hasta su fecha de vencimiento si se conservan entre 2 y 8 °C. La concentración de proteína
específica fue obtenida por comparación con estándares nacionales e internacionales. Cada calibrador
tiene características físico-química similares a las del suero humano. Un índice de posible deterioro es la
presencia de material particulado o una gran desviación de los valores esperados respecto a los valores
informados en la tabla de referencia.

NOTA: todos los materiales en este quipo fueron testados y resultaron negativos para HIV y HBsAg; sin
embargo ninguno de estos ensayos garantiza la ausencia absoluta de agentes infecciosos; por lo tanto se
sugiere que se manipulen en forma apropiada por personal capacitado.

2- Muestras: las muestras de suero deben procesarse en el día. En caso contrario, conservar a -20 °C
evitando congelar y descongelar. Si aparece turbidez, clarificar por centrifugación. Otros materiales
biológicos se centrifugan y procesan igual que el suero. Las muestras de suero pueden necesitar ser
diluidas para entrar en el rango de resolución de la placa, para ello, utilizar solución fisiológica. En el caso
de muestras pediátricas la concentración generalmente es menor, por lo tanto deben concentrarse las
muestras al doble o bien realizar 2 siembras en un periodo máximo de 30 minutos. Dejar secar después
de la primera siembra.

3- Placas: úselas en un área libre de polvo para evitar la contaminación.

Desarrollo de la reacción
1- Abrir placa para permitir que se evapore el exceso de humedad, si lo hubiera
2- Sembrar 5µl de muestra o control utilizando micropipetas de precisión. Colocar en el
centro de la placa algodón o gasa humedecida, para mantener la humedad del agar.
Cerrar firmemente la tapa.
3- Incubar en posición invertida en cámara húmeda el tiempo indicado en la Tabla
adjunta en el punto “Tiempo de Incubación”, a temperatura ambiente.

Lectura de los resultados

El punto final de la difusión está indicado por la aparición de un anillo de bordes netos. El mismo se
alcanza una vez cumplido el tiempo e incubación. A partir de ese momento puede efectuarse la lectura,
ya que el halo no aumentará de tamaño. El cálculo de los resultados se realiza con alguno de los
siguientes métodos:
61
A- Determinación de rutina utilizando tabla de valores.
a) Medir halos de precisión de 0,1 mm.
b) Interpolar el dato anterior en la tabla de valores que acompaña cada placa.

B- Determinación de alta precisión trazando curva de calibración.

a) Las tres primeras posiciones de cada placa se utilizan para sembrar las diferentes diluciones o
concentraciones de los sueros controles.
b) Medir los diámetros de los halos con una precisión de 0,1 mm
c) Graficar las concentraciones de los sueros de referencia contra el diámetro al cuadrado de los halos de
precipitación.
d) Trazar la recta que mejor una a los tres puntos.
e) Interpolar el valor de la muestra desconocida.

C- Determinación de rápida orientación. Método cinético de lectura rápida.

a) Tomar la lectura entre 16 y 20 horas de incubación con una diferencia máxima de ± 30 minutos
respecto del suero de referencia. Los diámetros de las zonas de precipitación deben medirse con una
precisión de 0,1 mm por lo menos.
b) Graficar los diámetros de los sueros de referencia contra el logaritmo de sus respectivas
concentraciones.
c) Trazar la recta que mejor una los 3 puntos.
d) interpolar el valor de la muestra desconocida.
e) No es necesario trazar una curva cada vez que se procesa una nueva muestra. Sin embargo, debe
efectuarse la lectura en el mismo tiempo que se leyeron los sueros de referencia. Si se efectúa una
nueva siembra con más de una semana de diferencia respecto a la calibración es recomendable
introducir un testigo e cada corrida.

NOTA: la tabla de valores se confecciona sobre un gran número de placas de cada lote utilizando un
programa estadístico por computación para trazar la mejor recta. Solo es válida para el número de lote
indicado. Variaciones en los parámetros del ensayo, como volumen de las muestras, temperatura,
tiempo de incubación, y utilización de la placa una vez abierta por un lapso superior a 1 mes pueden
producir diámetros no concordantes con las especificaciones de la tabla. Es importante incluir sueros
controles para trazar una curva de calibración.

Errores factibles en la utilización de la técnica

1- Debe tenerse suma precaución al sembrar, evitando derramar muestra fuera del
pocillo, romper los bordes del mismo o introducir burbujas de aire. En caso que esto
ocurra, sembrar un nuevo pocillo.
2- Si una vez abierta la placa se observan signos de deshidratación o deterioro en el
agar, deben ser desechadas.
3- Deben evitarse las variaciones bruscas de temperatura, ya que afecta la velocidad de
difusión y, por lo tanto, los diámetros de precipitación.
4- Las placas no deben ser congeladas. Si esto ocurriera, deben ser descartadas.

Evaluación de los resultados

Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores e referencia. Los rangos que aquí
se dan corresponden a pacientes ambulatorios, presuntamente sanos.
62
 Inmunoglobulina G: Adultos: 600-1650 mg/dl.
Niños: 560-1500 mg/dl.
Inmunoglobulina A: Adultos: 90-400 mg/dl.
Niños: 100-210 mg/dl.
Inmunoglobulina M: Adultos: 75-300 mg/dl.
Niños: 40-200 mg/dl.
IgD: 1-4,5 mg/dl.
C-3: 80-160 mg/dl.
C-4: 20-40 mg/dl.
Ceruloplasmina: 19-57 mg/dl
Transferrina: 210-430 mg/dl.
Alfa 1 antitripsina: 121-244 mg/dl.
Alfa 2 macroglobulina: 170-450 mg/dl.
Apolipoproteina A-1: 73-169 mg/dl.
Apolipoproteina B: 58-138 mg/dl.
Alfafetoproteina: 0-10 ng/dl.
PCR: 0,007-0,8 mg/dl.

Valores de referencia para inmunoglobulinas séricas

Edad IgA mg/dl IgG mg/dl IgM mg/dl
Recién nacidos Menor de 10 700-1400 0-20
5 dias-1mes 5-30 400-1250 10-60
1-2 meses 8-55 230-900 13-77
2-3 meses 16-88 190-670 13-83
4-6 meses 18-80 260-880 16-92
6 meses-1 año 20-100 250-1100 16-100
1-2 años 22-130 350-1200 18-107
2-3 años 26-150 530-1220 20-108
3-9 años 30-240 610-1380 20-134
9-15 años 60-300 630-1400 30-148
Adultos 90-310 710-1520 40-250
Valores obtenidos en individuos presuntamente sanos de nuestra población utilizando placas y sueros
controles Diffu-Plate.

Bibliografía

1) Barne GH, 1974. Clin Chem 200: 61-89.

2) Fahay JL and McKelvey EM, 1965. J immunol 94-84
3) Heemans JP ans Masson PL, 1972. Clin Chem 18: 294-300
4) Hosty RA, Hollenbech M and Shane S. Clin Chem 19: 524-526
5) Mancini HS, Carbonara AO, Heremans JF, 1965. Immunochemistry 2: 235.
6) Palmer DF, Woods R, 1972. Immunology Series n°3 Dept. of health education and welfare,
publication n°(HSM)72-8102, Center for Disease Control, Atlant, GA.
7) Rowe DE, Grob, Anderson S, 1972. WHO, 46-67.
8) Verbruggen R, 1975. Clin Chem 21: 5-43

FIN DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “DIFFU-PLATE”

63
EJEMPLO DE TABLA QUE ADJUNTA EL KIT DIFFU-PLATE

64
TUTORIAL ImageJ PARA DETERMINAR EL HALO DE IDR
1. Introducción
Como ya habrán observado, el kit de IDR solicita medir el diámetro de los anillos de precipitado con una
regla con escala mínima de 0,1 mm, sin embargo, las reglas que disponen tienen una escala de 1 mm.
Es por esto que la mejor forma de obtener un resultado más objetivo y con ese nivel de sensibilidad es
por medio del uso de un software de análisis de imágenes: imageJ. Para realizar esta medición se
necesita descargar el programa “ImageJ” e instalarlo en el computador. El software ImageJ se puede
descargar GRATIS en: http://imagej.nih.gov/ij/download.html
Este es un software libre por lo que no requiere licencia para ser ejecutado.

Para realizar la medición del halo de precipitado, se requiere haber hecho lo siguiente:
1. Obtener una fotografía de la placa de IDR al final del periodo de incubación
2. La fotografía digital debe ser de una calidad mínima de 5 megapixeles.
3. La fotografía de la placa debe incluir un elemento de medida, por ejemplo una regla común y
corriente.

2. Usando ImageJ
Cuando se abre el programa aparece una ventana pequeña rectangular con opciones. La principal
herramienta a utilizar es la herramienta denominada “Straight” o línea para realizar líneas a mano
alzada, que servirán para medir los diámetros en IDR.

2.1 Abrir la imagen a analizar

Para abrir una imagen deben ejecutar el comando básico de la
mayoría de los programas: File>Open.

Esta es una imagen de placa IDR a analizar

(G1-1): Como se observa en la imagen, se
fotografió la placa de IDR junto con una
regla común y corriente. Esta regla es de
suma importancia ya que nos permitirá
generar una escala (ver a continuación) para
transformar de pixeles a milímetros.

65
2.2 Generar una escala de conversión de pixeles a mm
Antes de generar una escala debemos dejar nuestra imagen
en su tamaño real. Para esto debemos dirigirnos a
Image>Zoom>”View 100%”

Esta imagen representa a la fotografía de la

placa IDR en su tamaño original de acuerdo a
los megapíxeles configurados

Para desplazarse por la imagen en su tamaño original existen 2 formas:

1- Seleccionar la herramienta de desplazamiento o
“scrolling tool” con la cual aparecerá, en vez del
puntero del mouse, una mano con la cual hacemos
click y desplazamos la figura a nuestro lugar de
interés.
2- La otra forma es mantener presionada la barra de espacio y hacer click izquierdo y desplazar la figura a
nuestra área de interés.

Ahora desplazaremos nuestra imagen en

tamaño real hacia la regla en la parte
superior izquierda. Con la herramienta de
línea extenderemos una desde el punto 0 a
10 mm de la regla (de 0 a 1 cm). Con esto
tenemos la información de que la línea
generada mide 10 mm, ahora solo falta
conocer a cuantos pixeles equivale esa línea.

66
 Para generar nuestra escala debemos ir a Analyze>Set scale.

En esta opción nos aparecerá un cuadro (izquierda) con la medida

de la línea en pixeles (231). Abajo aparece “known distance”
(distancia conocida), en la cual debemos introducir el numero 10
(los 10 mm pertenecientes a la regla). En la sección “pixel aspect
ratio” debe permanecer igual y en “unit of length” (unidad de la longitud) se puede colocar mm
(milímetros). Finalmente se debe seleccionar el recuadro de “Global” para que la escala pueda ser
guardada. Con estos datos hemos generado nuestra escala (en este ejemplo específico indica que la
escala es 23,1 pixeles/mm). Finalmente para guardar esa escala hacemos click en OK.

2.3 Obtención de diámetros de los halos de precipitación

Ya se ha generado la escala así que se puede

continuar. Para obtener los diámetros de los
halos de precipitado de la reacción antígeno
anticuerpo de la técnica de IDR, debemos
posicionarnos en la figura tamaño real en el
pocillo de interés y trazar una línea de borde
a borde del circulo de precipitado para
obtener nuestro diámetro. Para tener mayor
certeza de que la línea se encuentra bien
ubicada, se debe realizar la línea en sentido
vertical ya que de esta forma
comprobaremos si la línea creada está
alineada o no.
El ejemplo de la imagen es del pocillo
número 1 con un halo de precipitado de
diámetro desconocido.

67
 Al realizar una línea sobre ese halo de precipitación y seleccionar
nuevamente la opción Analyze>Set scale, se observa que la distancia en
pixeles ha cambiado, sin embargo podremos comprobar que nuestra
escala (23,1 pixeles/mm) se ha mantenido. El resultado de la línea
generada en el pocillo 1 es de 129 pixeles y eso equivale a 5,58 mm, sin
embargo para estos fines es mejor mantener un decimal por lo tanto sería
5,6 mm.

Este último paso se puede repetir las 12 veces para calcular el diámetro de
los 12 pocillos de la placa.

3. Calcular la concentración del analito

Finalmente con la obtención de los diámetros de los pocillos se debe calcular la concentración del analito
de acuerdo a las instrucciones del kit:
1. Buscar el diámetro y compararlo con la tabla de relación que viene con la placa de IDR.

2. Elevar al cuadrado el diámetro e interpolar en una curva de calibración.

68
 Copia del papel milimetrado incluido en el kit Diffu-Plate

d d2 100

3.0 9.00
3.1 9.61
3.2 10.24
3.3 10.89
3.4 11.56 90
3.5 12.25
3.6 12.96
3.7 13.69
3.8 14.44
3.9 15.21
4.0 16.00
4.1 16.8 80
4.2 17.64
4.3 18.49
4.4 19.36
4.5 20.25
4.6 21.16
4.7 22.09
4.8 23.04 70
4.9 24.01
5.0 25.00
5.1 26.01
5.2 27.04
5.3 28.09
5.4 29.16
60
5.5 30.25
5.6 31.36
DIAMETRO CUADRADO (d )
2

5.7 32.49
5.8 33.64
5.9 34.81
6.0 36.00
6.1 37.21 50
6.2 38.44
6.3 39.69
6.4 40.96
6.5 42.25
6.6 43.56
6.7 44.89
6.8 46.24 40
6.9 47.61
7.0 49.00
7.1 50.41
7.2 51.84
7.3 53.29
7.4 54.76
7.5 56.25 30
7.6 57.76
7.7 59.29
7.8 60.84
7.9 62.41
8.0 64.00
8.1 65.61
8.2 67.24 20
8.3 68.89
8.4 70.54
8.5 72.25
8.6 73.96
8.7 75.69
8.8 77.44
79.21
10
8.9
9.0 81.00
9.1 82.81
9.2 84.64
9.3 86.49
9.4 88.36
9.5 90.25
9.6 92.16 0 10 20 30 40 50 60 70
9.7 94.09
0 50 100 150 200 250 300 350
9.8 96.04
9.9 98.01 0 100 200 300 400 500 600 700
10.0 100.0 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750

Concentración (mg/dl)

69
 DETECCIÓN DE ALÉRGENOS

El concepto de alérgeno se refiere a un antígeno con la capacidad de desarrollar una respuesta alérgica.
La respuesta alérgica, es una respuesta del cuerpo a consecuencia de la acción de mastocitos mediado
por IgE. Este tipo de respuesta se conoce como mecanismo de hipersensibilidad tipo I. Debido a esto es
que la búsqueda de anticuerpos de clase IgE total ha sido útil para el diagnóstico de alergias en personas.
Sin embargo, los individuos de países del Tercer Mundo generalmente están expuestos a los parásitos
intestinales (helmintos) que pueden ser estímulos para potenciar la producción policlonal de IgE contra
antígenos del parasito, elevando sus concentraciones. Debido a esto es que para el diagnóstico de
alergias se determina los niveles de IgE específica (sIgE: specific immunoglobulin E) para algún alérgeno .

INMUNOENSAYO EN LINEA (LIA)

Los LIA son inmunoensayos en donde múltiples antígenos son depositados en paralelo en tiras de
nitrocelulosa permitiendo la detección simultánea de anticuerpos en suero contra múltiples antígenos.
Estos ensayos son una derivación estandarizada de un westernblot, con la diferencia de que en LIA se
depositan los antígenos en líneas paralelas de acuerdo a los intereses del fabricante y los anticuerpos
que se quieran determinar, en cambio en Westerblot, las líneas paralelas ocurren por la separación
electroforéticas de proteínas.

Las técnicas de LIA, al poseer los antígenos depositados en tiras, requieren de los siguientes
pasos: 1° agregar la muestra a detectar los anticuerpos, 2° lavado para eliminar el exceso de
anticuerpos que no se unió, 3° agregar el anticuerpo secundario conjugado con la enzima
reveladora, 4° lavado para eliminar el exceso de anticuerpos que no se unieron, 5° agregar
sustrato de la enzima para revelar la reacción y 6° observar la presencia o ausencia de
bandas. El revelado de la reacción ocurre porque la enzima cataliza el sustrato formando un
producto coloreado que precipita en el lugar de la reacción, debido a esto es que la
reacción positiva se observa en forma de bandas coloreadas.

La intensidad de la banda puede ser débil para ser considerar positiva, sin embargo debe
ser claramente diferente a los sectores que no poseen antígenos depositados.

La imagen a la izquierda muestra 18 bandas en degrade, mostrando distintos grados de

intensidad que se podrían observar en LIA. Al observar esta figura (aplica para la calidad
original y en la pantalla de un computador), se observa que la última línea fácil de
identificar es la 16. Las línea 17 necesita de forzar demasiado la vista para identificar que
existe una línea. Debido a esto se puede considerar positiva desde la banda 16 hacia arriba.
Nota: Esta diferenciación cambia cuando se observa la figura impresa, ya que depende
mucho de la calidad de impresión.

Para evitar la subjetividad de la vista humana, algunos proveedores han desarrollado

softwares de análisis de bandas entregando un valor numérico. Pero dicho análisis requiere
de bandas control en la tira de LIA. La adquisición del software es opcional, ya que solo servirá para
decidir si una banda muy débil se considera como positiva o negativa, de todos modos, los resultados
generalmente son bandas claramente visibles.

70
 Ejemplos de inmunoensayos en línea

ALERGIAS

Las reacciones alérgicas involucran reacciones de hipersensibilidad dependientes de IgE, las cuales se
manifiestan como reacciones de la piel (urticaria, dermatitis), del tracto respiratorio (asma, rinitis o
sinusitis), de los ojos (conjuntivitis), del tracto gastrointestinal (dolor abdominal, hinchazón, vómitos,
diarrea) y la reacción más severa, la anafilaxis sistémica.

El diagnóstico de enfermedad alérgica humana es realizado principalmente por la historia clínica del
paciente, en donde se evidencia objetivamente la reacción alérgica luego de ser expuesto a un alérgeno
conocido o de sospecha. Durante la historia clínica se requieren de varios factores para considerar
incluyendo las características sintomatológicas (ubicación, reproducibilidad, severidad, duración, desfase
en su aparición después de exposición), factores atópicos (historia familiar, edad de manifestación,
dermatitis atópica infantil), oportunidad de sensibilización (geografía, estación, empleo, pasatiempos) y
comorbilidades (pólipos nasales, sinusitis recurrente, enfermedad pulmonar obstructiva crónica).
Además el diagnostico se apoyan por medio de pruebas que se dividen en dos: Pruebas in vivo de
provocación y pruebas de laboratorio in vitro.

