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M. en C.

Armando Lemos Pastrana


Departamento de Microbiología
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
IPN
Microscopia
Contenido
1. Historia
2. Estructura de un microscopio compuesto
3. Principios de microscopia
4. Microscopios compuestos
• de campo claro
• de campo obscuro
• de contraste de fases
• de fluorescencia
• confocal
5. Microscopios electrónicos
• de transmisión
• de barrido
• de efecto túnel
• de fuerza atómica
Historia del microscopio

El primer microscopio se atribuye a Zaccharias y Hans


Janssen en 1590, consistía de dos tubos dentro de otro,
en uno de los extremos una tenía una lente biconvexa,
que correspondía al ocular y una plano convexa en el
otro extremo que correspondía al objetivo.

En 1670, Roberto Hooke diseñó uno de los microscopios


más elegantes de esta época, el cual ilustra su
tratado “Micrographia”, uno de los primeros
documentos sobre microscopia e imágenes.

Antoni van Leewenhoek, fue un comerciante de


telas, quien se dedicaba a tallar lentes,
convirtiéndose en un científico aficionado. El fue
la primera persona que pudo observar a las
bacterias con un microscopio simple, organismos
que no habían sido vistos con los microscopios
compuestos de la época que no tenían el poder
de resolución de su microscopio.
Historia del microscopio

En el siglo XVII, los diseñadores Británicos


elaboraron diferentes versiones del microscopio
de trípode, basado en el microscopio de
Edmund Culpeper, que era un instrumento de
fácil uso y con mecanismos precisos de enfoque.

En el siglo XIX hubo un enorme


avance en la tecnología de los
microscopios, las lentes eran de
muy buena calidad, los sistemas
mecánicos incorporan los tornillos
macro y micrométricos e inicia la
microfotografía.

Durante el siglo XX, la tecnología


utilizada en la elaboración de los
microscopios llega a su clímax, la
calidad de las lentes y las opciones
en el manejo y utilidades de los
equipos han permitido un avance
enorme en las ciencias biológicas.
Estructura de un microscopio Componentes principales
compuesto de campo brillante

Oculares

Tubo de microscopio

Brazo
Objetivos

Platina Carro de platina

Condensador
Tornillo de platina

Tornillos macro y
Fuente luminosa micrométrico

Pie o base
Estructura de un microscopio
Sistema óptico
Condensador
El condensador de un microscopio permite dirigir el haz de luz hacia el espécimen que se
desea observar. Existen dos tipos de condensador, el más común es el de Abbe, el cual no
corrige ninguna forma de aberración óptica. El segundo tipo es el condensador acromático
que corrige tanto la aberración cromática como la esférica. De estos dos tipos de condenador
existen variantes en cuanto al uso que se le va a dar, para campo obscuro, para contraste de
fases, fluorescencia, etc. Todos los condensadores tienen grabada su apertura numérica, la
cual debe de ser igual o ligeramente mayor a la apertura numérica de los objetivos, de no ser
así la resolución con el objetivo no será total. En la mayoría de los condensadores se puede
usar aceite entre la lente del condensador y la preparación, para usar la totalidad de la
apertura numérica.

En forma general un condensador básico consta de tres partes:

Lente frontal

Diafragma de iris del condensador

Lente auxiliar
Estructura de un microscopio Sistema óptico

Objetivos.
Los objetivos son las lentes más cercanas al espécimen que se desea observar y se encuentran
montados en el revolver. Los objetivos generalmente encontrados en microscopios de
enseñanza son los objetivos acromáticos, cuales están corregidos para aberración esférica y
aberración cromática en dos colores. Otro tipo de lente son los objetivos apocromáticos, los
cuales tienen corregida la aberración cromática para los tres colores (verde, rojo y azul) y una
corrección mayor en la aberración esférica. Los objetivos semiapocromáticos tienen una
corrección intermedia entre los dos tipos anteriores.

