Tipos de cromatografía en columna

Existen varios tipos de cromatografía que se realizan en columna,

estructura de vidrio u otro material, generalmente en forma de
tubos rectos. Entre los tipos de cromatografía en columna están
los siguientes:

 Absorción o de columna.
 Partición líquido-líquido.
 Intercambio iónico.
 Exclusión por tamaño.
 Gas.
 Líquida de Alta Resolución (HPLC).
 Afinidad.

Fundamentos y materiales
 Cromatografía en columna en
laboratorio

Cromatografía de adsorción o cromatografía de columna

Esta cromatografía tiene los mismos principios que la
cromatografía en capa fina, basándose en el uso de una fase
estacionaria sólida de naturaleza polar (alúmina o sílice gel), y una
fase móvil constituida por un solvente no polar en estado líquido.

Las sustancias polares presentes en una mezcla de sustancias,

interaccionan con la fase estacionaria polar y son adsorbidas por
esta. Además, tienen poca afinidad por el solvente no polar de la
fase móvil.

Mientras, las sustancias de baja polaridad se separan fácilmente

de su unión con la fase estacionaria debido a su polaridad; lo cual,
les permite interaccionar en mayor grado con la fase móvil no
polar y ser desplazadas por ella.

Cromatografía de partición líquido-líquido

Este término se usa para denominar un tipo de cromatografía en la
cual la fase estacionaria y la fase móvil se encuentran en estado
líquido. La fase estacionaria es un líquido polar que impregna un
soporte sólido, usualmente sílice inerte. Y la fase móvil,
corresponde a un líquido no polar.

Este arreglo de las fases en la cromatografía de partición se

denomina como fase normal, mientras que si el líquido no polar
impregna a la sílice, constituyendo la fase estacionaria, se
denominará entonces cromatografía de partición en fase reversa.

Cromatografía de intercambio iónico

En este tipo de cromatografía la fase estacionaria está cargada
eléctricamente. Cuando su carga es positiva, retiene a los aniones
(-); y si la carga es negativa, a los cationes (+).

Se suelen utilizar como fase estacionaria aminas, ácido sulfónico,

tierra de diatomea, celulosa y sephadex (obtenido del dextrano). A
estos últimos materiales se les adicionan una carga positiva, por
ejemplo, dietilaminoetil (DEAE) para obtener la DEAE-celulosa o el
DEAE-sephadex, para interaccionar así con los aniones.

También se les puede adicionar una carga negativa mediante la

unión del grupo carboximetil (CM), para formar así CM-celulosa o
CM-sephadex, los cuales funcionan como intercambiadores
catiónicos.

Las interacciones electrostáticas existentes en este tipo de

cromatografía se pueden regular mediante modificaciones del pH y
la fuerza iónica del líquido que forma la fase móvil.
A pH neutro o básico, las proteínas suelen estar cargadas
negativamente e interaccionan con la carga positiva de la DEAE-
celulosa y el DEAE-sephadex; pero al disminuir el pH de la fase
móvil, las proteínas pueden volverse positivas y dejar de
interaccionar con la carga positiva de la fase estacionaria.

Usando esta estrategia experimental, se pueden ir separando las

diferentes proteínas presentes en una mezcla.

Asimismo, se utilizan en la cromatografía de intercambio

iónico compuestos inorgánicos tales como los aluminosilicatos
(zeolitas).

Cromatografía de exclusión por tamaño

Este tipo de cromatografía se basa en la existencia de partículas
que presentan en su interior canales, los cuales permiten la
circulación de una sustancia de pequeño tamaño y de
bajo peso molecular a través de ellos. Mientras, las sustancias de
mayor tamaño no pueden atravesar los canales y son excluidas de
ellos.

Aunque parezca extraño, las sustancias de mayor tamaño se

desplazan por la fase móvil con mayor facilidad que las de menor
tamaño, ya que no son retenidas en los canales de las partículas
usadas en la cromatografía. Entre estas partículas están la zeolita
y el sephadex.

El llamado sephadex fue creado por la compañía Pharmacia a

partir del polisacárido dextrano. Existen muchos tipos de sephadex
cuyo uso se selecciona con base al tamaño o peso molecular de las
sustancias que se desean separar.

Cromatografía de gas
En esta cromatografía la fase estacionaria recubre la pared de las
columnas o rellena su interior, mientras la fase móvil la constituye
un gas inerte: nitrógeno o helio. Las columnas de la cromatografía
son de vidrio o de metal; aunque actualmente tienen formas
estrechas de capilares, cuyas paredes están revestidas de sílice.