En el grupo de pruebas de provocación están consideradas la de tipo puntura (PT) y la intradérmica (ID).
Estas consisten en colocar un extracto alergénico en contacto con las células cutáneas, las que
reaccionan liberando mediadores inflamatorios locales que promueven la formación de una pápula con
eritema, demostrando la presencia de IgE específica para el alérgeno testado. Los resultados son
obtenidos a los 15 o 30 minutos y la respuesta positiva se manifiesta como una pápula con halo de
hiperemia, donde el diámetro de la pápula debe ser >3 mm, según criterios internacionales de
positividad pre-establecidos, independientemente del extracto estandarizado utilizado.
71
Las pruebas de laboratorio usadas para el diagnóstico incluyen la determinación de los niveles totales de
IgE. Esta prueba por si solas no es suficiente para diagnosticar alergias, ya que es compleja de
interpretar, debido a que no se ha establecido cual es el valor de IgE que se relaciona con alergias.
Además la prueba carece de especificidad ya que los anticuerpos IgE son necesarios pero no suficientes
para causar los síntomas de alergia. También los niveles elevados de IgE pueden ser útiles para
diagnóstico, pero niveles normales o bajos no excluyen un mecanismo mediado por IgE.

Otra prueba de laboratorio de diagnóstico de alergia es la determinación de los niveles de sIgE las que se
pueden cuantificar mediante el ensayo RAST (Radio Allergo Sorbent Test o prueba radioalergosorbente),
la cual es una prueba realizada en microplacas donde se utilizan anticuerpos anti-IgE conjugado con
radioisótopos para revelar la reacción. Debido al problema en la salud humana de usar radioisótopos, es
que se han desarrollado las variantes EAST (Enzyme Allergo Sorbent Test) y FAST (Fluorescent Allergo
Sorbent Test).

Otras técnicas de laboratorio para diagnosticar alergias incluyen la cuantificación de la concentración de

Triptasa de los mastocitos. La enzima Triptasa es una enzima liberada por los mastocitos cuando son
activados, sin embargo los basófilos también la liberan pero en cantidades 500 veces inferior, por lo que
los niveles de Triptasa se consideran como indicador de la actividad de mastocitos. Otro marcador que se
puede determinar es el leucotrieno C4 de basófilos.

Gracias a los avances en las pruebas diagnósticas se han podido generar pruebas cualitativas que
determinan sIgE mediante inmunoensayos en línea. Estos ensayos tienen la ventaja que en una sola tira
reactiva, se pueden determinar la reacción frente a diferentes alérgenos, pudiendo abarcar un panel más
grande a partir de una sola tira de inmunoblot.

Referencias
1. Arruda Chaves E. Pruebas diagnósticas en alergia y su utilidad clínica (2004) Rev Med Hered 15 (2):
113-117
2. Rich, Robert, Fleicher Thomas, Shearer William, Schoereder Harry, Frew Anthony, Weyand Cornelia.
3. Clinical immunology: Principles and Practice. (2018) Fifth edition Elsevier.

72
KIT: EUROLINE INHALATION "MEXICO" (IgE) - EUROIMMUN
INICIO DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “EUROLINE INHALATION "MEXICO" (IgE)”

EUROLINE INHALATION "MEXICO" (IgE)

Indicación: El kit de prueba EUROLINE es usado para el diagnóstico de sensibilización que puede
desarrollar síntomas asociados a alergia como conjuntivitis, rinitis o problemas gastrointestinales. Estos
síntomas pueden ser causados por una reacción inmune equivocada guiando al incremento de la
concentración de inmunoglobulina clase E (IgE), los cuales son medidos usando esta prueba.

Aplicación: La prueba EUROLINE es diseñada una determinación cualitativa in vitro de IgE alérgeno-
especifico (sIgE) en suero o plasma, contribuyendo al diagnóstico de alergias. La prueba es un ensayo
multiparamétrico que contiene combinaciones optimizadas de alérgenos relevante permitiendo el
análisis simultaneo de sIgE contra diferentes alérgenos.

Principio de la prueba: La prueba contiene tiras de prueba cubiertas de 37 alérgenos diferentes. Las tiras
de prueba son humedecidas primariamente y luego incubadas con la muestra del paciente en el primer
paso de reacción. Si la muestra contiene anticuerpos específicos de clase IgE, estos se unirán a os
alérgenos puestos en las tiras. Para detectar la unión de anticuerpos, una segunda incubación en llevada
a cabo usando un anticuerpo anti IgE humana conjugada con enzima (conjugado enzimático) catalizando
una reacción coloreada.

Contenidos de kit de la prueba

Componente Formato Símbolo
Tiras del test recubiertas de alérgenos: g2, g5, g6,
g10, g14, t3, t7, t19, t210, t20, t14, t15, w1, w4, w6,
16 tiras [STRIPS]
w8, w10, w11, w14, w15, w100, d1, d2, h1, i6, e1, e2,
es4, m1, m2, m3, m6, m20, m5, m11, m14, CCD.
Conjugado enzimático
Anticuerpo anti IgE humana conjugada a fosfatasa 1 x 20 ml [CONJUGATE]
alcalina (ratón), listo para usar.
Buffer universal
1 x 100 ml [BUFFER 10X]
Concentrado 10X
Solución de substrato
Nitro blue tetrazolium chloride / 5-Bromo-4- 1 x 30 ml [SUBSTRATE]
chloro-3-indolylphosphate (NBT/BCIP), listo para usar
Bandeja de incubación, volumen reducido (400 µl) 2 x 10 canales [TRAY]
Lamina de plástico 1 hoja
Instrucciones del test 1 folleto
Descripción del lote Temperatura de almacenamiento
Diagnostico in vitro dispositivo medico Sin abrir usable hasta

73
 Preparación y estabilidad de los reactivos

Nota: Todos los reactivos deben ser llevados a temperatura ambiente (18 – 25 °C) aproximadamente 30
minutos antes de su uso. Sin abrir, los reactivos son estables hasta la fecha de expiración indicada
cuando se almacenan a 2 – 8 °C. Después de la apertura inicial, los reactivos son estables por 12 meses o
hasta la fecha de expiración, en caso de que sea menor, a menos que se indique lo contrario en las
instrucciones. Los reactivos abiertos deben ser almacenados a 2 – 8 °C y protegidos de la contaminación.

- Tiras de test recubiertas: Listas para su uso. Abrir el envase con las tiras de test solo cuando las tiras
han alcanzado la temperatura ambiente para prevenir la condensación de estas. Después de remover
una tira el envase debería ser sellado fuertemente y almacenado de 2 – 8 °C.

- Conjugado enzimático: Listo para usar. Mezclar vigorosamente antes de usar

- Buffer universal: El buffer universal es suministrado como un concentrado 10x. Para la preparación del
buffer universal de trabajo batir la botella. La cantidad requerida debería ser removida de la botella
usando una pipeta limpia y diluir 1:10 con agua destilada o desionizada. Debido a la membrana especial
usada en el presente EUROLINE el buffer universal de trabajo es usado para la dilución de la muestra de
paciente y el lavado de las tiras de trabajo. Para la incubación de una tira de test, 2 ml de buffer
concentrado debería ser diluido en 18 ml de agua destilada. El buffer universal de trabajo debería ser
usado en el mismo día de trabajo.

- Solución de sustrato: Listo para usar. Cerrar la botella inmediatamente después del uso, debido a que
el contenido es sensible a la luz.

Almacenamiento y estabilidad: La prueba debe ser almacenada a temperaturas entre 2 – 8 °C. No

congelar. Sin abrir, todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de vencimiento indicada.

Manejo de desechos: Las muestras d pacientes y las tiras de prueba debería ser manejadas como
desecho infeccioso. Los otros reactivos no necesitan ser colectados de forma separada, a menos que se
indique lo contrario en las regulaciones oficiales.

Advertencia: Algunos de los reactivos contienen el agente azida de sodio en concentraciones no

declarables. Evitar el contacto con la piel.

Preparación y estabilidad de las muestras de pacientes

Muestras: Suero humano o plasma con EDTA, heparina o citrato.

Estabilidad: Las muestras de pacientes a ser investigadas pueden ser almacenadas generalmente
almacenadas de 2 a 8 °C hasta 14 °C. Las muestras diluidas deberían ser incubadas dentro del día de
trabajo.

Dilución de la muestra:
Versión a: Las muestras de pacientes a analizar son usadas sin diluir

74
Versión b: Diluir 175 µl de la muestra del paciente con 250 µl de buffer universal de trabajo y mezclar a
través de vortex. El volumen final debería ser 425 µl.
Versión c: Diluir 100 µl de muestra de paciente con 1 ml del buffer universal de trabajo y mezclar a
través de vortex. El volumen final debería ser 1,1 ml.
Las pipetas de muestras no son adecuadas para mezclar.

Incubación

Pre tratamiento: Remover la cantidad requerida de tiras de test en la bandeja de incubación.

Llenar cada canal con 1,0 ml de buffer universal de trabajo e incubar las tiras de
prueba por 5 minutos. Después del tiempo aspirar para remover todo el líquido.

Incubación de la Manual:
muestra: Versión a (optimizado en tiempo): Llenar cada canal de la bandeja de incubación
(1er paso) con 400 µl de muestra sin diluir e incubar por 60 minutos a temperatura
ambiente (18 – 25 °C) en agitador automático.
Versión b (optimizado en volumen y tiempo): Llenar cada canal de la bandeja de
incubación con 425 µl de muestra sin diluir (175 µl de muestra + 250 µl de buffer
universal de trabajo) e incubar por 2 horas a temperatura ambiente (18 – 25 °C)
en agitador automático.
Versión c (optimizado en volumen): Llenar cada canal con 1,1 ml de 1:11 de
muestra diluida e incubada toda la noche (12 a 24 horas) en agitador a
temperatura ambiente (18 a 25 °C). El uso de la bandeja de incubación con
capacidad de 1 ml y 400 µl es posible de usar. (Cubrir la bandeja de incubación
para evitar evaporación)

Automático:
Versión b (optimizado en volumen y tiempo): El volumen de incubación debe ser
aumentado 510 µl (210 µl de muestra + 300 µl de buffer universal de trabajo).
Versión c (optimizado en volumen): En la versión C con la muestra diluida 1:11
toda la noche, el volumen de incubación se debe incrementar a 1,65 ml (150 µl
de muestra + 1,5 ml de buffer universal de trabajo.

Precaución: La versión c no es adecuad para las bandejas reducidas en volumen,

se debería usar bandejas de 1 ml.

Lavar Manual:
Aspirar todo el líquido de cada canal, eliminar y lavar 3 x 5 minutos cada uno con
1,0 ml de buffer universal de trabajo en un agitador.
Automático: En la versión C con la muestra diluida 1:11 toda la noche, un
volumen de 1800 µl debe ser usado en el primer paso de lavado.

Incubación de Pipetear 1,0 ml de conjugado enzimático (anti IgE humana conjugado con
conjugado: fosfatasa alcalina) dentro de cada canal e incubar por 60 minutos a temperatura
(2do paso) ambiente (18 – 25 °C) en un agitador automático.

75
Lavar Aspirar y eliminar el líquido de cada canal. Lavar como se describió arriba.

Incubación de Pipetear 1,0 ml de solución de sustrato dentro de los canales de la bandeja de

sustrato: incubación. Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente (18 – 25 °C) en un
(3er paso) agitador.

Parada: Aspirar y eliminar el líquido de cada canal y lavar cada tira 3 x 1 minuto con agua
destilada.

Evaluar: Colocar la tira de test en el protocolo de evaluación, secar al aire y evaluar.

Para incubaciones automáticas con el EUROBlotMaster seleccionar el programa Euro11 Allerg EL60
(versión a), Euro08 Aller 2h (versión b) o Euro12 Allerg 16h (versión c).

Para incubación automática con el EUROBlotOne seleccionar el programa EURO 11 Allergy EL60 (versión
a), EURO 08 Allergy 2h (versión b) o EURO 12 Allergy 16h (versión c).

Interpretación
Manejo: Después de detener la reacción usando agua desionizada o destilada, colocar la tira de prueba
en el papel adhesivo verde del protocolo de trabajo (creado de antemano en el programa
EUROLineScan) usando un par de pinzas. La posición de las tiras de prueba puede ser corregida mientras
se secan. Tan pronto como se coloca la tira en el protocolo, se debe aplastar usando papel filtro y dejar
secar al aire. El proceso de secado se debería realizar protegido de la luz directa, en un ambiente tan
oscuro como sea posible. Después del secado, las tiras de prueba serán adheridas en la lámina adhesiva.
Las tiras incubadas que aún están húmedas muestran un ruido de fondo coloreado que desaparece
cuando se secan completamente. Por lo tanto la evaluación de las tiras de prueba solo se realiza después
del secado completo de estas.

Para evaluaciones digitales siga las instrucciones en el manual usuaria del EUROLineScan. El código para
ingresar al test dentro del EUROLineScan es Inhalation Mexico_V2.

Precaución: Una banda indicadora se ubica en la parte inferior final de la banda control. La incubación
fue realizada correctamente si una reacción de color es vsivle en la banda control. La prueba es válida si
el indicador es detectado al menos con un EAST clase 3.

Algunas muestras podría mostrar un background de tinción oscura en la membrana y bandas blancas
en la posición del antígeno. Estas bandas claras deberían ser interpretadas como negativas.
Una banda indicadora menor a EAST clase 3 indica una incubación incorrecta. La incubación debería
ser repetida con nuevo reactivos.

Cuando se usa el EUROLineScan, la intensiDad de las bandas es calcula en clases EAST de 0 a 6. EAST es la
abreviación de Prueba alergo-sorbente Enzimática (ingles: Enzyme-Allergo-Sorbent Test) y es con
respecto a los grados de concentración idénticos con el bien conocidos sistema RAST (Radio-Allergo-
Sorbent Test) usado en diagnóstico de alergias.

Las clases pueden ser divididas en las siguientes concentraciones:

76
 Clase Concentración (kU/l)
0 < 0,35
1 0,35 < sIgE < 0,7
2 0,7 < sIgE < 3,5
3 3,5 < sIgE < 17,5
4 17,5 < sIgE < 50
5 50 < sIgE < 100
6 > 100
Para diagnosticar, el cuadro clínico del paciente siempre debe tenerse en cuenta junto con los hallazgos
serológicos.
Resultado
No existe detección de anticuerpos específicos
Titulo muy bajo de anticuerpos. No existe manifestación clínica
donde la sensibilización está presente.
Titulo bajo de anticuerpos; Existe sensibilización,
frecuentemente con síntomas clínicos en el rango alto de la
clase.
Titulo significativo de anticuerpos, presenta usualmente
síntomas clínicos.
Titulo alto de anticuerpos, casi siempre con síntomas clínicos.
Titulo muy altos de anticuerpos.
Titulo muy altos de anticuerpos.
77
Alérgenos: La tira del test incluye los siguientes alérgenos:

POSICION CODIGO DE ALERGENO NOMBRE DE ALERGENO

1 g2 Grama
2 g5 Centeno
3 g6 Hierba Timoteo
4 g10 Pasto ruso
5 g14 Avena
6 t3 Abedul
7 t7 Roble
8 t19 Acacia
9 t210 Aligustre
10 t20 Mezquite
11 t14 Álamo
12 t15 Fresno blanco
13 w1 Pasto hediondo (Ambrosía)
14 w4 Ambrosia falsa
15 w6 Artemisa
16 w8 Diente de león
17 w10 Pie de ganso
18 w11 Cardo ruso
19 w14 Moco de Pavo / Bledo
20 w15 Chamizo
21 w100 Alazán / Acedera
22 d1 Dermatophagoides pteronyssinus
23 d2 Dermatophagoides farinae
24 h1 Polvo de la casa
25 i6 Cucaracha Alemana
26 e1 Gato
27 e2 Perro
28 es4 Mezcla de pájaros jaula 1
(periquito, pollo, canario, ganso)
29 m1 Penicillium notatum
30 m2 Cladosporium herbarum
31 m3 Aspergillus fumigatus
32 m6 Alternaria alternata
33 m20 Mucor mucedo
34 m5 Candida albicans
35 m11 Rhizopus nigricans
36 m14 Epicoccum purpurascens
37 CCD Marcador CCD
38 Ind Banda indicadora

78
 Características del test
Rango de medición: El EUROLINE es un método semicuantitativo. El rango de medición está dado por el sistema
EAST de clases 0 a 6.

Reacciones cruzadas: Debido a la estructura similar de los alérgenos, ejemplo similitudes en sustancia químicas o
reacciones botánicas, las reacciones cruzadas podrían ocurrir. Los anticuerpos específicos IgE que han sido
desarrollados en pacientes también mantienen epítopes idénticos de proteínas alergénicas homologas.

Ejemplo de reacciones cruzadas entre inhalables y alérgenos alimenticios

Alérgeno inhalable Alérgeno alimenticio asociado
Césped Tomate, papa, zanahoria, apio, ajo, cebolla, trigo, arroz, arvejas, maní,
manzana, durazno, naranja, melón, kiwi
Abedul Avellana, nuez, manzana, pera, zanahoria, apio, papa, naranja, kiwi
Artemisa Apio, zanahoria, especias, mostaza, avellana
Ambrosia Melón, pepino, plátano
Plátano Inglés Melón
Látex Palta, papa, plátano, tomate, nuez, kiwi

Interferencias: Sueros hemolíticos, lipémicos e ictéricos con concentraciones hasta 5 mg/ml de hemoglobina, 20
mg/ml de triglicéridos y 0,4 mg/ml de bilirrubina no muestran efectos en ls resultados analíticos del presente
EUROLINE.

Variaciones inter- e intra-ensayo: La variación inter-ensayo fue determinada por análisis múltiples de muestras
caracterizadas en diferentes días. La variación intra-ensayo fue determinada por análisis múltiples de muestras
caracterizadas en un día. En cada caso, la intensidad de las bandas estuvo en el rango especificado. Este EUROLINE
muestras excelente reproducibilidad inter e intra-ensayo.

Sensibilidad y especificidad: La sensibilidad del EUROLINE con respecto al sistema de inmunoCAP es para la hierba
Timoteo (g6) 90%, para abedul (t3) 90%, para Dermatophagoides pteronyssinus (d1) 83%, para Dermatophagoides
farinae (d2) 84%, para gatos (e1) 98% y para caballo (e3) 82%.

La especificidad del EUROLINE con respecto al sistema inmunoCAP es para hierba Timoteo (g6) 100%, para abedul
(t3) 100%, para Dermatophagoides pteronyssinus (d1) 100%, para Dermatophagoides farinae (d2) 86%, para gatos
(e1) 91% y para caballo (e3) 100%.

Hierba Timoteo (g6) EUROLINE Abedul (t3) EUROLINE

n = 94 Pos. Neg. n = 97 Pos. Neg.
Pos. 64 7 Pos. 55 6
InmunoCAP Neg. 0 23 InmunoCAP Neg. 3 33
Dermatoph. Pt. (d1) EUROLINE Dermatoph. Far. (d2) EUROLINE
n = 44 Pos. Neg. n = 45 Pos. Neg.
Pos. 25 5 Pos. 26 5
InmunoCAP Neg. 0 14 InmunoCAP Neg. 2 12
Gato (e1) EUROLINE Caballo (e3) EUROLINE
n = 74 Pos. Neg. n = 34 Pos. Neg.
Pos. 50 1 Pos. 9 2
InmunoCAP Neg. 2 21 InmunoCAP Neg. 0 23
79
 Limitaciones del diagnóstico de alergias in vitro
El rendimiento preciso de los ensayos de acuerdo con las instrucciones del test conducirá a resultados confiables y
reproducibles. En algunos casos, el diagnostico final no debería ser solamente basado en un tipo de análisis. Una
anamnesis bien fundada y hallazgos de laboratorio posteriores deberían siempre tomados en cuenta. Las pruebas
cutáneas y de provocación (si es posible) son obligatorias para recibir la información completa necesaria para una
decisión óptima respecto a la inmunoterapia específica que debería ser aplicada. La fotografía clínica no siempre
está en línea con los resultados in vitro.