Los tres tipos de objetivo se elaboran con un sistema compensatorio de lentes que evitan la
curvatura del campo, dando como resultado una imagen plana y se les conoce con el nombre
de plano objetivos.
Estructura de un microscopio Sistema óptico

Aumentos

Acromático A 40X PLAN Imagen plana


0.65 Apertura numérica
160 / 0.17
oil Grosor del cubreobjetos (0.17 mm)
Distancia entre
objetivo y ocular
en mm.
Anillo de identificación de aumentos
Medio de inmersión* amarillo 10X
negro aceite azul claro 40X
naranja glicerina blanco 100X
blanco agua
rojo aceite, agua o glicerina

*Únicamente en los objetivos en que se requiere

Los objetivos de buena calidad tienen grabado en la pared del barril varios datos
que nos permiten conocer las características de cada una de las lentes.
Estructura de un microscopio Sistema óptico

Oculares.
El ocular es el juego de lentes a través de los cuales observamos en el microscopio,
cuya función es la de ser un sistema de lentes de proyección. Existen tres tipos de oculares, el
más común es el Huygenian, que se usa generalmente con objetivos acromáticos, y que
permite observar con el uso de anteojos. El segundo tipo es el ocular de compensación que se
usa con objetivos apocromáticos y de campo plano, logrando imágenes de calidad superior. El
tercer tipo es el ocular de fotografía que permite proyectar imágenes planas a una película de
una cámara, este tipo se considera el más fino de los oculares.

Corrector de dioptrías

10X /20  Permite el uso de anteojos

Campo del ocular

Aumento del ocular

Los oculares tienen en grabado en el barril información sobre las características de esa lente.
Estructura de un microscopio Sistema óptico
Diámetro del campo visual.
Este valor nos permite apreciar el tamaño de los organismos observados y se calcula
dividiendo la cifra del campo del ocular entre el aumento del objetivo, el resultado obtenido
está expresado en micrómetros. Conociendo el diámetro, es posible calcular el tamaño
aproximado de un espécimen.

Diámetro del Campo visual = 20 / 100 = 0.2 mm = 200 µm

50 µm
200 µm

El tamaño aproximado del espécimen es 25 µm

100 µm

Diámetro del Campo visual


Estructura de un microscopio Sistema óptico

Aumento total.
Para los microscopios en los cuales el factor del tubo del microscopio es igual a 1X,
el aumento total se obtiene multiplicando el valor de aumento del ocular por el del objetivo.

Aumento total = 10x (del ocular) x 100x (del objetivo) = 1000x

Si el tubo del microscopio tiene un factor diferente a 1x, como puede ser 0.8x,
1.25X, 1.6X ó 2X, el resultado anterior se multiplica por el factor correspondiente
obteniéndose el aumento total. Para los factores anteriores los aumentos serían:
800x, 1250x, 1600x y 2000x respectivamente.
Estructura de un microscopio
Sistema mecánico

El sistema mecánico de un microscopio está formado por el pie o base, el brazo, la platina, el
tubo, el tornillo del condensador y los tornillos macro y micrométricos. Los componentes
marcados son partes del sistema que tienen influencia en el enfoque, la resolución, el
aumento total y la localización del espécimen.

El tubo del microscopio que permite el paso de luz del objetivo hacia el ocular tiene grabado un
número que se le conoce con el nombre de factor del tubo. La mayoría de los microscopios este
valor es de 1X, pero existen microscopios en que este valor varía (0.8X, 1.25X, 1.6X ó 2X,
cuando este es el caso el aumento total es diferente para cada combinación de ocular-objetivo
usada.

El tornillo del condensador, permite acercar o alejar la lente frontal, con lo cual podemos
variar la iluminación del objeto observado, pero también alteraremos el contraste en la
imagen.

Los tornillos macro y micrométricos, permiten el enfoque de la preparación, correspondiendo


al tornillo micrométrico el enfoque fino, pudiendo determinar la profundidad de foco
dependiendo del objetivo usado.