Las columnas de cromatografía tienen una longitud entre 1 metro

y 100 metros, estando las columnas dentro de un horno capaz de
suministrar temperaturas superiores a 300 ºC. Las sustancias
utilizadas en la cromatografía deben ser volátiles, ya que deben
evaporarse durante la cromatografía.

Las sustancias se evaporan de la superficie de la fase estacionaria

de acuerdo a su punto de ebullición. La evaporación de las
sustancias ocurre en función del incremento de la temperatura del
horno, lo que permite que las sustancias alcancen su punto de
ebullición en forma secuencial.

Una vez alcanzado su punto de ebullición, las sustancias se

evaporan y son arrastradas por la corriente del gas inerte al
sistema de detección y análisis.

La técnica de cromatografía de gases es básicamente analítica y no

preparativa. Es decir, no suele utilizarse para la obtención de una
determinada sustancia.

Cromatografía de alta resolución (HPLC)

Los fundamentos de HPLC son semejantes a los de llamada
cromatografía de columna o de adsorción, pero la diferencia es que
el solvente (fase móvil) pasa a través de la fase estacionaria,
impulsado por una presión de alrededor de 400 atmósferas.

Las columnas de HPLC tienen una longitud comprendida entre 15 y

25 cm, y un diámetro interno de 0.46 cm. Suelen estar hechas de
acero inoxidable. La fase estacionaria la forman partículas muy
pequeñas de sílice que tienen una característica polar.

Fase normal
En la fase normal de HPLC, se suele usar un solvente no polar
como fase móvil, usualmente hexano. Las sustancias polares
interaccionan con el sílice y emergen tardíamente de las columnas
de cromatografía. Mientras, las sustancias no polares tienen mayor
afinidad por los solventes no polares, no interaccionan con las
partículas de sílice y emergen por lo tanto rápidamente de las
columnas.

Fase reversa
En la llamada fase reversa, las partículas polares de sílice son
transformadas en no polares por la adición de una cadena de
hidrocarburos de 8 a 18 carbonos. En la fase móvil, se usa un
solvente polar formado por una mezcla de metanol y agua.

Las sustancias polares no interaccionan con las partículas de sílice

modificadas (no polares) pero sí interaccionan con el solvente
polar, permitiendo que salgan rápidamente de la columna de
cromatografía, siendo llevadas a un sistema de detección con la
presencia de luz ultravioleta.

Cromatografía de afinidad
Esta cromatografía se basa en la interacción de una sustancia en
particular con un ligando para ella, fijado a un soporte que puede
ser agarosa, dextrano, celulosa, etc. La cromatografía de afinidad
es una técnica usada para la separación y purificación de
moléculas con una función biológica.

La técnica de cromatografía de afinidad permite la purificación de

una proteína, usando para ello un anticuerpo específico fijado a un
soporte, el cual constituye la fase estacionaria. El cobre, el cobalto
y el níquel son usados como ligando para obtener proteínas que
contienen el aminoácido histidina.

También se utiliza esta técnica para la purificación de DNA y RNA,

usando como ligando un ácido nucleico con una secuencia de
bases complementaria. La sustancia unida a su ligando puede ser
separada modificando el pH, o la fuerza iónica de la solución que
se usa como fase móvil.
Aplicaciones
La cromatografía en columna es una técnica usada para la
separación de una sustancia de una mezcla de ellas, con diferentes
fines u objetivos. Por ejemplo: el diagnóstico de un problema, la
identificación de fármacos, la obtención de una sustancia, etc.

La cromatografía de adsorción se utiliza en la eliminación de las

impurezas de sustancias, en el aislamiento de metabolitos de
líquidos biológicos, en la determinación en alimentos de ácidos
orgánicos perjudiciales, etc.

La cromatografía líquida de alta resolución es una técnica que

tiene numerosos usos, entre ellos: en la detección de antibióticos,
sedantes, esteroides u otros de interés farmacológicos; en la
identificación de agentes contaminantes como pesticidas,
herbicidas, fenoles, etc.

La cromatografía de gases se usa en el estudio de muchas

sustancias volátiles. Es utilizada en la industria farmacéutica en el
análisis de fármacos, como la aspirina, el ibuprofeno, y el
paracetamol. Además de la identificación en la orina de agentes
dopantes, como anfetaminas, cocaína, LSD, cannabis, etc.

La cromatografía de exclusión por tamaño y la cromatografía de

afinidad son utilizadas principalmente en el aislamiento y
purificación de macromoléculas biológicas, como proteínas y ácidos
nucleicos.

Y finalmente, la cromatografía de intercambio iónico se utiliza en la

purificación de proteínas y polipéptidos.

Referencias
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