Los resultados negativos in vitro pueden ocurrir cuando:

- Los síntomas no son mediados por IgE
- Las muestras fueron obtenidas cuando el organismo fuera capaz de producir anticuerpos contra el
antígeno.
- La concentración de IgE alcanza un mínimo un tiempo prolongado después de la sensibilización.

Los resultados positivos con IgE específica en pruebas in vitro no necesariamente se correlaciona con
manifestaciones clínicas.

Muchos anticuerpos IgE pueden reaccionar de forma cruzada con varios alérgenos o estructuras de carbohidratos
redundantes. Especialmente los alérgenos alimentarios frecuentemente muestran un resultado negativo in vitro
aunque los síntomas clínicos pueden estar presentes. Este fenómeno puede ser explicado a través del efecto de
maduración, procesamiento industrial, cocinar o fritura del alérgeno. Además la reacción alérgica puede ser
inducida por metabolitos del alérgeno que resultan del proceso digestivo in vivo, el cual no puede ser
exactamente recreado por el diagnostico in vitro. Sobre todo, algunos alimentos es probable que sean muy
sensibles al proceso de acoplado a la fase solida por lo que no todos los alérgenos pueden estar presente en su
forma nativa.

Para la determinación de anticuerpos específicos IgE existen distintas variedades de sistema de pruebas. Debido a
la variedad de las fuentes de material usado para la producción de los extractos de alérgenos y los procedimientos
de manufactura, la calidad de los extractos usados para el diagnóstico de alergia varía significativamente. Por lo
tanto los resultados de diferentes sistemas de pruebas no pueden ser fácilmente comparados unos con otros,
debido a la falta de estándares internacionales tanto para los alérgenos, como los anticuerpos usados en el
ensayo. Así una variación leve entre diferente sistema de pruebas no pueden ser descartado y no es un criterio
general para la calidad de los ensayos.

En general los resultados idénticos para diferentes pacientes no significan similitud en las manifestaciones clínicas.

Significancia clínica
El término de alergia fue originalmente definido por Clemen von Pirquet para referirse a la habilidad exagerada
del cuerpo de reaccionar frente a sustancia extrañas. Hoy en día el término de alergia significa un sobre-
sensibilidad a sustancia extrañas las cuales normalmente no producen daño. Junto a cualquier predisposición
genética, numerosos factores no genéticos también juegan un rol como exposición a alérgeno, condición
nutricional, enfermedad crónica existente e infección viral aguda. La atopia es una disposición hereditaria a
desarrollar reacciones alérgicas como el asma alérgico, rinitis (fiebre del heno) o dermatitis (incluyendo eccema
atópico).

La alergia más frecuente de ocurrencia es la hipersensibilidad tipo I, en la cual se forman anticuerpos específicos
clase IgE. Los síntomas (erupción cutánea o picazón) generalmente ocurren inmediatamente después del contacto

80
con el alérgeno. Esas alergias son por lo tanto denominadas como reacciones tipo inmediatas. Los alérgenos se
adquieren a través del aire y las membranas mucosas del cuerpo (alergias por inhalación) o por ingestión (alergias
a los alimentos).

Más del 15% de la población en los países industrializados padece una alergia de tipo inmediato. Las reacciones
alérgicas típicas son rinitis, conjuntivitis y asma alérgica. Se ha observado un aumento mundial de la rinitis
alérgica, con una prevalencia del 4% a más del 40% en varias regiones. Las alergias por inhalación pueden ser
provocadas por alérgenos estacionales (polen de árboles, pastos y malezas) o alérgenos en interiores durante todo
el año (ácaros del polvo, animales domésticos, esporas de moho). Los síntomas alérgicos se intensifican con cada
exposición posterior al alérgeno. Si se produce una reacción alérgica sistémica, pueden producirse reacciones
graves que pueden poner en peligro la vida (shock anafiláctico).

Una alergia alimentaria es una reacción mediada por IgE que conduce a síntomas a las pocas horas de haber
ingerido el alimento. Los alimentos más comunes que causan reacciones alérgicas son el maní, la soya, el trigo, los
mariscos, el pescado, la leche, los huevos y los frutos secos. Los posibles síntomas son ardor o picazón en la
cavidad oral, náuseas, espasmos gastrointestinales, diarrea y erupciones cutáneas. Las reacciones graves también
pueden provocar ataques de asma, disnea, aumento del ritmo cardíaco y ataques de pánico y confusión. En casos
raros puede ocurrir anafilaxia (por ejemplo, después del consumo de maní, nueces o pescado).

Sin embargo, las reacciones alérgicas a los alimentos de origen vegetal también pueden ser causadas por
anticuerpos IgE de reacción cruzada. Estas reacciones, denominadas alergias cruzadas, se basan en la similitud
estructural entre las proteínas que están presentes tanto en el alimento como en los alérgenos de inhalación
correspondientes de origen vegetal. Por ejemplo, los pacientes con alergia al polen de abedul también pueden
desarrollar reacciones alérgicas a la manzana, el apio, la avellana, la papa o el kiwi.

La inmunoterapia o la hiposensibilización (desensibilización) establecida como un tratamiento para la alergia de

tipo I no provocan un cambio en los niveles de IgE, aunque se puede lograr una reducción significativa de los
síntomas. Una respuesta definitiva de un paciente a la inmunoterapia normalmente se manifiesta como un
aumento en la concentración de anticuerpos IgG específicos para el alérgeno durante el curso del tratamiento. Sin
embargo, esto no siempre se correlaciona con una remisión en los síntomas.

Muchos alérgenos son glicoproteínas y contienen cadenas laterales de oligosacáridos que están unidas a la
estructura proteica de los alérgenos. Algunos pacientes desarrollan anticuerpos específicos contra estas
estructuras de carbohidratos. La abreviatura CCD significa determinante de carbohidratos de reactividad cruzada.
Los CCD están presentes en muchos alérgenos de plantas y animales. Debido a su significativa similitud en la
estructura, se sabe que los CCDs causan una fuerte reactividad cruzada. Aunque la importancia de los anticuerpos
IgE específicos contra los CD aún no se ha entendido completamente, en la mayoría de los casos se considera que
son irrelevantes para el diagnóstico y, como tal, complican la interpretación de los resultados diagnósticos
positivos in vitro. Por esta razón, la presencia de anticuerpos IgE específicos contra CCD puede proporcionar
información adicional útil, especialmente cuando los resultados positivos de IgE no están de acuerdo con el cuadro
clínico, y pueden servir como ayuda para la interpretación en la evaluación de los resultados generales del test.

Además del sistema de prueba descrito, hay otros métodos disponibles para la detección de anticuerpos de clase
IgE contra alérgenos. Con el EUROASSAY, se pueden detectar simultáneamente anticuerpos contra hasta 30
alérgenos por portaobjetos. Las tiras de membrana recubiertas con finas líneas paralelas de varios antígenos
purificados y caracterizados bioquímicamente se utilizan como fase sólida que contiene antígeno. Las membranas
se fijan a portaobjetos en forma de BIOCHIPs. EUROLINE permite la diferenciación de las reacciones alérgicas a los
alérgenos por inhalación, los alérgenos alimentarios y los alérgenos de reacción cruzada (alergias alimentarias
asociadas al polen). Anticuerpos contra hasta 54 alérgenos por tira se pueden detectar monoespecíficamente en
paralelo. Las pruebas de EUROLINE con diferentes configuraciones de alérgenos están disponibles para diferentes
81
aplicaciones de diagnóstico, por ejemplo, atopia, inhalación, alimentos y reacciones cruzadas. El procesador
EUROBlotOne y el software de evaluación EUROLINEScan proporcionan el procesamiento totalmente automático
de las pruebas de inmunotransferencia, incluidos el pipeteado de muestras, la incubación y la evaluación de las
tiras reactivas. Alternativamente, la incubación y evaluación de las tiras reactivas se puede automatizar utilizando
el sistema EUROBlotMaster en combinación con EUROLineScan. Las microplacas ELISA se utilizan para determinar
la concentración total de IgE en el suero para diferenciar entre asma alérgica e intrínseca, entre rinitis alergica y
vasomotora y entre dermatitis atópica y seborreica. El ELISA de microtitulación Allercoat ™ 6 permite la
determinación de concentraciones de IgE específicas de alérgenos en el suero para investigar reacciones alérgicas
a más de 600 alérgenos y mezclas de alérgenos diferentes. Este método de prueba también se puede realizar y
evaluar automáticamente.

Referencias
1. Arruda LK, Sole D, Baena-Cagnani CE, Naspitz CK. Risk factors for asthma and atopy. Curr Opin
Allergy Clin Immunol 5 (2005) 153-159.
2. Boullay ME, Boulet LP. The relationships between atopy, rhinitis and asthma: pathophysiological considerations.
Curr Opin Allergy Clin Immunol 3 (2003) 51-55.
3. Caballero T, Martin-Esteban M. Association between pollen hypersensitivity and edible vegetable allergy: A
review. Invest Allergol Clin Immunol 8 (1998) 6-16.
4. Eigenmann PA, Calza AM. Diagnosis of IgE-mediated food allergy among Swiss children with atopic dermatitis.
Pediatr Allergy Immunol 11 (2000) 95-100.
5. EUROIMMUN AG. Meyer W, Scheper T, Lehmann H, Stöcker W. Selbstklebende Blotmembranen. Eingetragenes
deutsches Gebrauchsmuster DE 202 15 268.5 (2003).
6. EUROIMMUN AG. Meyer W, Scheper T, Stöcker W. Vorrichtung zur Antikörperdiagnose mit kombinierten
Membranen. Eingetragenes deutsches Gebrauchsmuster DE 202 15 270.7 (2003).
7. EUROIMMUN AG. Meyer W, Siegemund M, Stöcker W. Vorrichtung zum immunenzymatischen Nachweis von
Antikörpern in einer flüssigen Probe. Eingetragenes deutsches Gebrauchsmuster DE 20 2006 006 622.5 (2006).
8. EUROIMMUN AG. Schlumberger W, Meyer W, Proost S, Dähnrich C, Müller-Kunert E, Sonnenberg K, Olbrich S,
Stöcker W. The new EUROBLOT technology: Differentiation of Autoantibodies against cell nuclei. European Journal
of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 33 (1995) 116.
9. EUROIMMUN AG. Stöcker W, Rateike M, Morrin M. Verfahren zur Herstellung Festphasengebundener
Bioreagenzien. Europäische Patentanmeldung PCT/EP/2005/000974 (2005).
10. Frew AJ. The immunology of respiratory allergies. Toxicology Letters 86 (1996) 65-72.
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13. Schoenwetter WF. Allergic rhinitis: epidemiology and natural history. Allergy Asthma Proc 21 (2000) 1-6.
14. Valenta R, Kraft D. Type I allergic reactions to plant-derived food: A consequence of primary sensitization to
pollen allergens. J Allergy Clin Immunol 97 (1996) 893-895.

FIN DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “EUROLINE INHALATION "MEXICO" (IgE)”

82
 DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTINUCLEARES

INMUNOFLUORESCENCIA

El uso de inmunofluorescencia por microcopia para la detección de anticuerpos en suero de pacientes

fue una de las primeras técnicas desarrolladas en inmunopatologías. El principio de la prueba de es
sencillo. Un sustrato es montado en una lámina de vidrio (portaobjetos habitualmente) y anticuerpos
marcados con un fluoróforo son usados para identificar la presencia del en antígeno en el sustrato (IF
directa) o el anticuerpo en el sustrato (IF indirecta) usando un microscopio de fluorescencia. La
inmunofluorescencia directa (IFD) requiere de anticuerpos unidos a fluoróforos de especificidad
conocida, mientras que la inmunofluorescencia indirecta (IFI) necesita de anticuerpos fluorescentes
contra las inmunoglobulinas humanas. El sustrato usado en las técnicas pueden ser secciones de tejidos,
células cultivadas o incluso microorganismos (Ejemplo Crithidia luciliae). La IF tiene muchas desventajas;
la más importante de estas son las siguientes: Consume tiempo, trabajo laborioso, requiere de
operadores entrenados, y tiene un componente subjetivo que puede causar una variación significativa
de los resultados. Por esta razón se ha puesto interés en tratar de automatizar este proceso.

Ejemplo de soportes celulares para pruebas de inmunofluorescencia indirecta. A la izquierda corresponde a un corte
histológico. Al centro se observan células obtenidas en cultivo. A la derecha se observa el uso de protozoos.

ANTICUERPOS ANTINUCLEARES

El termino de anticuerpos antinucleares (ANA) se refiere a un gran grupo de autoanticuerpos que

reconocen antígenos celulares encontrados principalmente, aunque no exclusivamente, en el núcleo de
las células. Estos anticuerpos se asocian con numerosas enfermedades autoinmunes, con más
importancia para el lupus eritematoso sistémico (LES), pero se podrían encontrar en enfermedades
infecciosas, enfermedades malignas y aparentemente en individuos sanos. La primera pista observada
de la existencia de ANA fue hecha en 1948 en una serie de paciente con LES. Esto derivó en las
denominadas células LE: Un granulocito de medula ósea que había aparentemente ingeridos material
nuclear de otras células.

Las siguientes investigaciones in vitro revelaron que este fenómeno podría ser inducido en la medula
ósea de sujetos sanos agregando plasma de pacientes con LES lo cual resultó en un elemento en la
fracción de globulinas del suero con afinidad por el núcleo de células. Por varias décadas, la presencia de
células LE jugó un rol de diagnóstico para LES, siendo parte del criterio de clasificación del colegio
americano de reumatología para LES hasta el año 1997.
83
La inmunofluorescencia indirecta (IFI) fue la primera técnica usada para identificar la presencia de ANA
en el núcleo de células de secciones de tejidos, la cual ha quedado hasta el día de hoy como el gold
standard para su identificación. Estudios tempranos evidenciaron que los ANA podrían ser detectados en
cualquier tejido celular, pero fueron más fácilmente demostrables en esos tejidos en los que las células
se ordenan en formas de patrones. Debido a esta razón los ensayos tempranos usaron una variedad de
tejidos en los cuales las células estaban más organizadas, incluyendo hígado y riñón de rata y ratón. El
uso de estos tejidos, sin embargo, fue problemático, porque sus núcleos eran pequeños, no contenían
todos los antígenos clínicamente significativos –en especial Ro/SSA- y raramente contenían células
mitóticas requeridas para la expresión de algunos antígenos, todo esto reducía su sensibilidad para
detectar ANA en enfermedades humanas. Las técnicas modernas de IFI usan una monocapa de células
epiteliales humanas cultivadas derivadas de carcinoma laríngeo (HEp-2) como el sustrato para los ANA.
Esta línea celular eliminaba varias falencias de los tejidos de roedores, aunque la detección de
anticuerpos anti Ro/SSA en algunas preparaciones era pobre. Por esta razón una versión modificada de
estas células, en las cuales el antígeno Ro/SSA de 60 kDa se hiper expresaban –La línea celular HEp-2000-
son usadas en algunos laboratorios. ELISA y otros métodos más nuevos como los ensayos múltiples de
micropartículas, pueden también ser usadas para la detección de ANA. Como solo puede ofrecer un
testeo contra un número limitado de antígenos, estas pruebas poseen poca sensibilidad para detectar
ANA en comparación a la IFI y no se recomiendan actualmente como pruebas de screening.

El núcleo celular posee miles de antígenos, los cuales pueden ser teóricamente el blanco de los ANA.
Solo en LES se han reportado más de 100 diferentes blancos. Los patrones de inmunofluorescencia
producidos por los ANA en los ensayos IFI se determinan en gran parte por la ubicación de los antígenos
dentro de la célula. Un intento reciente para armonizar la nomenclatura usada para describir los
patrones de IF de ANA en células HEp-2, los dividen en 5 grandes grupos basados en la ubicación del
antígeno blanco. Dentro de cada uno de esos grupos hay entre dos a nueve bases descriptoras en la
aparición de inmunofluorescencia. En esta nomenclatura cualquier anticuerpo que se une a las células
HEp-2 es considerado como “ANA” aunque algunos de los antígenos responsables se ubican
exclusivamente en el citoplasma (ejemplo las mitocondrias), y por lo tanto sus anticuerpos específicos no
son estrictamente anti nuclear. En muchos reportes de laboratorio estos patrones citoplasmáticos son
un informe adicional de los ensayos ANA en células HEp-2. De todos modos, el propósito de esta
nomenclatura es la asociación a una enfermedad de cada patrón con un antígeno blanco. Los consensos
de recomendación actualizado vigilan la medición de autoanticuerpos usando células HEp-2 toman un
leve acercamiento diferente, dividiendo los patrones comunes y los menos observados, pero los
patrones descriptores por sí solos y su asociación son ampliamente la misma.

Una de las dificultades del uso de los patrones de inmunofluorescencia de ANA en el diagnóstico de
enfermedades reumáticas es su falta de especificidad para enfermedades. Esto deriva del hecho que,
con pocas excepciones, el patrón no es específico para un antígeno en particular; antígenos múltiples
podrían causar el mismo patrón y el mismo antígeno puede dar diferentes patrones en diferentes
pacientes. Por esta razón, en la práctica clínica una vez que se identifica la presencia de uno o más ANA
usando un método screening, se ejecuta generalmente un ensayo dirigido para buscar el blanco para
identificar su especificidad: La prueba de anticuerpos contra antígenos extraíble del núcleo y anticuerpos
anti DNA.

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Los ANA se destacan por aparecer en muchas enfermedades autoinmunes, sin embargo, se pueden
encontrar en títulos bajos (ejemplo 1:40) en no más del 32% de pacientes sanos adultos y en títulos altos
(ejemplo 1:160) en el 5%. El título de ANA en una muestra antes de ser considerado como “positivo”
varía entre laboratorios y depende de factores como la técnica y materiales usados. Para la IFI los puntos
de cortes comúnmente usados son títulos de 1:80 o 1:160. Una prevalencia aumentada de ANA en
población adulta ha sido evidenciada en mujeres, en adultos mayores y en primer grado relacionadas a
enfermedades autoinmunes. En niños sanos, los ANA tienen una prevalencia entre 5 a 18%. La mayoría
de esos títulos son entre 1:80 y 1:320; Sin embargo, podrían ocurrir títulos más altos. En general estos
anticuerpos no tienen especificidad contra antígenos asociado con enfermedades autoinmunes y pasado
un tiempo una proporción disminuirá en títulos o desaparecerá. Algunos podrían estar relacionados con
infecciones recurrentes, las cuales inducen autoanticuerpos transitorios. Sin embargo, un número
significativo persistirá, incrementando la preocupación sobre una evolución de una posible enfermedad
autoinmune; Estudios en adultos han encontrado que los autoanticuerpos circulantes pueden ser
encontrados muchos años antes de que se establezcan los síntomas en LES.