Sobre la platina se colocan las preparaciones y con sus tornillos respectivos se busca la
imagen. Anotando los valores de referencia de las regletas horizontal y vertical, es posible
mover la preparación y localizar fácilmente la imagen ajustando los valores obtenidos
previamente.
Principios de microscopia

Un microscopio es un instrumento que nos permite observar objetos que no


pueden ser observados a simple vista. Por la forma de iluminación de los objetos a observar,
los microscopios los podemos clasificar en dos categorías. Cuando la iluminación es a través
de la preparación que se desea Observar, se le denomina iluminación diascópica y cuando la
iluminación se hace sobre el objeto se le conoce como iluminación episcópica.

Dos tipos de microscopios con


iluminación diascópica. A la izquierda,
uno de tipo invertido, utilizado en la
observación de cultivo de tejidos o de
especimenes que reptan o se localizan
en el fondo de una preparación; y a la
derecha, uno de tipo estándar que se
utiliza para la observación de
preparaciones húmedas y fijas.

Microscopios con iluminación episcópica,


llamados estereoscópicos, se utilizan para la
observación de especimenes de más de 50
micrómetros, así como de organismos vivos.
Principios de microscopia Apertura numérica

La calidad de una lente se establece básicamente con el valor denominado apertura numérica
(AN), que depende del diámetro de la lente, la distancia de trabajo y el índice de refracción. En
lentes de calidad este valor siempre esta grabado en un lado del barril del objetivo. Para
determinar este valor se hace uso de la siguiente fórmula:

AN = n sen θ

donde n es el índice de refracción y θ el ángulo que se forma al incidir la luz en un objeto a la


altura de trabajo.
18 mm
10 mm
10 mm
θ
θ
θ

θ = 48o35´ θ = 60o θ = 60o


NA = 0.75 NA = 0.866 NA = 0.866

Con la apertura numérica se puede conocer el aumento efectivo de un objetivo, es decir el número
de veces que se puede aumentar un objeto. Esto se logra multiplicando la apertura numérica por
mil.

Valores para objetivos acromáticos


Aumento de lente 4x 10x 40x 100x
Apertura numérica 0.10 0.25 0.65 1.30
Aumento efectivo 100 veces 250 veces 650 veces 1300 veces
Principios de microscopia Poder de resolución

La calidad de un microscopio se basa en su poder de resolución, es decir en la capacidad de


discernir la observación de detalles finos, esta resolución está dada por la distancia mínima (d)
en que dos objetos se observan como dos entidades separadas con una combinación de ocular-
objetivo dada y se calcula con la siguiente fórmula:

d = 0.5 λ/ AN ó d= λ/2AN

donde λ es la longitud de onda de la luz utilizada y AN es la apertura numérica del objetivo.

Valores para objetivos acromáticos

Aumento del
4X 10X 40X 100X
objetivo

Apertura
0.1 0.25 0.65 1.30
numérica

Poder de
Resolución 3.05 1.22 0.47 0.24
(micrometros)
Principios de microscopia Aberraciones
Las aberraciones son imperfecciones de las lentes que modifican substancialmente el poder de
resolución. Estas aberraciones pueden ser de forma cromática, esférica o por curvatura de
campo.

La aberración cromática es la imposibilidad de la lente para enfocar los diferentes colores en el


mismo punto.

Azul Verde Rojo

La aberración esférica es el resultado de la refracción de luz en otros puntos diferentes al centro,


el resultado es que cuando se observa una imagen se observa un halo difuso a su alrededor.

La aberración por curvatura de campo no enfoca en una superficie plana sino esférica, esto da
como resultado que cuando se enfoca el centro se desenfoca la orilla y viceversa.
Principios de microscopia Contraste
Se entiende por contraste al número de sombras que se pueden observar en una imagen. Así por
ejemplo imágenes de alto contraste sólo tienen dos colores blanco y negro, sin matices de gris. A
mayor número de sombras habrá menor contraste, pero esto permite mayor información al poner
de manifiesto otras estructuras, esta última característica se le denomina intervalo dinámico. En
las imágenes a color se considera que a mayor número de colores y con menor número de
matices tendremos un mayor contraste. En los microscopios de campo claro el contraste y la
resolución inversamente proporcionales, por lo tanto a mayor contraste menor resolución, por lo
tanto se requiere aplicar un colorante o dos, para obtener un mejor contraste. Asimismo, a mayor
iluminación menor contraste y a menor iluminación mayor contraste. Por lo tanto, el enfoque
correcto requiere la correcta combinación de contraste, resolución e iluminación.

A B C
Microfotografías de la observación de una amiba con tres condiciones de contraste.
A, bajo contraste; B, contraste normal; C, alto contraste.
Principios de microscopia Profundidad de campo
Se entiende por profundidad de campo el área visible entre el frente y el fondo de un espécimen
y cuyos componentes tienen un enfoque aceptable. Esta profundidad de foco depende de la
apertura numérica del objetivo; a menor apertura numérica la profundidad de foco es mayor y a
mayor apertura numérica menor profundidad de campo.

Aumento de la lente Apertura numérica Profundidad de


campo
(micrómetros)
4x 0.1 50.7

10x 0.25 8.11

40x 0.65 1.2

100x 1.30 0.3

Para calcular la profundidad de campo de cada uno de los objetivos de un microscopio se utiliza
la siguiente fórmula:

DPC = λ / NA2
DPC = distancia de la profundidad de campo expresada en micrómetros
λ = longitud de onda de la luz utilizada expresada en micrómetros (luz verde 0.507 µm)
NA = apertura numérica
Microscopios compuestos Microscopio de campo claro

El microscopio de campo claro es el


instrumento de más uso en el trabajo de
rutina. Aún cuando se puede usar para hacer
observaciones tanto de especímenes en
preparaciones en fresco como teñidas,
muchas de las estructuras internas del
organismo no son visibles a menos que se
usen tinciones selectivas.

La parte fundamental para realizar una observación adecuada es el tipo de iluminación. En la


iluminación crítica la fuente de luz se enfoca por medio del condensador en el plano del
espécimen, esto produce una gran cantidad de iluminación, la cual no es uniforme en todo el
campo visual, lo que no permite una observación adecuada.

La llamada iluminación Kohler es un método para ajustar la iluminación en un microscopio


compuesto. Este ajuste permite una iluminación uniforme de calidad en todo el campo, al
enfocar el campo a la apertura mínima del condensador sobre el plano del espécimen. Para
observaciones que requieren el máximo potencial de un microscopio es necesario realizar la
iluminación Koeler con regularidad.
Microscopios compuestos Microscopio de campo claro

Técnica de iluminación Kohler:

b Seleccionar el objetivo lupa. Bajar el diafragma. Colocar la muestra y enfocar.

b Seleccionar el objetivo de observación, y enfocar el espécimen.

b Cerrar la abertura del condensador. Algunos microscopios lo tienen en su base.

b Subir el diafragma hasta hacer nítido el borde del campo. Se observara en el campo visual
un halo rojo o azul. Mover el condensador al punto donde se combinen
ambos colores o el más cercano al azul.

b Después de este ajuste puede cambiar de objetivo, pero sin mover el condensador.

b Abrir el diafragma hasta cubrir todo el campo, sin mover el condensador.

b Colocar un filtro azul

b Ajuste el nivel de intensidad luminosa, en el punto en que no sea molesta al observador.

b En el caso de microscopios binoculares, ajustar la distancia interpupilar.

b Ajustar las dioptrías a los ojos del observador.

b Enfocar con el tornillo micrométrico.

b Contrastar con el diafragma iris.


Microscopios compuestos
Microscopio de campo claro
Imágenes

Staphylococcus aureus

Streptococcus sp.