A nivel de Chile, el instituto de salud publica en su manual de recomendaciones para la determinación de

anticuerpos antinucleares, recomienda que la técnica de ANA se debe realizar por medio de IFI, ya que
su relevancia clínica radica en los patrones de positividad. Además, recomienda que la dilución inicial de
la muestra para estudio de ANA debe ser 1:80, debido a varios estudios multicéntrico consideran esta
dilución como el valor de corte para ANA para así lograr una sensibilidad y especificidad diagnóstica
adecuada. Esta dilución además refleja la realidad nacional, ya que algunos kits de fabricación Europea,
recomiendan comenzar la dilución inicial con 1:100.

Las muestras que sea positiva para ANA, posteriormente deben ser estudiada para determinar el título, y
este corresponderá a la ultima dilución de la muestra de paciente que de positivo para ANA. Se
recomienda realizar diluciones seriadas de múltiplo de dos hasta llegar a 1:1280, por lo que las diluciones
a estudiar serían las siguiente:

Tubo 1 2 3 4 5
Muestra paciente 10 μl -- -- -- --
Dilución del tubo anterior -- 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl
Buffer de dilución 790 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl
Título 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280

La tabla muestra la clásica dilución seriada en múltiplo de 2 a partir del tubo 2 al tubo 5.

85
Flujograma de interpretación de anticuerpos antinucleares (ANA). Las muestras que son negativas para ANA deben informar
que el patrón nuclear y el patrón citoplasmático está negativo. Para las muestras ANA positiva se deben informar separando
el patrón nuclear del citoplasmático. Esto da 3 posibilidades indicadas en la figura, pero de todos modos el patrón que esté
positivo se debe informar además el titulo obtenido, lo cual no aplica si uno de los dos patrones a informar es negativo.

Referencias:
1. Akikusa J, Choo S. Textbook of Pediatric Rheumatology, Seventh Edition (2016): 117-128.
2. Instituto de salud pública de Chile. Recomendaciones para la determinación de anticuerpos
antinucleares. 2018.
3. Dorresteyn Stevens C, Miller LE. Clinical Inmmunology ans Serology: A laboratory Perspective (2017).
fourth edition. F.A. Davis company, Philadelphia, PA, United States.

86
KIT: IIFT: HEP-20-10 - EUROIMMUN
INICIO DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “IIFT: HEP-20-10"
IIFT: HEp-20-10
Instrucciones para prueba de inmunofluorescencia indirecta

Indicación: Este kit es diseñado para determinación in vitro cualitativa o semicuantitativa de anticuerpos
humanos de clase IgG contra el núcleo celular en muestras de pacientes para el diagnóstico de varias
enfermedades autoinmunes, particularmente aquellas de forma reumática.

Aplicación: La prueba de inmunofluorescencia indirecta es el “estándar de oro” para la determinación de

anticuerpos contra antígenos nucleares (ANA; incluyendo componentes citoplasmáticos). Los
anticuerpos contra el núcleo celular pueden ser determinados en numerosos sustratos. La tecnología
BIOCHIP permite combinar diferentes sustratos en un solo campo de prueba (pruebas multiplex) y ser
incubado con el suero de un solo paciente. La combinación de sustratos celulares HEp-2 o HEp-20-10 con
hígado de primate o puntos monoespecificos (EUROPLUS: SS-A, SS-B, Jo-1, Scl70, nRNP/Sm, Sm,
proteínas rib. P) permite a los resultados ser confirmados y diferenciados ya en la etapa de screening de
ANA y puede arrojar resultados adicionales (ejemplo ENA).
Las células HEp-20-10 han sido optimizadas para formar más células con estadios mitóticos. Esto facilita
la evaluación de los patrones de fluorescencia de ANA que requieren la medición de etapas mitóticas.

Principio del test: Las células HEp-2 son incubadas con muestra diluida del paciente. Si la reacción es
positiva, anticuerpos específicos clase IgA, IgG e IgM se unirán a los antígenos. En un segundo paso, los
anticuerpos unidos serán teñidos fluoresceína conjugada con anticuerpos anti-Ig humana y serán visibles
con un microscopio de fluorescencia.

Contenido del kit para 50 determinaciones

Descripción Formato Símbolo
1. Portaobjetos, cada un contiene 5 BIOCHIPs cubiertos de 10 portaobjetos [SLIDE]
células HEp-2 1 x 15 ml
2. Anticuerpo anti IgG humana (cabra) conjugado con [CONJUGATE]
fluorosceina, lista para el uso. 1 x 0,25 ml
3. Control positive: Autoanticuerpos contra el núcleo celular [POS CONTROL]
(ANA), suero control con información de título, humano, listo
para su uso. 1 x 0,1 ml
4. Control negativo: negativo para autoanticuerpo, humano, [NEG CONTROL]
listo para su uso. 2 packs
5. Sal para PBS pH 7,2 2 x 2 ml [PBS]
6. Tween 20 1 x 3 ml [TWEEN 20]
7. Medio de montaje, listo para su uso 12 Piezas [GLYCEROL]
8. Cubreobjetos (62 mm x 23 mm) 1 Folleto [COVERGLASS]
9. Instrucciones ---
Descripción del lote Temperatura de almacenamiento
Diagnostico in vitro dispositivo medico Sin abrir usable hasta
Los portaobjetos individuales (EUROIMMUN no de orden FB 1520-1005) se proveen en conjunto con
cubreobjetos.
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Controles positivos adicionales (no de orden CA 1570-0102-3) y controles negativos adicionales (no de
orden CA 1000-0101) pueden ser adquiridos.
La ejecución del test requiere de cubetas para los reactivos, las cuales no so previstas por este kit. Estas
son pueden ser adquiridas desde EUROIMMUN bajo el siguiente no de orden:
- ZZ 999-0110 Cubeta de reactivos para portaobjetos conteniendo hasta 10 campos.
- ZZ 9999-0150-1 Cubeta de reactivos para portaobjetos conteniendo sobre 50 campos.

Ejecución del test (campos de reacción de 5 x 5 mm)

La técnica TITELPLANE fue desarrollada por EUROIMMUN en orden de estandarizar análisis

inmunológicos: Las muestras o los anticuerpos marcados son aplicados en el campo de reacción de una
cubeta para reactivos. Los portaobjetos de BIOCHIP están ubicados en el fondo de la cubeta para
reactivos, donde todos los BIOCHIPs del portaobjeto entran en contacto con los fluidos, y las reacciones
individuales comienzan simultáneamente. La posición y la altura de las gotas son exactamente definidas
por la geometría del sistema. Como los líquidos están ubicados en un espacio cerrado, no existe la
necesidad de usar una cámara húmeda convencional. Es posible incubar varias muestras al lado de la
otra y simultáneamente bajo condiciones similares.

Preparar: La preparación de los reactivos y las muestras de suero y plasma es descrita en las páginas
89 y 90 de esta instrucción respectivamente.

Pipetear: Aplicar 30 µl de muestra diluida a cada campo de la cubeta de reacción, evitando la

formación de burbujas de aire. Transferir todas las muestras a ser testadas antes de iniciar
la incubación (sobre 200 gotitas). Use puntas de pipeta de poliestireno.

Incubar: Comenzar la reacción colocando los portaobjetos con BIOCHIPs en los espacios
correspondiente de la cubeta de reacción. Asegúrese que cada muestra haga contacto
con el BIOCHIP en el fondo de la cubeta de reacción. Asegúrese que cada muestra haga
contacto con un solo BIOCHIP y que no se mezcle con otras. Incubar por 30 minutos a
temperatura ambiente

Lavar: Enjuague los portaobjetos de BIOCHIP con un flujo de PBS-Tween usando un vaso
precipitado y sumérjalos inmediatamente después en una cubeta conteniendo PBS-
Tween por al menos 5 minutos. Mezcle con un rotador si está disponible. Lave máximo 16
portaobjetos, luego reemplace el PBS-Tween por uno nuevo.

Pipetear: Aplicar 25 µl de antiglobulina humana conjugada a fluoresceína a cada campo de la

cubeta de reactivos limpia. Agregar todas las gotitas antes de continuar la incubación. El
suero antiglobulina humana debe ser mezclado antes de usar. Para optimizar tiempo, el
conjugado puede ser pipeteado en una cubeta de reactivo aparte durante la incubación
con la muestra diluida.

Incubar: Remover un portaobjeto de BIOCHIP de la cubeta. En 5 segundos seque el líquido en las

partes posterior y los bordes largos del portaobjeto en una toalla de papel absorbente e
inmediatamente coloque el portaobjeto de BIOCHIP dentro de los huecos de la cubeta de
reactivos. No seque las áreas entre los campos de reacción. Revise que existe un contacto
88
 correcto entre los BIOCHIPs y líquidos. Luego continúe con el siguiente portaobjeto de
BIOCHIP. Por este paso, proteja los portaobjetos de la luz directa. Incubar por 30 minutos
a temperatura ambiente (10 – 25 °C).

Lavar: Llene la cubeta con PBS-tween nuevo. Lave el portaobjeto de BIOCHIP con un chorro de
PBS-Tween usando un vaso precipitado y póngalo en una cubeta llena de PBS-Tween
nuevo por al menos 5 minutos. Mézclelo con un agitador automático si está disponible.
Lave máximo 16 portaobjetos luego reemplácelo con nuevo buffer PBS-Tween.

Cubrir: Coloque el medio de montaje en el cubreobjeto - coloque máximo 10 µl por campo de

reacción. Utilice un marco de poliestireno. Remover un portaobjeto de BIOCHIP desde el
PBS Tween y seque la parte trasera y los cuatro bordes con papel absorbente. Coloque el
portaobjeto BIOCHIP, mirando hacia abajo, en el cubreobjeto preparado con medio de
montaje. Revisar inmediatamente que el cubreobjeto calzó perfectamente en el
cubreobjeto. Corrija la posición si es necesario.

Evaluar: Lea la fluorescencia en el microscopio.

Recomendaciones generales: Objetivo 20X (cortes de tejido, células infectadas y
transfectadas, 40X (sustratos celulares).
Filtro de excitación: 450-490 nm, separador de color; 510 nm, filtro de bloqueo: 515 nm.
Fuente de luz: lámpara de vapor mercurio, 100 W, EUROIMMUN LED, luz azul EUROStar.

Incubación automatizada: El kit puede ser incubado usando equipos automatizados, por ejemplo IF
Sprinter, Sprinter XL, EUROLabLiquisHandlr u otros. Las condiciones de incubación y lavado programadas
debería ser la misma como se describió en el procedimiento manual. Las pruebas establecidas por los
dispositivos EUROIMMUN son validadas en combinación con el kit. Cualquier otra combinación tiene que
ser validada por el usuario. Para detalles por favor revise el manual del dispositivo.

Preparación y estabilidad de los reactivos

Nota: Después de la apertura inicial, los reactivos son estables hasta que expire la fecha cuando el
almacenamiento es entre 2 a 8 °C y son protegidos de la contaminación, a menos que se diga lo contrario
abajo.

- Portaobjetos: Listo para su uso. Remover la cobertura protectora una vez que los portaobjetos
alcancen la temperatura ambiente (18 a 25 °C; el agua condensada puede dañar el sustrato). No
toque el BIOCHIP. Si la cobertura protectora está dañada, el portaobjeto no debería ser usado para
diagnóstico.

- Anticuerpo secundario unido a FITC: Listo para su uso. Antes de usarlo por primera vez, mézclelo
vigorosamente. El conjugado es sensible a la luz. Protegerlo de la luz solar.

- Controles positivos y negativos: Listos para su uso. Antes de usar por primera vez, mezcle
vigorosamente. Control positivo con información de título: La marca contiene el patrón y el valor y el
sustrato usado para determinar el patrón. El límite de tolerancia bajo es un título bajo el valor
89
 entregado, el límite de tolerancia alto, alcanza dos niveles títulos sobre el valor entregado. El control
es diluido en PBS-Tween. Después de abrir, el control tiene una vida promedio de 6 meses cuando se
almacena entre 2 a 8 °C. Controles diluidos deben ser incubados dentro del día de trabajo.

- PBS-Tween: 1 pack de “sal para PBS” debería ser disuelto en 1 litro de agua destilada (optimo: aqua
pro infusione, aqua ad injectabila) y mezclada con 2 ml de Tween 20 (mezclar por 20 minutos hasta
que quede homogéneo). El PBS-Tween preparado puede ser almacenado entre 2 a 8 °C,
generalmente por 1 mes. El PBS-Tween no debería ser usado si la solución se vuelve nebulosa o
aparecen elementos de contaminación.

- Medio de montaje: Listo para su uso.

- Cubetas para los reactivos: Los campos de reacción de la cubeta para los reactivos deben ser
hidrofílicos rodeando un área hidrofóbica. Si es necesario, déjelas en Decones 11 universal (número
de orden de EUROIMMUN: ZZ 9912-0101) por 12 horas. Después enjuague abundantemente con
agua y seque. Limpieza: Frote las cubetas de reacción con Extra al 5% MA 01 (EUROIMMUN numero
de orden: ZZ 9911-0130) y enjuague generosamente con agua. Para desinfectar rocíe las cubetas de
reacción generosamente con Mikrozid AF (EUROIMMUN numero de orden: ZZ 9921-0125), gírelo y
déjelo por 5 minutos. Después, enjuague generosa con agua y séquelo.

Almacenamiento y estabilidad: Los portaobjetos y los reactivos deberán ser almacenados a

temperaturas entre 2 a 8 °C. La estabilidad es garantizada por 18 meses después de la fecha de
fabricación si se almacena de forma apropiada.

Manejo de desechos: Las muestras de pacientes, controles y portaobjetos deben de ser manipulados
como materiales potencialmente infecciosos. Todos los reactivos deben de ser desechados de acuerdo
con las regulaciones oficiales de desecho.

Advertencia: El BIOCHIP cubierto de sustratos antígenos ha sido tratado con un agente fijador
desinfectante. El HbsAg ni anticuerpos contra HIV-1, HIV-2 y HCV pudieron ser detectados en el suero
control usando pruebas de ELISA adecuadas o pruebas de inmunofluorescencia. Sin embargo, todos los
componentes de los sistemas del test deberían ser manipulados como material potencialmente
infecciosos. Algunos de los reactivos contiene el agente azida de sodio en un concentración no
declarada, evitar contacto con la piel.

Preparación y estabilidad de las muestras de suero y plasma

Muestras: Suero de humanos o plasma con EDTA, heparina o citrato.

Estabilidad: Las muestras de pacientes para ser analizadas pueden generalmente ser almacenada hasta
14 días en temperaturas entre 2 a 8 °C. Las muestras diluidas deben ser incubadas dentro de un mismo
día de trabajo.

Dilución de muestras recomendadas para mediciones cualitativas: La muestra a ser investigada es

diluida 1:100 en PBS-Tween. Por ejemplo diluya 10,1 µl de muestra en 1000 µl de PBS-Tween y mezcle
vigorosamente, por ejemplo, vortex por 4 segundos. Una dilución adicional de 1:10 puede ayudar para
90
detectar anticuerpos contra aminoacil sintetasas en pacientes con miositis de forma manera más
confiable (por ejemplo agregue 11,1 µl de muestra a 100 µl de PBS-Tween y mezcle vigorosamente,
ejemplo en vortex por 4 segundos).

Dilución de muestra recomendada para evaluaciones semicuantitativa: La dilución de las muestras a

ser investigada es realizada usando PBS-Tween. Agregue 100 µl de PBS-Tween a cada tuve y mezcle con
11,1 µl de la siguiente concentración más alta, ejemplo vortex por 2 segundos. EUROIMMUN
recomienda muestras incubadas para una dilución de 1:100. Una dilución adicional de 1:1º puede ser de
ayuda para detectar anticuerpos contra aminoacil sintetasa en pacientes con miositis de manera más
confiable.
Dilución Esquema de dilución

1:10 100 µl de PBS-Tween + 11,1 µl de muestra sin diluir

11,1 µl Cada dos pasos de
dilución, una
1:100 100 µl de PBS-Tween + 11,1 µl de muestra diluida 1:10 pipeta nueva
11,1 µl debería ser usada
para prevenir el
1:1000 100 µl de PBS Tween + 11,1 µl de muestra diluida 1:100 arrastre
…

Evaluación

Patrones de fluorescencia (reacción positiva): Los anticuerpos contra antígenos nucleares (ANA) pueden
ser encontrados en numerosos sustratos. Ara la determinación y diferenciación especifica de anticuerpos
antinucleares, es usado un sustrato conteniendo células epiteliales humanas (HEp-2). El núcleo muestra
una fluorescencia distintiva, la cual es caracterizada por distintos patrones. En el caso de muestras
negativas, el núcleo muestra fluorescencia no específica. En cada campo evaluado, las células en
interfase y mitóticas deben ser examinadas y en muchas áreas si es posible. Usted puede encontrar una
mirada general de los patrones de fluorescencia en el sitio web sobre anticuerpos antinucleares
www.anapatterns.org (ICAP).
Si el control positivo muestra un patrón de fluorescencia no especifico o el control negativo muestra un
patrón claro de fluorescencia, el resultado no debe ser usado y el test deberá ser repetido.
Un amplio rango de imágenes de fluorescencia pueden ser encontradas en el sitio web de EUROIMMUN
(www.euroimmun.com).

Evaluación cualitativa recomendada:

Reactividad ANA (IgG)
Sin reacción a 1:100
Reacción positiva a 1:100
Reacción positiva a 1:320
Evaluación
Negativo. No se detectan anticuerpos contra el núcleo en la muestra de
paciente
Indicio, Para los tipos de IF: patrones homogéneos, centrómeros, punteado
nuclear, Jo-1, patrones típicos de SS-A/SS-B, Sm/RNP posible indicación de
varias enfermedades reumáticas y otras
Positivo. Indicación de varias enfermedades reumáticas y otras

91
Evaluación semicuantitativa recomendada: El título es definido como el factor de dilución de la muestra
para el cual se puede identificar fluorescencia específica. Este debería ser comparado con la reacción
obtenida usando un suero diluido equivalente.

Los títulos de anticuerpos pueden ser determinados de acuerdo a la siguiente tabla de fluorescencia de
diferentes diluciones de muestras.