Bacteria Gram +, en muestra de esputo Nocardia en una biopsia de pulmón


Microscopios compuestos Microscopio de campo obscuro

Microscopio de campo obscuro


Este tipo de microscopio, presenta un
condensador especial que bloquea los rayos
luminosos centrales y deja pasar los
periféricos, que se reflejan en la cara interna
del condensador, de esta forma el espécimen
se ilumina con los rayos laterales que son
reflejados observando un objeto fuertemente
iluminado sobre un fondo obscuro. Para evitar
que penetren en el objetivo los rayos
tangenciales que emergen del condensador, se
utiliza un diafragma en el objetivo o un
objetivo de abertura numérica inferior a 1,1.

Es útil para observar límites y movimientos de


pequeños especimenes no teñidos y sobre todo
puede ser usado en muestras en fresco.
Principalmente se ha usado para observar
muestras de organismos que se tiñen con
dificultad, como es el caso de Treponema
pallidum y otras espiroquetas
Microscopios compuestos
Microscopio de campo obscuro

IMAGENES

Fotografía de Chlamidia en Fotografía de Borrelia en campo


Campo obscuro obscuro
Microscopios compuestos Microscopio de contraste de fases

El conocimiento relativo al contraste de fases data


de 1892, pero su aplicación práctica se inicia a
partir del primer cuarto del siglo XX. El microscopio
de contraste de fases es un sistema para obtener
mayores contrastes en especímenes translúcidos
sin la ayuda de tinciones.

El fundamento de este microscopio radica en el


hecho de que la luz al atravesar medios de diferente
densidad modifica su longitud de onda y amplitud
originales. El índice de refracción mide el grado de
modificación de la luz al pasar por medios
translúcidos de diferente densidad. El propósito del
contraste de fases es tomar ventaja de los cambios
de fase de la luz con respecto al medio o de los
diferentes índices de refracción de los organelos o
estructuras del especimen. Si a un organismo,
conformado de diferentes estructuras (cada una con
diferente índice de refracción y espesor), se le
incide una onda luminosa, esta modificará su
dirección y amplitud, de acuerdo a las capas que
este atravesando. Estos cambios que se presentan
en un microscopio de campo claro no son
perceptibles al ojo humano, por lo que se requiere
la utilización de instrumentos ópticos para hacerlos
evidentes.
Microscopios compuestos Microscopia de contraste de fases

Las diferencias básicas de un microscopio de


contraste de fases con uno de campo claro son:
el condensador es diferente ya que en su
interior se encuentra un diafragma anular. El
objetivo también es diferente, ya que dentro de
estos se encuentra también un diafragma de
fase, cuya estructura cubre las zonas claras del
diafragma del condensador. Este juego permite
un retraso de 1/4 de la longitud de onda, lo que
lo hace perceptible al ojo humano.

El condensador y los objetivos de contraste de


fases están marcados como pH, lo que indica
que son para usar contraste de fases.

Este tipo de microscopio, permite ver


organismos vivos sin teñir y poder diferenciar
estructuras.
Microscopios compuestos
Microscopia de contraste de fases
IMAGENES

Fotografía de una bacteria filamentosa del azufre

Arriba: Fotografía del alga Spirogyra,


mostrando sus cloroplastos espirales.
Abajo: Diatomea Stephanodiscus,
donde los cloroplastos se observan
rojos
Fotografía del hongo del género Aspergillus
a c

b d

Paramecio observado en varios microscopios compuestos. a, campo brillante; b, campo obscuro;


c, contraste de fases; d, contraste de interferencia diferencial.
Microscopios compuestos Microscopio de fluorescencia

La fluorescencia es la emisión de luz de una substancia cuando ésta es estimulada por


longitudes de onda corta, como puede ser la luz ultravioleta (LUV) (360 nM), que al incidir en
una substancia con la capacidad de fluorescer, emite luz visible (555 nM), lo que permite
observarla.
En el interior de un organismo existen substancias como
porfirinas, clorofilas, citocromos, algunas vitaminas, etc, que
al excitarse con longitudes de onda corta, emiten
espontáneamente luz visible, a este fenómeno se le llama
fluorescencia primaria o autofluorescencia.

Cuando se desea observar substancias u objetos que no


tienen fluorescencia primaria es necesario unir substancias
fluorescentes o fluoróforos como los derivados amino,
carboxi e isotiocianato de fluoresceina, la rodamina B, entre
otras. A este tipo de fluorescencia se le conoce como
fluorescencia secundaria. Para observaciones más
específicas, los fluoróforos se pueden conjugar o unir a
anticuerpos o a sondas de DNA que reconocen secuencias de
RNA o DNA específicos. Esto permite observar estructuras
blanco fluorescentes después de la unión del anticuerpo o
sonda.

El microscopio de fluorescencia presenta las siguientes diferencias con un microscopio de


campo claro: su fuente luminosa es una lámpara de luz ultravioleta. Un condensador con un
filtro de excitación que retiene todas aquellas longitudes de onda que no excitan a la
substancia fluorescente y un filtro supresor selectivo que retiene toda aquella luz
ultravioleta que no fue absorbida por la substancia fluorescente para evitar daño al ojo.
Además, es necesario que las lentes por las que va a atravesar la LUV o absorban esta
radiación, por lo que se fabrican de materiales como el cuarzo.
Microscopios compuestos Microscopio de fluorescencia
IMAGENES

El hongo Candida albicans formando Células musculares


tubo germinativo

Embrión de erizo de mar en mitósis


Microscopios compuestos Microscopio confocal

La microscopia confocal nos permite observar células vivas,


permitiendo la observación de actividades fisiologicas “in
vivo”.

Todos los microscopios confocales utilizan el láser por sus


propiedades de intensidad lumínica, selección de longitud
de onda y uniformidad (emisión continua). Los más
frecuentes son los producidos por lámparas de argón (488 y
514 nm), krypton (568 y 6647 nm) y helio-neón (543 y 633
nm) para iluminar en el espectro de la luz visible. La
iluminación ultravioleta (UV) está incorporada sólo en
algunos equipos, ya que requiere un láser especial de argón
o de helio-cadmio y, cromáticas significativas cuando
transmite luz ultravioleta.

La mayor parte de los microscopios confocales comercialmente se suministran con el software


necesario para el procesamiento de la imagen digital. Son importantes las opciones que permiten
mejorar la calidad de la imagen mediante la reducción del ruido de fondo (aplicando filtros para
las intensidades bajas de fluorescencia) o incrementando el contraste de la imagen digital.
Microscopios compuestos
Microscopio confocal

Imagen tridimensional de un liquen obtenida con


microscopia confocal, en la parte superior se observan
las algas que conforman esta simbiosis y en la parte
inferior la hifas del hongo.
Microscopios electrónicos
Microscopio electrónico de transmisión
En este microscopio se utilizan electrones en vez
de rayos de luz, y como lentes funcionan unos
electroimanes. Cuando los electrones pasan a
través de la preparación algunos son difractados
creando entonces una imagen que se hace visible
en una pantalla sensible a los electrones. La
longitud de onda de la radiación de los electrones
es mucho más pequeña que la de la luz visible y,
como el poder resolutivo de un microscopio es
inversamente proporcional a la longitud de onda
utilizada. La resolución y aumentos totales
obtenida con el microscopio electrónico es mucho
mayor que la conseguida con el microscopio
óptico.

Con el microscopio óptico ordinario o el de


contraste de fases las estructuras más pequeñas
que pueden observarse tienen unos 0,2 µm, con el
microscopio electrónico pueden verse fácilmente
objetos de 0,001 µm con 300,000 aumentos. Con
el microscopio electrónico es posible ver muchas
estructuras. Sin embargo, a causa de la naturaleza
de este instrumento sólo pueden examinarse
objetos muy delgados: para observar estructuras
internas, incluso una sola bacteria, ésta es
demasiado gruesa para ser observada
directamente, por lo que se requiere hacer cortes
con un ultramicrotomo.
Microscopios electrónicos Microscopio de transmisión
IMAGENES

Huevo del nemátodo Heterodera avenae


infectado por el hongo Verticillum. Se
observan las hifas del hongo (h),
tanto en el exterior como en el interior de
la cubierta del huevo (c). La fotografía A,
muestra el canal de penetración (p).