Fluorescencia a Título de
1:10 1:100 1:1000 1:10000 anticuerpos
Débil Negativo Negativo Negativo 1:10
Moderado Negativo Negativo Negativo 1:32
Fuerte Débil Negativo Negativo 1:100
Fuerte Moderado Negativo Negativo 1:320
Fuerte Fuerte Débil Negativo 1:1000
Fuerte Fuerte Moderado Negativo 1:3200
Fuerte Fuerte Fuerte Débil 1:10000
…

…
Algunos de los patrones más importantes de fluorescencia son el homogéneo y el granular nuclear,
también como la tinción de los nucléolos y los centrómeros (claramente identificables especialmente en
células mitóticas). El patrón de unión frecuentemente corresponde con los antígenos nucleares definidos
bioquímicamente:

Autoantígenos del núcleo celular Patrón de fluorescencia

DNA doble hebra Homogéneo
Polinucleótidos DNA hebra simple Homogéneo
RNA Parcialmente homogéneo
H1, H2A, H2B, H3, H4,
Histonas Homogéneo
complejo H2A-H2B
U1-nRNP Moteado grueso, nucléolo negativo
Ribonucleoproteínas del Sm Moteado grueso, nucléolo negativo
nucleoplasma (ENA) SS-A (Ro) Moteado
SS-B (La) Moteado
U3-nRNP/fibrilarina Nucléolo moteado
RNA Polimerasa I Nucléolo moteado
Antígenos del núcleo Pm-Scl (PM-1) Nucléolo homogéneo
7-2-RNP (To) Nucléolo homogéneo
4-6-S-RNA Nucléolo homogéneo
Centrómeros Proteínas del kinetocoro Moteado típico
Scl-70 Casi homogéneo, nucléolo marcado
Ciclina (PCNA) Moteado, 50% 10 veces más brillante
Punteado nuclear Punteado nuclear
NOR-90 Metafase con 1-2 gránulos
Otras proteínas
Ku Reticular
Mi-1 Moteado fino
Mi-2 Moteado fino
Laminas Membrana nuclear

92
Si cada muestra es investigada con una combinación de sustratos HEp-2 e hígado primate (N° de orden
FA 1510-1005-1) y comparado el patrón de fluorescencia permite a los anticuerpos antinucleares ser
mayormente diferenciados: Anticuerpos contra U1-mRNP, Sm, dsDNA, histonas y puntuado nuclear
reaccionan con células HEp-2 e hígado con la misma intensidad, mientras que anticuerpos contra SS-A,
SS-B, centrómeros y ciclina muestran una fluorescencia mucho más débil en tejido hepático. Anticuerpos
contra Ku solo muestran un fluorescencia granular en células HEp-2, mientras que una fluorescencia
gruesa granular, perinuclear puede ser vista en hígado primate, la cual puede ser claramente
diferenciada de otros patrones de fluorescencia. Solo con la combinación de las células HEp-2 e hígado
primate es posible determinar, entre otras cosas, si los anticuerpos contra los centrómeros y punteado
nuclear están presentes en la misma muestra.

Limitaciones del procedimiento

1. No se puede realizar un diagnóstico con un solo resultado. Los síntomas clínicos del paciente
deberían siempre ser tomados en cuenta junto con los resultados serológicos por el clínico.
2. La adaptación de este ensayo para el uso de procesadores automáticos de muestras y otros
servicios de manipulación de líquidos, en la mayoría o en parte, podría entregar diferencias en el
resultado del test a diferencia del procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio
validar que su procedimiento automatizado mantenga los resultados del test dentro de límites
aceptables.
3. El mal manejo de los portaobjetos durante el procedimiento de tinción, especialmente permitir el
secado entre los pasos, podría resultar en una apariencia de patrón “desteñido” y/o altos niveles de
tinción de ruido de fondo.
4. Las cubetas comúnmente usadas para lavado (Coplin) deberían ser libres de cualquier residuo. El
uso de estas cubetas conteniendo residuos podría causar tinción de artefactos.
5. La fuente de luz, filtros y unidad óptica del microscopio de fluorescencia puede influenciar en la
sensibilidad del ensayo. Usando el sistema de lámpara de vapor mercurio, la fiabilidad del
microscopio depende de la mantención correcta, especialmente la alineación de la lámpara y el
reemplazo de la lámpara después del periodo de tiempo recomendado. El microscopio de
fluorescencia con luz “LED Bluelight” como fuente de luz ofrece muchas ventajas. Contacte a
EUROIMMUN para mayores detalles.

Características del test

Antígeno: Para la determinación de anticuerpos antinucleares (ANA) por inmunofluorescencia indirecta,
las células epiteliales humanas (HEp-2) son preferidas hoy en día. Las células HEp-2 muestran un amplio
espectro de antígenos nucleares humanos, y la medición de los patrones de fluorescencia hacen la
diferenciación de un gran número de anticuerpos posibles. Usando hígado de primates como sustrato
adicional (N° de orden EUROIMMUN FA 1510-1010-1), el espectro de anticuerpos que pueden ser
diferenciados se extiende aún más.
Si la prueba de inmunofluorescencia es positiva, es posible realizar un siguiente monoensayo especifico
(ejemplo ensayos enzimáticos) para determinar contra cual antígeno nuclear son específicos los
anticuerpos.

93
Estabilidad: La estabilidad es garantizada por 18 meses después de la fecha de fabricación si se almacena
apropiadamente.

Rango de medición: el punto de inicio de dilución para este sistema de medición es 1:100. Las muestras
pueden ser diluidas por un factor de 10 así que la serie de dilución es 1:1000, 1:10000 etc. No existe un
rango superior para el rango de medición.

Reproducibilidad: La intensidad de la fluorescencia específica como valor numérico es llamado por

EUROIMMUN niveles de intensidad de fluorescencia. Este valor puede alcanzar desde “0” (fluorescencia
no especifica) a “5” (fluorescencia especifica extremadamente fuerte).

Reproducibilidad Inter-lote Intra-enayo Inter-ensayo

3 lotes x 3 muestras x 1 1 lote x 3 muestras x 1 1 lote x 3 muestras x 2
Requerimiento corrida x determinación corrida x determinación corridas x determinación
mínimo simple: max. ± 1 nivel de 1º veces: max. ± 1 nivel doble: max. ± 1 nivel de
intensidad de intensidad intensidad
Células HEp-2 Desviación máxima ± 1
Sin desviación Sin desviación
(humanas) nivel de intensidad

Reactividad cruzada: 11 muestras caracterizadas fueron incubadas las cuales no produjeron ningún
patrón de fluorescencia inespecífico (CDC 1 a CDC 11). El resultado no mostró reactividad cruzada con
esos sueros.

Interferencia: Muestras hemolíticas, lipémicas e ictéricas no muestran influencias en el análisis de

resultados.

Rango de referencia: Títulos 1:<100

Las siguientes prevalencias de anticuerpos fueron determinadas usando un panel de muestras de

donantes sanos (origen: Alemania):
Sustrato Anticuerpos Punto de Número de
Conjugado Prevalencia
contra corte muestras
Células HEp-2
ANA IgG 12,5% 1:100 N=200
(humanas)

Especificidad y sensibilidad:
Clase Referencia
Sustrato Especificidad Sensibilidad
de Ig (número y origen de muestras)
Células HEp-2 ELISA + blot
IgG 100% 100%
(humanas) (n=128, Alemania)

Significancia clínica

La detección de autoanticuerpos contra células nucleares (ANA) es un importante indicador diagnostico

en muchas enfermedades autoinmunes. Los anticuerpos contra antígenos nucleares están dirigidos
contra varios componentes nucleares (sustancias bioquímicas en el núcleo celular). Estos comprenden
ácidos nucleicos, proteínas del núcleo y ribonucleoproteínas. Estos son un hallazgo característicos en
94
muchas enfermedades, en partículas las enfermedades reumáticas. La frecuencia (prevalencia) de
anticuerpos antinucleares en enfermedades reumáticas inflamatorias es entre 20 y 100%, la más baja
ocurre en artritis reumatoide entre 20% y 40%. Por lo tanto, el diagnóstico diferencial de anticuerpos
contra antígenos nucleares es indispensable para la identificación de la enfermedad reumática individual
y su diferenciación de otras enfermedades autoinmunes.

Enfermedad autoinmune Prevalencia de ANA

Lupus eritematoso sistémico (LES) 80% - 100%
Lupus eritematosos inducido por drogas 100%
Enfermedad del tejido conectivo mixto (ETCM,
síndrome de Sharp) 100%
Artritis reumatoide 20% - 40%
Otra enfermedad reumática 20% - 50%
Esclerosis sistémica progresiva 85% - 95%
Polimiositis y dermatomiositis 30% - 50%
Síndrome de Sjögren 70% - 80%
Hepatitis crónica activa 30% - 40%
Colitis ulcerativa 26%

Lupus eritematoso sistémico

Para LES, la determinación de anticuerpos con DNA de doble hebra (dsDNA) es considerado uno de los
criterios más importante para el diagnóstico. Lo complejos inmunes de DNA de doble hebra y su
correspondiente autoanticuerpo causan daño tisular subcutáneo, renal y en otros órganos. El título de
anticuerpos se correlaciona con la actividad clínica de la enfermedad. Autoanticuerpos contra
nucleosomas ocurren independientemente de los anticuerpos anti dsDNA; 18% de los sueros de LES
reaccionan exclusivamente con nucleosomas y no con dsDNA. Los anticuerpos anti nucleosomas
generalmente indican un curso severo de LES. Estos ocurren con una prevalencia de 9% a 89% en casos
sin nefritis lúpica y una prevalencia de 18% a 86% en casos de nefritis lúpica. Además, los anticuerpos
anti Sm son considerados por ser patognomónicos para LES. Adicionalmente, anticuerpos contra otros
polinucleótidos, ribonucleótidos, histonas y otros antígenos nucleares pueden ser encontrados.

En casos de lupus eritematoso inducido por drogas con manifestaciones como artralgia, artritis,
exantema, serositis, mialgia, hepatomegalia y esplenomegalia, se observan anticuerpos contra histonas.
Esta forma reversible de LES puede ser inducida por antibióticos (ejemplo penicilina, estreptomicina,
tetraciclinas), agentes de quimioterapia (ejemplo procainamida, practolol), antihipertensivos (ejemplo
reserpina, hidralazina), terapia básica anti reumatoide (ejemplo oro, D-penicilimina) y otras drogas como
anticonceptivos y alopurinol.

Autoanticuerpos en lupus eritematosos sistémico

Antígeno Prevalencia
DNA de doble hebra 60% - 90%
DNA de hebra simple 70% - 95%
RNA 50%
RNA helicasa A 6%
Histonas 50% - 80%
Nucleosomas, dependientes de la gravedad del
95
 LES ya sea con o sin nefritis lúpica 9% - 89% o 18% - 86%
U1-nRNP 15% - 40%
Sm 5% - 40%
SS-A (Ro) 20% - 60%
SS-B (La) 10% - 20%
Ciclina (PCNA) 3%
Ku 10%
Proteínas P-Ribosomales 10%
HSP-90: Proteína del shock térmico 90 kDa 50%
Cardiolipinas 40% - 60%

Síndrome de Sharp

Títulos altos de autoanticuerpos contra U1-nRNP son característicos del síndrome de Sharp (enfermedad
del tejido conectivo mixto, ETCM). El título de anticuerpos se correlaciona con la actividad clínica de la
enfermedad.

Autoanticuerpos en el síndrome de Sharp

Antígeno Prevalencia
U1-nRNP 95% - 100%
DNA de hebra simple 20% - 50%

Artritis reumatoide

En el caso de la artritis reumatoide, se pueden observar anticuerpos contra histonas en más de la mitad
de todos los casos, mientras que anticuerpos contra U1-nRNP son raramente encontrados. Los
anticuerpos contra RANA (antígeno nuclear de artritis reumatoide) no pueden ser hallados en células
HEp-2.

Anticuerpos contra el núcleo en artritis reumatoide

Antígeno Prevalencia
Histonas 15% - 50%
DNA de hebra simple 8%
U1-nRNP 3%
RANA 90% - 95%

Esclerosis sistémica progresiva

La esclerosis sistémica progresiva (ESP; escleroderma) se puede manifestar de dos formas, e la cuales no
siempre puede ser claramente diferenciada. Hasta ahora, los anticuerpos contra fibrilarina, RN
polimerasa I y Scl-70 solo se han evidenciado en la forma difusa. Los autoanticuerpos contra los
centrómeros son asociados con la forma limitada de la ESP.

Autoanticuerpos en esclerosis sistémica progresiva (forma difusa)

Antígeno Prevalencia
Fibrilarina 5% - 10%
PM-Scl (PM-1), incluyendo síndrome de solapamiento 50% - 70%
96
 Scl-70 25% - 75%
RNA polimerasa I 4%
7-2-RNP (To) Raro
NOR-90 (región organizadora del núcleo) Raro

Autoanticuerpos en esclerosis sistémica progresiva (forma limitada)

Antígeno Prevalencia
Centrómeros 80% - 95%

Polimiositis/dermatomiositis

Los autoanticuerpos contra PM-Scl ocurren en polimiositis y dermatomiositis, pero otros anticuerpos
nucleares (contra Mi-1, Mi-2, Ku) y anticuerpos contra Jo-1 también pueden ser identificados en estas
enfermedades.

Autoanticuerpos en polimiositis y dermatomiositis

Antígeno Prevalencia
PM-Scl (PM-1) incluyendo el síndrome de solapamiento 50% - 70%
Jo-1 25% - 35%
Mi-1 10%
Mi-2 5%
Ku 50%
DNA de hebra simple 40% - 50%
PL-7 (Treonil-tRNA sintetasa) 4%
PL-12 (Alanil-tRNA sintetasa) 3%

Síndrome de Sjögren

En el síndrome de Sjögren (síndrome primario), están presente anticuerpos contra SS-A y SS-B,
principalmente en combinación con otro más. Además, los autoanticuerpos contra los ductos secretorios
de las glándulas salivales se encuentran en 40 a 60% de todos los casos.

Autoanticuerpos en síndrome de Sjögren primario

Antígeno Prevalencia
SS-A (Ro) 40% - 95%
SS-B (La) 40% - 95%
DNA de hebra simple 13&
RANA 70%
Ductos excretores de glándulas salivales 40% - 60%
Factor reumatoide 60% - 80%

Autoanticuerpos contra antígenos nucleares ocurren muchas otras enfermedades, como cirrosis biliar
hepática (punteado nuclear, SS-A) y hepatitis autoinmune crónica activa (SS-A, laminas). A veces, los
anticuerpos contra antígenos nucleares son detectados en individuos sugerentemente sanos,
usualmente en títulos bajos (varias clases de inmunoglobulinas, principalmente IgM).

97
 Anticuerpos contra el núcleo celular:
Enfermedades importantes asociadas
Antígeno Enfermedad Prevalencia
DNA de hebra doble Lupus eritematoso sistémico 60% - 90%
DNA de hebra simple Lupus eritematoso sistémico 70% - 95%
Lupus eritematoso inducido por drogas 60%
Enfermedad del tejido conectivo mixto 20% - 50%
Polimiositis/dermatomiositis 40% - 50%
Escleroderma, Sd de Sjögren, Artritis Reuma. 8% - 14%
RNA Lupus eritematoso sistémico 50%
Escleroderma, Sd Sjögren 65%
Histonas Lupus eritematoso inducido por drogas 95%
Lupus eritematoso sistémico 58% - 80%
Artritis reumatoide 15% - 50%
U1-nRNP Enfermedad del tejido conectivo mixto 95% - 100%
Lupus eritematosos sistémico 15%- 40%
Artritis reumatoide 3%
Sm Lupus eritematoso sistémico 5% - 40%
Nucleosomas Lupus eritematoso sistémico
Sin nefritis lúpica 9% - 89%
Con nefritis lúpica 18% - 86%
SS-A (Ro) Sd de Sjögren 40% - 95%
Lupus eritematoso sistémico 20% - 60%
Síndrome de lupus neonatal 100%
SS-B (La) Sd de Sjögren 40% - 95%
Lupus eritematoso sistémico 10% - 20%
Fibrilarina Esclerosis sistémica progresiva (forma difusa) 5% - 10%
RNA polimerasa I Esclerosis sistémica progresiva (forma difusa) 4%
PM-Scl (PM-1) Polimiositis/dermatomiositis/Sd de solapamiento 50% - 70%
Esclerosis sistémica progresiva (forma difusa) 5% - 10%
Centrómeros Esclerosis sistémica progresiva (forma limitada) 80% - 95%
Scl-70 Esclerosis sistémica progresiva (forma difusa) 25% - 75%
Ciclina (PCNA) Lupus eritematoso sistémico 3%
Ku Lupus eritematoso sistémico 10%
Poli-/dermatomiositis, esclerosis sistémica progresiva 30% - 55%
Mi-1, Mi-2 Dermatomiositis 5% - 10%

Los anticuerpos contra componentes del citoplasma de las células HEp-2 no siempre pueden ser
claramente diferenciados. Solo unos pocos anticuerpos reactivos contra el citoplasma se pueden asignar
a una enfermedad en particular, ejemplo anticuerpos contra las mitocondrias en cirrosis hepática biliar
primaria y contra Jo-1, PL-7 y PL12 en polimiositis y dermatomiositis. Anticuerpos raros adicionales
encontrados en polimiositis son esos dirigidos contra OJ, EJ y señal de reconocimiento de partículas
(SRP). Otros anticuerpos citoplasmáticos - contra el aparato de Golgi, lisosomas, y algunos componentes
del citoesqueleto, como vimentina y citokeratinas – son de menor significancia clínica. El valor
diagnóstico de los antígenos asociados a mitosis no has sido aún clarificados.

98
Todos estos argumentos muestran la alta relevancia inmunológica y el valor diagnóstico del resultado de
los autoanticuerpos contra el núcleo celular.

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FIN DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “IIFT: HEP-20-10"

100
ALGORITOMO DE CLASIFICACIÓN DE PATRONES ANA

El Instituto de salud publíca (ISP) de Chile, generó una guía de recomendaciones para la determinación y
clasificación de los anticuerpos antinucleares por medio de inmunofluorescencia indirecta. La guía del
ISP utiliza los conceptos de “mitosis positiva” y “mitosis negativa” en sus tablas de clasificación. El
problema ocurre con las personas que no tienen entrenamiento en ANA por IFI, ya que el concepto
podría direccionar la busqueda de celulas que estan en mitosis o no lo están, dentro del sustrato celular.
El uso popular de celulas HEp-2 para ANA se debe a que estas pueden evidenciar mofologicamente
distintos etapas de la mitosis, por lo que una persona inexperta, podría interpretar a todas las placas
como “mitosis positiva” en caso de que estuviese positiva para ANA. La “mitosis positiva” hace
referencia a muestras positivas para ANA, las cuales su patron de positividad también tiñe el nucleo de
células en etapa de metafase (placa de metafase), anafase y/o telofase. La “mitosis negativa” se refiere a
muestras positivas para ANA, las cuales su patron de positividad no tiñe a elementos nucleares de
celulas en metafase, anafase y/o telofase, sin embargo se puede marcar en etapas de interfase o bien
teñir elementos del citoplasma. Estos conceptos aplican para los patrones nucleares y nucleolares, no asi
para los citoplasmático o aparato mitótico.

Represantación de ciclo celular aplicado a celulas HEp-2 para tinción de anticuerpos antinucleares. Se obseva en celulas en
etapas mitoticas que su núcleo se puede marcar (mitosis positiva) o no se puede marcar (mitosis negativa) en muestras
positivas para ANA.

Para la recomendación de la nomenclatura del ICAP para ANA, el concepto de mitosis se reemplaza por
“placa metafasica cromosómica”, pero de todos modos ambos se refieren a lo mismo.