Fotografía de las placas basales del flagelo de Rhodobacter


sphaeroides, utilizando la técnica de sombreado.
Microscopios electrónicos Microscopio de barrido
En el microscopio electrónico de barrido,
se utiliza una fuente de rayos catódicos, que
por medio de un campo magnético nos
permite enfocar el haz de electrones sobre la
muestra a analizar y de esta forma obtener
una imagen tridimensional. Con este
microscopio se pueden alcanzar hasta
200.000 aumentos.

Von Ardenne, en 1938, construyó el


primer Microscopio Electrónico de Barrido
(MEB); posteriormente, en Inglaterra, se
construyó el primer MEB Ambiental, con el
cual se pueden observar muestras hidratadas.

En el microscopio electrónico de barrido, la muestra se coloca en una cámara al alto vacío con
controles de posición en las tres dimensiones.

El haz de electrones se produce en la parte superior del microscopio por medio del calentamiento
de un filamento metálico con un voltaje de 10 a 30 KV. El rayo de electrones primarios sigue un
recorrido a través de la columna de vacío del microscopio, siendo modificado por un conjunto de
bobinas deflectoras (campos magnéticos). Primero atraviesa las lentes condensadoras o
electromagnéticas que le permiten ser reenfocado o centrado hacia la muestra. Posteriormente, el
diámetro del haz de electrones puede ser modificado al pasar por las lentes objetivas que
controlan la cantidad de electrones en el interior. Cuando los electrones primarios golpean la
muestra, son emitidos electrones secundarios que son atraídos por un colector, donde se aceleran
y se dirigen al escintilador. Una vez ahí la energía cinética es convertida en señales luminosas de
mayor o de menor luminosidad. Esta luz es dirigida a un amplificador donde se convierte en señal
eléctrica, la cual pasa a una pantalla de observación donde la imagen es formada línea por línea y
punto por punto, y ésta puede ser vista en tercera dimensión.
Microscopios electrónicos Microscopio de barrido

El MEB consta de las siguientes partes:


1. Cañón de electrones (e-).
2. Filamento de tungsteno o de hexaboruro
de lantano-LaB6.
3. Ánodo.
4. Columna en vacío.
5. Lentes condensadores (centran y dirigen
el rayo de electrones).
6. Lentes Objetivas (controlan la cantidad
de electrones del haz).
7. Detectores para colectar y medir
electrones (producción de imagen).
8. Bobinas de barrido (obligan al haz a
barrer la muestra).
9. Control de aumento.
10. Generador de barrido.
11. Colector de electrones (electrones se
atraen y se aceleran).
12. Escintilador (convierte la energía
cinética de los e- en luz visible).
13. Amplificador.
14. Pantalla (imagen).
15. Bombas de vacío.
Microscopios electrónicos Microscopio de barrido
IMAGENES

Las imágenes que se obtienen por microscopía electrónica son inicialmente en blanco y negro,
sin embargo pueden ser digitalizadas y modificadas para convertirlas en colores falsos.

Cabeza del mosco Aedes aegypti

Escolex de Taenia solium


Microscopios electrónicos Microscopio de barrido
IMAGENES

Staphylococcus aureus Globulos rojos humanos

Bacteriofagos de Escherichia coli Cabeza de hormiga


Los responsables de los embarazos no deseados
Micrografía de una cianobacteria procesada por congelación y fractura y obsevada por microscopía
electrónica de barrido.
Microscopios electrónicos
Microscopio de efecto túnel
Dentro de la microscopia, dos nuevos tipos de microscopio han sido diseñados y se les
cataloga dentro de la microscopia de proximidad, las cuales reúnen un conjunto de técnicas
que no utilizan lentes, ni radiación como pueden ser rayos X o electrones, etc, para obtener
imágenes de gran resolución. Las dos técnicas más relevantes son la microscopia de efecto
túnel y microscopia de fuerza atómica.

La aplicación de criterios racionales de diseño ha recibido un fuerte impulso con el desarrollo


de técnicas tales como la microscopia de fuerza atómica (AFM, acrónimo de Atomic Force
Microscopy) y la microscopia de efecto túnel (STM, acrónimo de Scanning Tunnel Microscopy),
dos procedimientos que permiten conocer la topografía y la organización de las moléculas en la
superficie de un material con una resolución de nanómetros (esto es, de una milésima de
millonésima de metro), lo que hace posible caracterizar la superficie de un material a escala
atómica. Esta información, junto al conocimiento de cuáles son los procesos biológicos que se
estimulan como consecuencia de la estructura química y la topografía de cada biomaterial, ha
llevado al desarrollo de una nueva generación de biomateriales cuyo diseño se basa en la
observación del ordenamiento estructural de su superficie. También, en el reconocimiento en
ella de sitios precisos donde tienen lugar las reacciones que definen la respuesta biológica y en
general, del estudio de cómo el ensamble de moléculas en una superficie es capaz de
desencadenar y controlar diferentes reacciones en la materia viva.
Principio del microscopio de efecto tunel. El efecto de una punta que se aproxima al
objeto produce alteraciones cuánticas detectables.
Imágenes de microscopía de efecto túnel mostrando la red atómica del Grafito
Periódico Altamente Orientado (HOPG). La imagen de la izquierda muestra la
topografía, y la de la derecha es un mapa de fuerza normal. Estas imágenes
fueron tomadas al aire. El tamaño de imagen es 3nm x 3nm. Tomadas por
Dang Xueming, LNM, Departamento de Física de la Materia Condensada, UAM.
Imagen de microscopía de efecto túnel de DNA
Microscopios electrónicos Microscopio de fuerza atómica

El SPM es el nombre general utilizado para los


microscopios que observan superficies con una gran
ampliación, por medio de un "barrido" sobre la
muestra, el cual es realizada con un micro-sensor,
conocido como tip.

El SPM incluye las técnicas de STM (scanning


tunelling microscope) y de AFM (atom force
microscope).
Con el modo STM, un flujo de corriente entre el sensor
y la muestra es detectado como interacción. En el
caso de AFM, se detecta una fuerza.

Un control preciso del barrido es realizado en las tres


direcciones (X, Y e Z), a través de un sistema
piezoeléctrico. Normalmente, el sistema piezoeléctrico
desplaza la muestra en el plan X y Y, utilizando un
método previamente programado, siendo que la
superficie de la muestra es trazada por la distancia del
sensor con relación a la muestra (la cual es mantenida
siempre constante), siendo registrada según la
interacción antes descrita.

La señal generada por el eje Z durante el análisis


corresponde a cada punto de coordenada (ejes X y Y),
alimentando una computadora.

Esta combinación genera una imagen topográfica


(tridimensional) de la superficie de la muestra.
Esquema del microscopio de fuerza atómica. Una punta integrada entra en contacto con el objeto
como un escaner piezoeléctrico (derecha). Un rayo laser es reflejado desde la punta en
mobvimiento y, las deflecciones son detectadas por el detector fotodiodo. Las imágenes
topológicas son integradas mediante control electrónico y computacional.
Microscopios electrónicos Microscopio de fuerza atómica
Flagelos de Vibrio alginolyticus

Estomas de Zelkova

Esmalte de diente corroído por ácido


Microscopios electrónicos Microscopio de fuerza atómica

Pseudomonas

Virus de la vid

Eritrocito
Micrografía de Saccharomyces cerevisiae observada con microscopía de fuerza atómica. Nótese la
Cicatriz que deja la gena al separarse.
Micrografía de los detalles de la superficie de Escherichia coli. La superficie en apariencia rugosa
corresponde al arreglo de los lipopolisacáridos de la membrana externa.
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El primer microscopio
Jorge
Ortigoza

Los primeros microbiólogos


El microscopio simple