101
102
PATRÓN HOMOGÉNEO (AC-1)
Antígenos asociados: dsDNA, nucleosomas, histonas
Fluorescencia homogénea y regular a través de todo el nucleoplasma, los nucléolos pueden o no
fluorecer dependiendo del sustrato celular. Las células en mitosis (metáfase, anáfase y telófase) tienen la
cromatina intensamente fluorescente de manera homogénea.

PATRÓN GRANULAR FINO DENSO (AC-2)

Nombre anterior: nuclear fino denso
Antígenos asociados: DFS70/LEDGF
Patrón granular distribuido por todo el núcleo de las células en interfase, con heterogeneidad en
tamaño, brillo y distribución de los gránulos. A lo largo del núcleo en interfase, hay algunas zonas más
densas y más débiles de los gránulos (rasgo muy característico). La placa metafásica muestra un fuerte
patrón granular destacándose algunas manchas gruesas.

PATRÓN CENTRÓMERO (AC-3)

Antígenos asociados: CENP-A/B (C)
Granular grueso discreto (40-80/célula) dispersos en los núcleos de las células en interfase y alineados en
la masa de la cromatina en las células mitóticas. Por ejemplo anti-CENP-B.

PATRÓN GRANULAR FINO (AC-4)

Nombre anterior: Nuclear fino
Antígenos asociados: SS-A/Ro, SS-B/La, Mi-2, Ku
Gránulos diminutos finos a través de todo el nucleoplasma. El nucléolo puede teñirse o no. Las células
mitóticas (metafase, anafase y telofase) tienen la masa de la cromatina no teñida. Por ejemplo anti-SS-
A/Ro, anti-SS-B/La.

PATRÓN GRANULAR GRUESO (AC-5)

Nombre anterior: Nuclear grueso
Antígenos asociados: hnRNP, U1RNP, Sm, RNA polimerasa III
Gránulos gruesos a través de todo el nucleoplasma. El nucléolo puede teñirse o no. Las células mitóticas
(metafase, anafase y telofase) tienen la masa de la cromatina no teñida. por ejemplo anti-Sm, anti-U1
RNP

PATRÓN GRANULOS NUCLEARES MULTIPLES (AC-6)

Nombre anterior: Punteado nuclear múltiple
Antígenos asociados: Sp-100, Proteínas PML, MJ/NXP-2
Gránulos nucleares discretos contables (6 a 20 Puntos/célula). Por ejemplo, SP-100

PATRÓN GRÁNULOS NUCLEARES ESCASOS (AC-7)

Nombre anterior: Punteado nuclear escaso
Antígenos asociados: p80-coilin, SMN
Gránulos discretos contables (1 a 6 gránulos nucleares/célula. Estas son conocidas como cuerpos de
Cajal o cuerpos enrollados. Por ej. anti-p80-coilina

PATRÓN MEMBRANA NUCLEAR LISA (AC-11)

Antígenos asociados: lamina A, B, C, o proteínas asociadas con lámina
103
Tinción homogénea del núcleo con mayor intensidad en la membrana nuclear externa, sin tinción en las
placas de cromatina de la metafase y anafase. Se puede observar un peculiar aumento de fluorescencia
en los puntos de contacto entre células adyacentes. Ej. anti-lámina B

PATRÓN MEMBRANA NUCLEAR GRANULAR (AC-12)

Nombre anterior: Membrana nuclear porosa
Antígenos asociados: Complejo de proteínas de los poros nucleares. Ej. gp210
La membrana nuclear revela tinción punteada en células interfásicas, con peculiar aumento de
fluorescencia en los puntos de contacto entre células adyacentes. No hay tinción en las placas de
cromatina de la metafase y anafase. Ej. anti-gp210.

PATRÓN PARECIDO A PCNA (AC-13)

Nombre anterior: Plemórfico
Antígenos asociados: Antígeno nuclear de células proliferativas (PCNA).
Tinción nucleoplásmica granular pleomórfica, con variabilidad en el tamaño y brillo de los gránulos.
Durante la interfase, algunas células son negativas (fase G1), algunas están intensamente teñidas (fase
S), y otras presentan gránulos dispersos con ocasional tinción nucleolar (fases S tardía y temprana G2).
Las células mitóticas no muestran tinción.

PATRON PARECIDO A CENP-F (AC-14)

Antígenos asociados: Proteína del centrómero F (CENP-F)
Patrón nuclear granular con sorprendente variabilidad en intensidad. La tinción nuclear es negativa o
débil en la fase G1, pero intensa en la fase G2. Los centrómeros muestran tinción positiva solamente en
la profase y la metafase, revelando múltiples puntos alineados en la placa metafásica. Células en profase
frecuentemente revelan una tinción débil de la membrana nuclear, mientras que el citoplasma de células
mitóticas revela una tinción difusa débil. Durante la anafase y la telofase se puede observar una tinción
intensa en el anillo del plano medio que divide las dos células hijas.

104
PATRÓN NUCLEOLAR HOMOGENEO (AC-8)
Antígenos asociados: PM/Scl-75, PM/Scl-100, Th/To, B23/nucleofosmina, nucleolina, No55/SC65
Fluorescencia difusa en todo el nucléolo, mientras que la placa metafásica no muestra tinción. Ej. Anti-
PM-Scl-, anti Th/To

PATRÓN NUCLEOLAR GRUMOSO (AC-9)

Nombre anterior: Nucleolar moteado
Antígenos asociados: U3snoRNP/fibrilarina
Tinción irregular del nucléolo y cuerpos de Cajal, con tinción peri-cromosomal en las placas metafásicas.
Ej. anti-fibrilarina.

PATRÓN NUCLEOLAR GRANULAR (AC-10)

Nombre anterior: Nucleolar aglomerado
Antígenos asociados: ARN polimerasa I, hUBF/NOR-90
Gránulos distinguibles densamente distribuidos en los nucléolos de las células interfásicas. Se puede
observar en la cromatina de las células metafásicas hasta 5 pares brillantes de regiones organizadoras
del nucléolo (NOR, por sus siglas en inglés). El citoplasma de las células mitóticas usualmente revela una
leve tinción positiva. Ej. anti-NOR-90, anti-ARN polimerasa I

105
106
PATRÓN CITOPLASMÁTICO FIBRILAR LINEAL (AC-15)
Antígenos asociados: Actina, miosina no muscular
Este patrón se caracteriza por mostrar fibras del citoesqueleto, en ocasiones con depósitos granulares
pequeños y discontinuos. La tinción típica muestra fibras de actina estriadas que abarcan lo largo del eje
de la célula. Ej. anti actina, anti miosina no muscular.

PATRÓN CITOPMASMATICO FIBRILAR FILAMENTAR (AC-16)

Antígenos asociados: Vimentina, citoqueratina, tropomiosina
Tinción de microtubulos y filamentos intermedios que se extienden desde la membrana nuclear. Ej. anti
citoqueratina, anti vimentina, anti- tropomiosina.

PATRÓN CITOPLASMÁTICO FIBRILAR SEGMENTADO (AC-17)

Nombre anterior: Fibrilar segmental
Antígenos asociados: Actina alfa, vinculina
Predomina la tinción de pequeños segmentos, cuerpos densos periódicos a lo largo de las fibras de
estrés. Ej. Anti-Alfa Actina, anti- vinculina.

PATRÓN CITOPLASMÁTICO GRANULAR DISCRETO (AC-18)

Nombre anterior: Granular punteado
Antígenos asociados: GW182, Su/Ago2. *no hay evidencia molecular para sustentar que este patrón,
esté asociado a objetivos lisosomales.
Tinción de los cuerpos GW en el citoplasma de las células en interfase con un número alto en la fase final
del ciclo celular S/G2. Ej anti-GW182, anti-Su/Ago2

PATRÓN CITPLASMATICO GRANULAR FINO DENSO (AC-19)

Antígenos asociados: PL-7, PL-12, Proteína P ribosomal.
El patrón aparece nebuloso, casi homogéneo en todo el citoplasma. Ej anti-PL-7

PATRÓN CITOPLASMATICO GRANULAR FINO (AC-20)

Antígenos asociados: Jo-1/ sintetasa del Histidil del ARNt.
Pequeños gránulos dispersos en el citoplasma, en su mayoría con fondo homogéneo o granular fino
denso. Ej Anti-Jo-1

PATRÓN CITOPLASMATICO RETICULAR / ANTICUERPO ANTI-MITOCONDRIALES (AC-21)

Nombre anterior: granular reticulado
Antígenos asociados: PDC-E2/M2, BCOADC-E2, OGDC-E2, subunidad E1? de PDC, E3BP/proteína X
Tinción de filamentos granulares gruesos que se extienden a través del citoplasma. Ej. anticuerpos anti-
mitocondriales.

PATRÓN CITOPLASMATICO GRANULAR POLAR (AC-22)

Antígenos asociados: Giantina/macrogolgina, golgin-95/GM130, Golgina-160, golgina-97, golgina 245.
Granular discontinuo o tinción como listón granular perinuclear con distribución polar en el citoplasma.
Ej. anti-giantina, anti-golgina-245.

PATRÓN CITOPLASMATICO BASTONES Y ANILLOS (AC-23)

Antígenos asociados: IMPDH2
107
Corpúsculos con formas de anillos, comas o bastoncillos en el citoplasma de células en interfase. Visibles
también en el núcleo en algunos casos.

PATRÓN CENTROSOMA (AC-24)

Nombre anterior: centriolos
Antígenos asociados: Pericentrina, nineína, Cep250, Cep110
Centriolos, visibles como pequeños puntos nítidos (1-2/célula) en citoplasma o en los polos del huso
mitótico.

PATRÓN HUSO MITOTICO (AC-25)

Antígenos asociados: HsEg5
Tinción en las fibras del huso entre los polos en células en mitosis, junto con una tinción con forma de
pequeños conos en los polos. Las fibras del huso pueden teñirse tanto en patrones parecidos a NuMA
como en algunos no-NuMA. Los patrones parecidos a NuMA conllevan tinciones moteadas en el núcleo.
En este apartado solo se incluyen patrones no-NuMA, los patrones NuMA-like se incluyen en el grupo
parecidos a NuMA.

PATRÓN PARECIDO NuMA2 (AC-26)

Antígenos asociados: NuMA
Tinción granular nuclear con tinción de fibras del huso mitótico.

108
PATRÓN PUENTE INTERCELULAR (AC-27)
Antígeno asociados: Ninguno
Tinción del puente que une las dos células hijas al final de la división celular, pero antes de que las
células se separen totalmente.

PATRÓN ENVOLTURA CENTROSÓMICA MITÓTICA (AC-28)

Antígenos asociados: Histona H3 modificada, MCA-1
Tinción punteada en el borde de los cromosomas de células en profase y metafase, sin ninguna tinción
en células en interfase.

109
INFORME DE RESULTADOS RECOMENDADOS POR ISP PARA ANA

De acuerdo a las recomendaciones del ISP, la prueba de ANA se debería nombrar como anticuerpos anti-
núcleo-citoplasma, sin embargo, para muchos clínicos el concepto de ANA esta muy arraigado por lo que
recomienda especificarlo entre paréntesis en los informes de resultados. Bajo esta misma nomenclatura
es que recomienda también informar por separado el patrón nuclear del citoplasmáticos, pero a veces
ambos pueden coexistir.

Para el informe de resultados recomienda seguir la nomenclatura del ICAP por lo menos a nivel de
“competente” (Ver figuras anteriores). También se recomienda que además de nombrar el patrono, se
coloque entre paréntesis la clasificación AC de ICAP, por ejemplo, si es un patrón nuclear homogéneo se
debería colocar también “(AC-1)”.

INFORME DE RESULTADOS

EXAMEN: Anticuerpos antinucleares (anti-nucleo-citoplasmatico)

Método: Inmunofluorescencia indirecta; Sustrato: Células HEp-2
Dilución inicial de trabajo: 1:80
Resultado Valor de referencia
Anti-nuclear : Negativo
Patrón :
Título :

Anti-citoplasmático : Negativo
Patrón :
Título :

Observaciones:
Nomenclatura AC de patrones ANA basada en el consenso internacional ICAP
Ver www.anapatterns.org

110
Ejemplo 1: Nivel competente (nivel mínimo recomendado por ICAP e ISP.
INFORME DE RESULTADOS
EXAMEN: Anticuerpos antinucleares (anti-nucleo-citoplasmatico)
Método: Inmunofluorescencia indirecta; Sustrato: Células HEp-2
Dilución inicial de trabajo: 1:80
Resultado Valor de referencia
Anti-nuclear : Positivo Negativo
Patrón : Granulares (AC-4,5)
Título : 1:640

Anti-citoplasmático : Negativo Negativo

Patrón :
Título :
Observaciones:
Nomenclatura AC de patrones ANA basada en el consenso internacional ICAP
Ver www.anapatterns.org

Ejemplo 2: Nivel especialista (nivel opcional recomendado por ICAP e ISP).

INFORME DE RESULTADOS
EXAMEN: Anticuerpos antinucleares (anti-nucleo-citoplasmático)
Método: Inmunofluorescencia indirecta; Sustrato: Células HEp-2
Dilución inicial de trabajo: 1:80
Resultado Valor de referencia
Anti-nuclear : Positivo Negativo
Patrón : Centrómero (AC-3)
Título : 1:1280

Anti-citoplasmático : Positivo Negativo

Patrón : Granular fino denso (AC-19)
Título : 1:320
Observaciones:
Nomenclatura AC de patrones ANA basada en el consenso internacional ICAP
Ver www.anapatterns.org

111
Tabla. Patrones de inmunofluorescencia indirecta en ANA y patologías asociadas

Referencias:
1. Instituto de salud pública de Chile. Recomendaciones para la determinación de anticuerpos
antinucleares. 2018.
2. Dellavance A, Gabriel Jr A, Cintra A, et al. II Consenso Brasileiro de Fator Antinuclear em Células HEp-2
(2003). Rev Bras Reumatol, 43(3): 129-140.
3. International Consensus on Antinuclear Antibody (ANA) Patterns (ICAP). www.anapatterns.org

112
 DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS NUCLEARES EXTRAÍBLES

ANTIGENOS NUCLEARES EXTRAÍBLES

Los antígenos nucleares extraíbles (ENA) son un grupo sobre 100 antígenos derivados de proteínas
ribonucleo-histonas y no histonas que pueden ser extraídos de fracciones celulares en solución salina.
Son importantes porque abarca una proporción significativa de los antígenos observados en anticuerpos
antinucleares (ANA) en enfermedades reumáticas; La presencia de ANA enfocada en ENA es más
importante para destacar la significancia clínica de una enfermedad autoinmune a diferencia de
enfermedades autoinmunes para las cuales no se encuentra especificidad antigénica. Los anticuerpos
contra algunos de esos antígenos son altamente específicos para condiciones particulares (ejemplo, Scl-
70 y esclerosis sistémica) o asociadas fenotipos clínicos particulares dentro de un grupo de
enfermedades (ejemplo, autoanticuerpos específicos para miositis), mientras que otros podrían ser
encontrados en un rango amplio de enfermedades. Al igual que otras pruebas, su relevancia es
determinada por el contexto clínicos en el cual pueden ocurrir. La nomenclatura de los ENAs es confusa
porque no se usó una escala estandarizada para nombrarlos. Algunos son nombrados de acuerdo a su
función (ejemplo RNP), otros de acuerdo al nombre del paciente de cual fueron descritos (ejemplo Sm,
Ro, La) y más aún otros fueron nombrados de acuerdo a la enfermedad en la cual son comúnmente
encontrados (ejemplo Scl-70).

Los anticuerpos anti-ENA pueden ser detectado en ensayos de precipitación en gel como la
inmunodifusión doble; contra inmunoelectroforesis, métodos de fase sólida como ELISA; técnicas en
base a Westernblot como el inmunoblot; y por ensayos multiplex; cada ensayo tiene su ventajas y
desventajas. Aunque la concordancia entre muchos de ellos es satisfactoria, existen diferencias en su
sensibilidad y especificidad para detectar antígenos particulares. Las razones de esto incluyen las
diferencias en la fuente de los antígenos usados en el ensayo y la perdida de determinantes
conformacionales de algunos antígenos durante su preparación o en la ejecución del ensayo. Como no
hay un método en particular que pueda garantizar la detección de todos los anticuerpos relevante anti
ENAs, las recomendaciones actuales sugieren que se debe usar dos métodos. Cualquiera que sea el
enfoque adoptado, es esencial para el clínico estar consciente de las fortalezas y debilidades del método
usado localmente y en particular, hacer seguimiento en el laboratorio si existen discrepancias entre el
cuadro clínico y el resultado de los anticuerpos anti-ENA.

Referencias:
1. Akikusa J, Choo S. Textbook of Pediatric Rheumatology, Seventh Edition (2016): 117-128.
2. Dorresteyn Stevens C, Miller LE. Clinical Inmmunology ans Serology: A laboratory Perspective (2017).
fourth edition. F.A. Davis company, Philadelphia, PA, United States.

113
RELACIÓN ENTRE LOS PATRONES DE ANA Y LOS AUTOANTICUERPOS ENA

De acuerdo a lo explicado, una muestra ANA positiva debe continuar con estudios posteriores para
determinar la especificidad de los autoanticuerpos. La tabla a continuación muestra los posibles
antígenos observados en algunas patologías autoinmunes de acuerdo al patrón ANA observado:

114
Tabla. Listado de antígenos nucleares extraíbles que forman ANA y sus asociaciones con enfermedades
Antígeno Comentarios sobre anticuerpos afines
nuclear
extraíble
Sm (Smith) • Alta especificidad para lupus eritematosos sistémico (LES).
• Presente en aproximadamente 30% de los casos de LES pediátrico baja
sensibilidad).
• Asociado con el desarrollo de nefritis menos severa y con enfermedad del
SNC y serositis en LES.
• Antígenos blancos encontrados en componentes proteicos particulados de
U1-, U2-, U4-, U5-ribonucleoproteinas pequeñas (snRNP); proteínas
adicionales en el U1-snRNP son reconocidos por los anticuerpos anti-RNP,
por lo tanto existe una frecuente co-aparición de anticuerpos anti-Sm y anti-
U1RNP en LES.
Ro (SSA) • Es común en el síndrome de SJögren y lupus cutáneo subagudo.
• También es encontrado en otras enfermedades (ejemplo LES, esclerosis
sistémica y polimiositis y/o dermatomiositis).
• Implicado en la patogénesis del lupus eritematoso neonatal.
• Se conocen 2 subtipos por su peso molecular y con distribución celular
diferente – Ro52 (citoplasmática) y Ro60 (nuclear/nucléolo); los anticuerpos
no necesario reconocen a ambos.
• Ro52 es más común en esclerosis sistémica y miositis.
• Ro60se co-localiza temporalmente con La/SSB en algunas moléculas
citoplasmáticas de RNA (hy-RNA), por lo tanto es frecuente la aparición en
conjunto de anticuerpos anti-Ro y anti-LA.
• Podría aparecer en ausencia de anticuerpos anti-La
• Podría no ser detectado en líneas celulares HEp-2 de IFI.
La (SSB) • Es menos común que anticuerpos anti-Ro y raramente puede ser encontrado
en su ausencia.
• Observados en LES y síndrome Sjögren
U1 RNP • Es característica de la enfermedad del tejido conectivo mixto (ETCM)
• Observado también en otras enfermedades (ejemplo LES y esclerosis
sistémica).
Jo-1 (Hisyidil • Asociado con polimiosistis, típicamente con fibrosis pulmonar intersticial y
tRNA sintasa) manos de mecánicos hiperkeratosas.
• Su presencia podría predecir respuesta pobre al tratamiento.
• Pueden ser encontrada en dermatomositis, LES y ETCM.
Scl-70 • Altamente específico para esclerosis sistémica si se detecta usando
(Topoisomerasa- inmunoblot, inmunodifusión o inmunoprecipitación, pero solo sensibilidad
1) moderada.
• Asociado con el desarrollo de fibrosis pulmonar
• Ocasionalmente encontrado en otras enfermedades (LES), especialmente si
se detecta por ELISA.
PM-Scl • Asociado con el síndrome de superposición de polimiosistis-escleroderma.

115
KIT: ANTI-ENA PROFILEPLUS 1 EUROLINE - EUROIMMUN
INICIO DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “ANTI-ENA PROFILEPLUS 1 EUROLINE"
ANTI-ENA PROFILEPLUS 1 EUROLINE

Indicación: Síndrome de Sharp (ETCM), Lupus eritematosos sistémico (diseminado), Síndrome de

SJögren, esclerosis sistémica progresía, poli/dermatomiositis

Principio del test: El kit EUROLINE provee un ensayo in vitro cualitativo para autoanticuerpos humanos
de clase IgG para 6 diferentes antígenos: nRNP/Sm, Sm, SS-A (SS-A nativo y Ro-52), SS-B, Scl-70 y Jo-1
en suero o plasma. La prueba contiene tiras de prueba cubiertas con líneas paralelas de antígenos
altamente purificados. En el primer paso de reacción, la muestra diluida del paciente es incubada con las
tiras de inmunoblot. En el caso de muestras positiva, los anticuerpos específicos IgG (también IgA e IgM)
se unirán al sitio antigénico correspondiente. Para detectar la unión, se desarrolla una segunda
incubación usando anti-IgG humana marcada con una enzima (conjugado enzimático) catalizando una
reacción colorimétrica.

Contenidos del kit

Componente Formato Formato Símbolo
Tiras del test recubiertas de antígenos:
nRNP/Sm, Sm, SS-A (SSA nativo, Ro-52), SS-B, 16 tiras 4 x 16 tiras [STRIPS]
Scl-70, Jo-1.
Control positivo
1 x 0,02 ml 4 x 0,02 ml [POS CONTROL 100X]
(IgG, humano), concentrado 100X
Conjugado enzimático
Anticuerpo anti IgG humana conjugada a 1 x 3 ml 4 x 3 ml [CONJUGATE 10X]
fosfatasa alcalina (cabra), concentrado 10X
Buffer de muestra
1 x 100 ml 3 x 100 ml [SAMPLE BUFFER]
Listo para usar
Buffer de lavado
1 x 50 ml 1 x 100 ml [WASH BFFER 10x]
Concentrado 10X
Solución de substrato
Nitro blue tetrazolium chloride / 5-Bromo-4-
1 x 30 ml 4 x 30 ml [SUBSTRATE]
chloro-3-indolylphosphate (NBT/BCIP), listo
para usar
Bandeja de incubación 2 x 8 canales ---
Instrucciones del test 1 folleto 1 folleto
Descripción del lote Temperatura de almacenamiento
Diagnostico in vitro dispositivo medico Sin abrir usable hasta

Almacenamiento y estabilidad: El kit debe ser almacenado a una temperatura entre 2 a 8 °C, no
congelar. Todos los componentes del kit sin abrir son estables hasta la fecha de expiración.
Eliminación de desechos: Las muestras de pacientes, controles y las tiras de test incubadas deberían ser
manipuladas como desecho infeccioso. Otros reactivos no necesitan ser colectados separadamente, a
menos que se indique lo contrario en las regulaciones oficiales.

116
Los siguientes componentes no están provisto e el kit pero pueden ser ordenados a EUROIMMUN baje el
respectivo número de orden.
La ejecución del test requiere de una bandeja de incubación:
ZD 9899-0130 bandeja de incubación con 30 canales
ZD 9898-0130 bandeja de incubación con 30 canales (negro, para sistema EUROBlotCamera)
ZD 9898-0148 bandeja de incubación con 48 canales (negro, para sistema EUROBlotCamera)
Para la creación de protocolos de trabajo y la evaluación de las tiras incubadas usando papel verde y
papel adhesivo trasparente plástico de EUROLineScan son requeridos:
ZD 9880-0101 Papel verde (1 hoja)
ZD 9885-0116 Lámina adhesiva par aproximadamente 16 tiras de ensayo
ZD 9885-0130 Lámina adhesiva par aproximadamente 30 tiras de ensayo
Si desea realizar una evaluación visual, puede ordenar el protocolo de evaluación bajo:
ZD 1590.-0101-1 G Evaluación visual protocolo ENA ProfilePlus 1 EUROLINE

Preparación y estabilidad de los reactivos

Nota: Todos los reactivos deben ser llevados a temperatura ambiente (18 – 25 °C) aproximadamente 30
minutos antes de su uso. Sin abrir, los reactivos son estables hasta la fecha de expiración indicada
cuando se almacenan a 2 – 8 °C. Después de la apertura inicial, los reactivos son estables por 12 meses o
hasta la fecha de expiración, en caso de que sea menor, a menos que se indique lo contrario en las
instrucciones. Los reactivos abiertos deben ser almacenados a 2 – 8 °C y protegidos de la contaminación.

- Tiras de test recubiertas: Listas para su uso. Abrir el envase con las tiras de test solo cuando las tiras
han alcanzado la temperatura ambiente para prevenir la condensación de estas. Después de remover
una tira el envase debería ser sellado fuertemente y almacenado de 2 – 8 °C.

- Control positivo: El control está concentrado a 100X. Para la preparación del control listo para usar la
cantidad requerida debería ser removida de la botella usando una pipeta limpia y diluido 1:101 con
buffer de muestra. Ejemplo: agregar 15 µl del control a 1,5 ml de buffer de muestra y mezclar
vigorosamente. El control diluido listo para usar debería ser usado en el mismo día de trabajo.

- Conjugado enzimático: El conjugado enzimático es suministrado como un concentrado 10X. Para la

preparación del conjugad enzimático listo para usar la cantidad requerida debería ser extraída de la
botella usando una pipeta limpia y diluida 1:10 con buffer de muestra. Para una tira de test, diluir 0,15
ml de conjugado enzimático con 1,35 ml de buffer de muestra. El conjugado enzimático diluido debería
ser usado en el mismo día de trabajo.

- Buffer de muestra: Listo para usar.

- Buffer de lavado: El buffer de lavado es suministrado como un concentrado 10x. Para la preparación de
buffer de lavado listo para usar la cantidad requerida debería ser removida de la botella usando una
pipeta limpia y diluir 1:10 con agua destilada. Para un tira de test, diluir 1 ml en 9 ml de agua destilada. El
buffer de lavado listo para usar debería ser usado en el mismo día de trabajo.

117
- Solución de sustrato: Listo para usar. Cerrar la botella inmediatamente después del uso, debido a que
el contenido es sensible a la luz.

Advertencia: Los controles usados han sido negativas para HBsAg y anticuerpos contra HCV, HIV-1 y HIV-
2 usando métodos de inmunoensayos enzimáticos o inmunofluorescencia indirecta. Sin embargo todos
los materiales deberían ser tratados como material de riesgo biológico y deberían ser manipulados con
cuidado. Algunos reactivos son venenosos (buffer, solución de sustrato). Evitar contacto con la piel.

Preparación y estabilidad de las muestras de pacientes

Muestra: Suero humano o plasma con EDTA, heparina o citrato.

Estabilidad: Las muestras de pacientes a ser investigadas pueden ser generalmente almacenadas a 2 - 8
°C hasta 14 días. Muestras diluidas deberían ser incubadas dentro de un día de trabajo.

Dilución de la muestra: Las muestras de pacientes para el análisis son diluidas 1:101 con el buffer de
muestra. Por ejemplo agregue 15 µl de suero a 1,5 ml de buffer de muestra y mezclar bien con vortex.
Pipetas de muestras no son adecuadas para mezclar.

Incubación

Pre tratamiento: Remover la cantidad requerida de tiras de test desde el envase y colocar cada
uno en un canal vacío. El número de las tiras de test debería ser visible. Llenar los
canales de la bandeja de incubación de acuerdo al número de muestras de suero
que serán analizadas con 1,5 ml de buffer de muestra para cada canal. Incubar
por 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador. Al terminar, aspirar todo
el líquido.

Incubar: Llenar cada canal con 1,5 ml de muestras de suero diluidas e incubar a
(1er paso) temperatura ambiente (18 a 25 °C) por 30 minutos en un agitador.

Lavar Aspirar todo el líquido de cada canal, eliminar y lavar 3 x 5 minutos cada uno con
1,5 ml de buffer de lavado diluido en un agitador.

Incubar: Pipetear 1,5 ml de conjugado enzimático diluido (anti IgG humana conjugado con
(2do paso) fosfatasa alcalina) dentro de cada canal e incubar por 30 minutos a temperatura
ambiente (18 – 25 °C) en un agitador.

Lavar Aspirar y eliminar el líquido de cada canal. Lavar como se describió arriba.

Incubar: Pipetear 1,5 ml de solución de sustrato dentro de los canales de la bandeja de

(3er paso) incubación. Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente (18 – 25 °C) en un
agitador.

Parada: Aspirar y eliminar el líquido de cada canal y lavar cada tira 3 x 1 minuto con agua
118
 destilada.

Evaluar: Colocar la tira de test en el protocolo de evaluación, secar al aire y evaluar.

Para incubación automática con el EUROBlotMaster seleccionar el programa Euro01 AAb EL30

Interpretación de resultados

Manejo: Para la evaluación de las tiras test incubadas nosotros recomendamos generalmente usar el
software EUROLineScan. Después de detener la reacción usando agua destilada o desionizada, colocar la
tira test incubada dentro de lámina adhesiva del protocolo de trabajo verde usando un par de pinzas. La
posición de las tiras test podrían ser corregidas mientras están húmedas. Tan pronto como todas las tiras
test han sido puestas en protocolo de trabajo, estas deberían ser presionadas fuertemente usando un
papel filtro y dejar secar al aire. Después de secar, las tiras test se pegaran en una lámina adhesiva. Las
tiras test secas son escaneadas usando un escáner de superficie plana (EUROIMMUN AG) y evaluado con
EUROLineScan. Para información general sobre el programa EUROLineScan por favor revise el manual de
usuario de EUROLineScan (EUROIMMUN AG). El código de entrada del test en el EUROLine Scan es Ena1.
Si la evaluación visual debe ser ejecutada, ubique las tiras test dentro del protocolo de trabajo respectivo
para la evaluación visual. Este protocolo es disponible en EUROIMMUN bajo el nuero de orden ZD 1590-
0101-1 G.

Hay una banda de control en las tiras. La incubación fue ejecutada perfectamente si una reacción
fuerte de color es visible en la banda de control.

Antígenos y su posición en las tiras: Las tiras test EUROLINE han sido cubierta con los siguientes
antígenos:

nRNP/Sm: U1-nRNP nativo purificado por cromatografía de

afinidad de timo de ternero y conejo.
Sm: Antígeno nativo Sm purificado por cromatografía de
afinidad de bazo y timo bovino. El antígeno Sm contiene el
núcleo proteico de las partículas snRNP.
SS-A: Antígeno nativo SS-A purificado por cromatografía de
afinidad de bazo y timo bovino.
Ro-52: Ro-52 (52 kDa) recombinante. El cDNA
correspondiente ha sido expresado en el sistema baculovirus
en células de insectos.
SS-B: Antígeno SS-B nativo purificado por cromatografía de
timo de conejo y timo.
Scl-70: Antígeno Sc-70 (DNA-topoisomerasa I) purificado por
cromatografía de afinidad de timo conejos y bovino
Jo-1: Antígeno Jo-1 (Histidil-tRNA sintetasa)

119
EUROIMMUN recomienda interpretar los resultados basados en la intensidad de la señal:
Señal Intensidad de señal
Resultado
Evaluación visual EUROLine Scan
Sin señal 0-5 0 Negativo
Banda muy débil 6-10 (+) Al limite
Banda media a fuerte 11-25 o 26-50 +, ++ Positivo
Banda muy fuerte con intensidad >50 +++ Positivo
comparable a la banda control Fuerte

Resultados al límite en el rango de 6 a 10 deberían ser evaluadas como incrementadas pero negativas.

Una prueba de inmunofluorescencia indirecta debería siempre ser realizada en paralelo con la
determinación de anticuerpos contra el núcleo celular de EUROLINE. Por una parte, esto proporciona un
control sobre la verosimilitud como salvaguarda contra resultados falsos positivos, por otra parte,
usando EUROIMMUN células HEp-2 y en particular en combinación con secciones congeladas de hígado
primate, la inmunofluorescencia permite la detección de un rango amplio de anticuerpos anti-nucleares,
ya que no todos los antígenos celulares están disponibles actualmente con EUROLINE.

Características del test

Calibración: La reactividad de cada antígeno es estandarizada por el suero de referencia humano CDC-
ANA #1 a #11 del centro de control de enfermedades (CDC, Atlanta, EEUU). La reactividad del suero de
CDC en el EUROLINE Anti-ENA ProfilePlus 1 de EUROIMMUN es resumido en la siguiente tabla:

CDC-1 CDC-2
CDC-3 CDC-4 CDC-5 CDC-6 CDC-7 CDC-8 CDC-9 CDC-10 CDC-11
Antígeno Homogen
Centrom
eo / Moteado
moteado RNP Sm Nucleolar SS-A ero Scl-70 Jo-1 PM-Scl
periferico / SS-B
nRNP/Sm Pos Neg Pos Pos Pos Neg Neg Neg Neg Neg Neg
Sm Pos Neg Pos Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Neg
SS-a Neg Pos Pos Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg
Ro-52 Neg Pos Pos Neg Neg Neg Pos Neg Neg Pos Neg
SS-B Neg Pos Pos Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg
Scl-70 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg
Jo-1 Neg Neg Neg Nef Neg Neg Neg Neg Neg Pos Neg
La especificidad de estos sueros fue determinada en el CDC por patrones de inmunofluorescencia
(Sustrato: Células HEp-2 e Hígado de primate), el resultado de la inmunodifusión doble o contra
inmunoelectroforesis (los sueros no son en ningún caso monoespecíficos).

Rango de medición: El EUROLINE es un método cualitativo. No existe un rango previsto. El límite de

título es dado a la dilución 1:101.

Reacciones cruzadas: La especificidad analítica alta del sistema del test es garantizada por los sustratos
antigénicos usados (antígenos y fuente de antígenos). Este EUROLINE detecta específicamente

120
anticuerpos de clase IgG contra nRNP/Sm, Sm, SS-A, Ro-52, SS-B, Scl-70 y Jo-1. No se han encontrados
reacciones cruzadas con otros autoanticuerpos.

Interferencia: Suero hemolíticos, lipémicos e ictéricos con concentraciones superiores a 5 mg/ml para
hemoglobina, 20 mg/ml de triglicéridos y 0,4 mg/ml de bilirrubina no muestran efectos en los resultados
analíticos del presente EUROLINE.

Variaciones inter e intraensayo: Las variaciones interensayos fueron determinadas por análisis múltiples
de muestra caracterizadas en diferentes días. La variación intraensayo fue determinada por análisis
múltiples de muestras caracterizadas en un día. En cada caso la intensidad de las bandas estuvieron
dentro del rango especificado. Este EUROLINE demuestra una excelente producibilidad intra e
interensayo.

Sensibilidad y especificidad:
nRNP/Sm: Para la detección de autoanticuerpos contra RNP/Sm se determinó con ELISA una sensibilidad
de 100% usando 22 muestras de pacientes con enfermedad del tejido conectivo mixta (ETCM). La
especificidad fue 100% para donantes sanos (n=50) y 96% en un panel de enfermedades reumáticas
diferentes de lupus eritematoso sistémico (LES).

Sm: Para la detección de autoanticuerpos contra Sm se determinó con el método de referencia de ELISA
una sensibilidad de 100% fue determinado usando 45 muestras de pacientes con LES. La especificidad
fue 100% para donantes sanos (n=50) y 100% en un panel de enfermedades reumáticas no LES
(Sindrome SJögren n=14, Esclorederma n=38, polimiositis n=25).

SS-A: Para la detección de autoanticuerpos contra SS-A se determinó con ELISA una sensibilidad de 100%
usando 14 muestras de pacientes con síndrome Sjögren. La especificidad fue 100% para donantes sanos
(n=50) y 95% en un panel de enfermedades reumáticas no LES (Escleroderma n=38, ETCM n=22).

Ro-52: Para la detección de autoanticuerpos contra Ro-52 se determinó con el método westernblot una
sensibilidad de 100% usando 103 muestras de pacientes con LES y síndrome Sjögren (SLE n=23, Sjögren
n=77 y lupus eritematoso neonatal n=3). La especificidad fue 100% para donantes sanos (n=50).
Anticuerpos contra Ro-52 no son especifico de una enfermedad y pueden ser detectados en muestras de
pacientes sufriendo de miositis, escleroderma y otras enfermedades reumáticas (11-16). Ejemplo en 7 de
20 pacientes con escleroderma se detectaron autoanticuerpos contra Ro-52.

SS-B: Para la detección de autoanticuerpos contra SS-B se determinó con el método de referencia ELISA
una sensibilidad de 100% usando 14 muestras de pacientes con síndrome Sjögren. La especificidad fue
100% para donantes sanos (n=50) y 97% en un panel de enfermedades reumáticas no LES (escleroderma
n=38, ETCM n=22).

Scl-70: Para la detección de autoanticuerpos contra Scl-70 se determinó con el método de referencia
ELISA una sensibilidad de 100% usando 18 muestras de pacientes con Escleroderma. La especificidad fue
100% para donantes sanos (n=50) y para un panel de enfermedades reumáticas no LES (ETCM n=22,
síndrome Sjögren n=14, miositis n=25).

121
Jo-1: Para la detección de autoanticuerpos contra Jo-1 se determinó con el método de referencia ELISA
una sensibilidad de 100% usando 5 muestras de pacientes con miositis. La especificidad fue 100% para
donantes sanos (n=50) y 99% en un panel de enfermedades reumáticas no LES (escleroderma n=38,
ETCM n=22, síndrome Sjögren n=14)).

Rango de referencia: Los rangos de referencia fueron determinados usando una cohorte de donantes
sanos (n=50). Todos los donantes de sangre fueron negativos.

Antígenos: nRNP y Sm pertenecen a un grupo de ribonucleoproteinas pequeñas (snRNP: small

ribonucleoproteins) las cuales consisten en RNA de bajo peso molecular con alto contenido complejos de
uridina (U-RNA) con varias proteínas (pesos moleculares 9 – 70 kDa). El componente de RNA es
denominado como U1 a U5, dependiendo de su comportamiento en cromatografía. A pesa del RNA
particular, las partículas snRNP contienen 6 diferentes proteínas núcleo (B, B’, D, E, F, G), Adicionalmente
U1-nRNP contiene proteínas partículas específicas (70K, A, C). Anticuerpos contra U1-nRNP son
específicos contra uno o más proteínas partícula especificas 70K, A o C. En contraste, anticuerpos a Sm
puede también reaccionar con una o más proteínas núcleo. Las partículas UnRNP están involucradas en
el splicing de pre mRNA (premensajero) – Estos cortan las secuencias no codificantes (intrones) e
insertan las secuencias mRNA codificantes (exones) para recrear el RNA mensajero.

El antígeno SS-A nativo es una ribonucleoproteína pequeña compuesta de 5 moléculas de RNA (RNA Y1,
Y2, Y3, Y4 O Y5; 80-112 bases) y una proteína de 60 kDa. La banda SS-A en el EUROLINE consiste en el
antígeno nativo SS-A. Una proteína de 52 kDa es también asociada con el complejo SS-A/Ro, pero si este
proteína es un componente del complejo SS-A/Ro es controversialmente discutido en la literatura.
Respuesta de anticuerpo aislada contra Ro-52 no debería ser evaluada como anti-SS-A positivo o
específico para LES o síndrome Sjögren, debido a estos pueden ocurrir en muchas enfermedades
autoinmunes.

Recomendamos interpretar el EUROLINE con el test de referencia screening ANA (HEp-2/hígado primate)
como sigue:
IFI EUROLINE
Resultados
Células HEp-2 Ro-52 (52 kDa) SS-A (60 kDa)
ANA negativo Positivo Negativo Anti SS-A negativo
ANA positivo Positivo Negativo Anti SS-A negativo
Positivo o
ANA positivo Positivo Anti SS-A positivo
negativo
Se ha mostrado en varios estudios que sueros anti SS-A positivo siempre contienen anticuerpos contra
SS-A nativo (60 kDa) y adicionalmente podría exhibir anticuerpos contra Ro-52. Por ejemplo un estudio
japonés (EUROIMMUN) el suero de 103 pacientes con LES y síndrome Sjögren (LES n=26, síndrome
Sjögren n=77), los cuales fueron caracterizados como anti SS-A positivo por inmunodifusión doble, donde
el suero de 102 reaccionaron con SS-A nativo y 90 sueros reaccionaron adicionalmente con la banda Ro-
52. Pero ningún suero mostro solo reacción con la banda Ro-52. Este estudio demostró que anticuerpos
contra SS-A nativo puede ser detectado de manera confiable usando el SS-A nativo. En casos raros y en
sospecha de síndrome de lupus eritematoso neonatal, la banda Ro-52 podría entregar una información
suplementaria importante.

122
El antígeno SS-B es una fosfoproteína con un peso molecular de 48 kDa. Su función en el núcleo es de
proteína colaboradora de la RNA polimerasa III.

El antígeno Scl-70 ha sido identificado como la enzima DNA topoisomerasa I. El peso molecular del
antígeno nativo es de 100 kDa. Originalmente solo un producto de 70 kDa fue encontrado en
westernblot. La DNA topoisomerasa I está ubicada en el nucleoplasma y en particularmente alta
concentración en el nucléolo. La enzima participa en la replicación y transcripción del DNA de doble
hebra.

El antígeno Jo-1 es idéntico a la histidil-tRNA sintetasa, una fosfoproteína citoplasmática con un peso
molecular de 50 kDa. Esta se une el aminoácido histidina en el citoplasma a su correspondiente tRNA.

Significancia clínica

Anticuerpos frente a antígenos nucleares se dirigen contra varios componentes nucleares (sustancias
bioquímicas en el núcleo). Estos incluyen ácidos nucleicos, proteínas del núcleo y ribonucleoproteínas.
Estos anticuerpos son un hallazgo característicos de muchas enfermedades, en particular de las
enfermedades reumáticas. La frecuencia (prevalencia) de anticuerpos antinucleares en enfermedades
reumáticas inflamatorias es entre 20 a 100%, la más baja ocurre en artritis reumatoide entre 20 y 40%.
Por lo tanto, un diagnóstico diferencial de ANA es indispensable en la identificación de enfermedades
reumáticas individuales, también como útil en el diagnóstico de otras enfermedades autoinmunes.
Enfermedades reumáticas:
- Síndrome de Sharp (enfermedad del tejido conectivo mixta = ETCM)
- Lupus eritematosos sistémico (LES)
- Síndrome de Sjögren (Síndrome Sjögren primario)
- Esclerosis sistémica (Escleroderma sistémica, SSc)
- Forma limitada de esclerosis sistémica (síndrome CREST)
- Poli-/dermatomiositis
- Artritis reumatoide

U1-nRNP
(Uridina 1-proteina ribonuclear de bajo peso molecular)
Antígeno Enfermedad Prevalencia
Síndrome de Sharp 95 – 100%
LES 15 – 40%
U1-nRNP
Esclerosis sistémica 2 – 12%
Poli-/dermatomositis 12 – 16%
Los anticuerpos están dirigidos exclusivamente contra proteínas del núcleo A, C y D de U1-nRNP. Altos
títulos de anticuerpos contra U1-nRNP con una sensibilidad de 95% a 100% para la determinación de
autoanticuerpos contra nRNP/Sm son marcadores característicos para el síndrome de Sharp, un
multisintomático y multiforma de la enfermedad del tejido conectivo mixto combinando características
de la artritis reumatoide, LES, esclerosis sistémico y polimiositis. No se ha clarificado aun si en una
enfermedad independiente. Los títulos de anticuerpos se correlacionan con la actividad de la
enfermedad. Anticuerpos con U1-nRNP pueden también ser encontrado en paciente con LES (15-40%),
esclerosis sistemática (2-12%) y polimiositis (12-16%).

123
Sm
(Sm, Antígeno Smith – nombre del paciente índice; grupo de proteína ribonucleares pequeñas las cuales
están involucradas en el splicing del pre-mRNA. Estos consisten de RNA con alto contenido de uridina, U-
RNA, y varias proteínas; peso molecular 9-70 kDa).
Antígeno Enfermedad Prevalencia
Sm LES 5 – 40%
Anticuerpos contra Sm son altamente específicos para LES y puede ser hallado en 5-40% de los
pacientes. Junto con los anticuerpos contra dsDNA, estos pueden ser considerados patognomónicos para
esta condición. La prevalencia en caucásicos rodea 5-10%. Es mucho más alto en otros grupos étnicos,
ejemplo en árabes (20-42%), Chinos (alrededor 30%) o Africanos (alrededor de 30%). Por esta razón, la
prevalencia dada en estudios americanos es 20 – 40%

SS-A (Ro)
(sustancia soluble A o síndrome Sjögren A o Antígeno Robert – Nombre del paciente índice; complejo
proteico citoplasmático consistiendo en una molécula Y1-, Y2-, Y3-, Y4- o Y5-RNA y subunidad 60-kDa).
Antígeno Enfermedad Prevalencia
Síndrome Sjögren 40 – 95%
SS-A (Ro) Lupus eritematoso sistémico 20 – 60%
Lupus eritematoso neonatal 95 – 100%
Anticuerpos contra SS-A son dirigidos contra la subunidad 60 kDa y son asociados con varias
enfermedades autoinmune. Estos ocurren más comúnmente en pacientes con síndrome de Sjögren (40 –
95% de los casos), pero solo en LES (20 - 60%) y cirrosis biliar primaria (20%), y ocasionalmente también
en hepatitis autoinmune y viral. A demás de esto autoanticuerpos contra SS-A pueden ser encontrados
prácticamente en 100% de los casos de lupus eritematosos neonatal. La diferenciación de anticuerpos
anti SS-A de los llamados antígenos Ro-52 es de importancia diagnostica decisiva, desde que anticuerpos
contra Ro-52 no son específicos de una enfermedad, pero también son detectados en miositis, esclerosis
sistémica , otras colagenosas, lupus eritematosos neonatal, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune
y viral.

SS-B (La)
(Sustancia soluble B o síndrome Sjögren B o antígeno Lane – nombre del paciente índice: factor de
transcripción de terminación en el núcleo para RNA polimerasa III).
Antígeno Enfermedad Prevalencia
Síndrome Sjögren 40 – 95%
SS-B (La) Lupus eritematoso sistémico 10 – 20%
Lupus eritematoso neonatal 75%
Anticuerpos contra SS-B son encontrados casi exclusivamente en mujeres (29:1), en casos de síndrome
Sjögren (40-95%), LES (10-20%) y lupus eritematoso neonatal (75%). En el síndrome de Sjögren la
combinación de anticuerpos contra SS-A y SS-B ocurren principalmente.

Scl-70
(Enzima DNA topoisomerasa I, en el núcleo en particular en alta concentración en el nucléolo, juega un
rol en la replicación y transcripción del DNA de doble hebra)

124
 Antígeno Enfermedad Prevalencia
Esclerosis sistémica: 25 – 75%
Scl-70 - Forma difusa 40 – 65%
- Formal limitada 5 – 15%
La esclerosis sistémica (ES) puede manifestarse de dos formas, las cuales no siempre pueden ser
diferenciadas: La forma cutánea difusa y la forma cutánea limitada. Anticuerpos contra Scl-70 son
detectados en 25-75% de los pacientes con ES, mientras que la prevalencia es 40-65% e la forma difusa y
5-15% en la forma limitada.

PM-Scl
(Complejo antigénico de 11 – 16 polipéptidos con peso molecular entre 20 a 119 kDa. Están ubicados
predominantemente en el nucléolo y esta involucrados en la formación de RNA ribosomal. El principal
antígeno es el PM-Scl75. Estos dos antígenos son independientes del otro y no muestran reacción
cruzada. Se asume que PM-Scl está involucrado en el splicing del rRNA 5.85 y algunos U-snRNA)
Antígeno Enfermedad Prevalencia
Esclerosis sistémica de solapada 10 – 20%
Polimiositis/esclerosis sistémica solapada 18%
PM-Scl
Esclerosis sistémica (anti-PM-Scl75 positivo) 10%
Esclerosis sistémica (anti-PM-Scl100 positivo) 7%
El 90 – 98% de las muestras positivas a los autoanticuerpos PM-Scl en esclerosis sistémica incluyendo el
síndrome de solapamiento reaccionan con PM-Scl100 y 50-63% con PM-Scl75. La especificidad rodea el
99% (PM-Scl100) o 98% (PM-Scl75), y la sensibilidad de 6,6% o 11,8% respectivamente. Anticuerpos anti
PM-Scl son detectados en 18% de los pacientes con polimiositis/esclerosis sistémica síndrome solapado.
Aquí los autoanticuerpos están dirigidos contra ambos antígenos principales, PM-Scl100 y PM-Scl75. Si la
esclerosis sistémica progresiva se presenta, los anticuerpos contra PM-Scl75 muestran una prevalencia
de caso 10% y esos contra PM-Scl100 una prevalencia de 7%.

Jo-1
(Histidil-tRNA sintetasa citoplasmática)
Antígeno Enfermedad Prevalencia
Jo-1 Polimiositis / dermatomositis 25 – 35%
Anticuepros contra Jo-1 se ecuentran en polimiosistis y dermtomiositis con una prevaencia de 25 – 35%.
A menudo se asocian con una fibrosis intestinal recurrente del pulmon/alveolitis fibrosa.

Centrómeros
(Cuatro diferentes proteínas, CENP A, B, C, D: proteína del centrómero A con un peso molecular de 17
kDa, centrómero B con un peso molecular de 80 kDa, centrómero C con un peso molecular de 140 kDa y
centrómero D con un peso molecular de 50 kDa)
Antígeno Enfermedad Prevalencia
Esclerosis sistémica, forma limitada 80 – 95%
Centrómeros Esclerosis sistémica, forma difusa 8%
Cirrosis biliar primaria 10 – 30%
Autoanticuerpos contra el centrómero (anticuerpos anti centrómero = ACA) son asociados con la forma
limitada de la esclerosis sistémica y pueden ser encontrados en 80 – 95% de los pacientes. Se detectan

125
en solo 8% de los pacientes con la forma difusa, pero solo ocurren en 10 – 30% de pacientes con cirrosis
biliar primaria.

PCNA
(Antígeno nuclear de proliferación, ciclina I proteína colaboradora para la DNA polimerasa delta con un
peso molecular de 36 kDa. Tiene un rol clave en la regulación del ciclo celular: cuando aparece, la fase S
inicia. La proteína se deteriora en el medio de la fase G2)
Antígeno Enfermedad Prevalencia
PCNA Lupus eritematoso sistémico 3%
Una especificidad del 99% ha sido demostrada para la detección de autoanticuerpo contra PCNA. Sin
embargo la prevalencia es solo un 3%

dsDNA
(DNA de doble hebra, dsDNA, DNA nativo)
Antígeno Enfermedad Preval5encia
DNA de doble Lupus eritematosos sistémico 40 – 90%
hebra
La detección de autoanticuerpos contra el DNA es esencial en el diagnóstico de LES. Los anticuerpos con
DNA se dividen en dos grupos diferentes: anticuerpos con el DNA de doble hebra, DNA nativo (dsDNA) y
anticuerpos contra DNA de hebra simple, DNA denaturado (ssDNA). Los anticuerpos definidos como
reactivos con dsDNA reconocen principalmente epítopes en la columna vertebral de la doble hélice y son
por lo tanto reactivos con el DNA de hebra doble y simple. Por otra parte, los anticuerpos definidos
como reactivo con ssDNA reconocen epítopes de bases de purinas y pirimidinas. Estos podrían
reaccionar con epítopes de la columna vertebral de la desoxirribosa fosfato. Los anticuerpos Anti-dsDNA
se encuentran casi exclusivamente en LES. La prevalencia de los anticuerpos contra dsDNA rodea 20 –
90% dependiendo del método de detección y la actividad de la enfermedad. Los anticuerpos contra
dsDNA son también detectados ocasionalmente en pacientes con otras enfermedades autoinmunes e
infección y, en casos raros, en personas sanas clínicamente. El 85% de las personas del último grupo
desarrolla LES dentro de 5 años de iniciada la detección de anti-dsDNA. Sin embargo, LES no puede ser
excluida completamente si no se detectan los anticuerpos anti dsDNA.

Nucleosomas
(Subunidad funcional de los cromosomas en el núcleo conteniendo histonas y dsDNA)
Antígeno Enfermedad Prevalencia
Nucleosomas Lupus eritematosos sistémico 40 – 70%
Anticuerpos contra nucleosomas han sido encontrados en el suero de pacientes con lupus eritematoso
sistémico. Hasta recientemente, su relevancia como marcador característicos para LES fue limitada ya
que el 70% de los sueros de pacientes con esclerosis sistémica reaccionaron con preparados
convencionales de nucleosomas. Anticuerpos contra los nucleosomas usando la nueva preparación
altamente purificada de EUROIMMUN como antígeno tienen una especificidad de casi 100% para LES:

126
Con este test no se han encontrados reacciones en el suero de donantes sanos o pacientes con esclerosis
sistémica, síndrome Sjögren o polimiosisitis.

Histonas
(Proteínas nucleares, tipo H1, H2A, H2B, H3, H4, las cuales forman nucleosomas en conjunto al dsDNA,
unidad funcional de los cromosomas en el núcleo)

Antígeno Enfermedad Prevalencia

Lupus eritematosos inducido por drogas 95 – 100%
Histonas Lupus eritematosos sistémico 50%
Artritis reumatoide 15 – 50%
Se pueden formar autoanticuerpos contra todos los 5 tipos de histonas. Los más frecuentes son los
anticuerpos contra H1 y H2B. Estos son contantemente encontrados lupus eritematosos inducido por
drogas (95%). Alrededor del 50 – 75% de los pacientes tratados con procainamida y 25 – 30% de esos
tratados con hidralazina desarrollan anticuerpos antinucleares sin síntomas de lupus durante una terapia
prolongada. Un tercio de esos pacientes demostraron anticuerpos contra histonas y después de distintos
tiempos de terapia mostraron signos clínicos de lupus eritematoso indicado por drogas: poliartralgia,
pleuritis, pericarditis. Los anticuerpos antinucleares persisten por años después de la descontinuación de
la droga y los síntomas se calman. Anticuerpos contra histonas también ocurren en alrededor de 50% de
los pacientes con lupus eritematoso no inducido por drogas y en 5 – 50% de los pacientes con artritis
reumatoide.

Proteínas P Ribosomales
(3 proteínas de subunidad ribosómica de 60S, referida como P0 con un peso molecular de 38 kDa, P1 con
un peso molecular de 19 kDa y P2 con un peso molecular de 17 kDa; el principal epítope imunoreactivo
está ubicado en el extremo carboxi-terminal, y en todas las 3 proteínas consiste en una secuencia
idéntica de 17 aminoácidos)
Antígeno Enfermedad Prevalencia
Proteínas P Lupus eritematosos sistémico 10%
Ribosomales
Los anticuerpos anti proteínas ribosomal P (ARPA) son específicos para LES. En un estudio multicéntrico
realizado por EUROIMMUN, muestras de suero de 360 pacientes con LES, 79 pacientes sufriendo de
otras patologías colagenosas (esclerosis sistemica, síndrome Sjögren, dermatomiositis/polimiositis,
síndrome de Sharp) y 206 donantes sanos fueron investigados para ARPA. ARPA fueron detectados en 34
(9,4%) e los 360 pacientes con LES y 3 (12,5%) de los 24 pacientes con síndrome de Sharp. En 2 de esos 3
pacientes anticuerpos se encontraron anticuerpos contra dsDNA, indicando un solapamiento con LES.
ARPA no fueron encontradas en ningún paciente con esclerosis sistémica, síndrome Sjögren o
dermatomiositis/polimiositis o en donantes sanos. En LES, el titulo de los anticuerpos contra proteína P
ribosomal no se correlaciona con la actividad de la enfermedad. La prevalencia de ARPA fue idéntica en
pacientes de LES con o sin compromiso del SNC, nefritis o hepatitis. Los ARPA pueden ser detectados
más frecuentemente en pacientes con otros fenómenos acompañantes de LES por ejemplo psicosis,
aunque esto no es estadísticamente significativo.

AMA-M2

127
(Enzima E2 y proteína X del complejo Piruvato deshidrogenasa son los principales antígenos del
anticuerpo anti M2 mitocondrial)
Antígeno Enfermedad Prevalencia
AMA-M2 Cirrosis biliar hepática primaria > 90%
Títulos elevados de anticuerpos contra M2 (AMA-M2) son característicos de la cirrosis hepática biliar
primaria (CHBP), mientras que la enzima E2 y la proteína X del complejo Piruvato deshidrogenasa son los
antígenos preferidos. La CHBP es una enfermedad hepática colestásica inflamatoria crónica mediada por
el sistema inmune de etiología desconocida. La enfermedad es caracterizada por predominancia
femenina (> 90%) con la mayoría de los casos observados entre las edades de 40 a 60 años. La incidencia
estimada de CHBP en diferentes partes del mundo es 4 a 31 casos/millón por año.

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FIN DE TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO DEL KIT “ANTI-ENA PROFILEPLUS 1 EUROLINE"

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