High Performance Liquid Chromatography

alta

Cromatografa lquida de

Aplicaciones

CAMPOS DE APLICACIN DE HPLC

FRMACOS: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos
BIOQUMICA: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos
PRODUCTOS DE ALIMENTACIN: Edulcorantes artificiales,
antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
PRODUCTOS DE LA INDUSTRIA QUMICA: Aromticos condensados,
tensoactivos, propulsores, colorantes
CONTAMINANTES: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
QUMICA FORENSE: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos
MEDICINA CLNICA: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos
de orina, estrgenos.
Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa
Separacin y purificacin de metabolitos
Separacin y purificacin de los metabolitos de las drogas
procedentes de muestras de orina
Purificacin y separacin de enantimeros
Purificacin de compuestos naturales
Purificacin y caracterizacin de enzimas y protenas
Funcionamiento del servicio

Las muestras deben ir acompaadas de la hoja de solicitud de

servicios generada en esta pgina web una vez realizado el registro
en la misma. El ususario debe rellenar todos los campos de la
solicitud de servicios que conozca, con el fin de obtener el mejor
resultado posible.

EQUIPOS

Cromatografa

Cromatgrafo de gases

Colector automtico de fracciones y de muestras para la cromatografa

La cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de
mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia. Es
un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo
objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias
sutiles en elcoeficiente de particin de los compuestos da como resultado una
retencin diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separacin
efectiva en funcin de los tiempos de retencin de cada componente de la
mezcla.
La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen
mutuamente:

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y

que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas sntesis).

Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad

analtica). En este caso, las cantidades de material empleadas son
pequeas.
ndice
[ocultar]

1 Historia

2 Clasificacin de los mtodos de separacin en cromatografa

3 Trminos empleados en cromatografa[3]

4 Vase tambin

5 Referencias

6 Enlaces externos
Historia[editar]
El botnico ruso Mijal Tsweet1 (Mikhail Semenovich Tsweet, 1872-1919)
emple por primera vez en 1906 el trmino "cromatografa" (que proviene del
griego y que significan respectivamente chroma "color" y
graphos "escribir").
A comienzos del ao 1903, Mijail Tsweet us columnas de adsorcin de
lquidos para separar pigmentos vegetales (por ejemplo,clorofilas). Las
disoluciones se hacan pasar a travs de una columna de vidrio rellena de
carbonato de calcio, que finamente dividido de un material poroso que
interacciona de forma diferente con los componentes de la mezcla, de forma
que stos se separaban en distintas bandas coloreadas a lo largo de la
columna.
Los primeros equipos de cromatografa de gases aparecieron en el mercado a
mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC) comenz a desarrollarse en los aos 1960, aumentando su
importancia en las dcadas siguientes, hasta convertirse en la tcnica
cromatogrfica ms empleada. Sin embargo esto se ir modificando con el
paso de los aos.
Clasificacin de los mtodos de separacin en cromatografa[editar]

Las distintas tcnicas cromatogrficas2 se pueden dividir segn cmo est

dispuesta la fase estacionaria:

Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa

plana o sobre un papel. Las principales tcnicas son:

Cromatografa en papel

Cromatografa en capa fina

Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una

columna. Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen:

Cromatografa de lquidos

Cromatografa de gases

Cromatografa de fluidos supercrticos

La cromatografa de gases incluye a numerosos compuestos orgnicos. En el

caso de compuestos no voltiles se recurre a procesos denominados de
"derivacin", a fin de convertirlos en otros compuestos que se volatilicen en las
condiciones de anlisis.
Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC, del ingls High Performance Liquid Chromatography), que
es la tcnica cromatogrfica ms empleada en la actualidad, normalmente en
su modalidad de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carcter no
polar, y la fase mvil posee carcter polar (generalmente agua o mezclas con
elevada proporcin de la misma, o de otros disolvente polares, como por
ejemplo metanol). El nombre de "reversa" viene dado porque tradicionalmente
la fase estacionaria estaba compuesta de slice o almina, de carcter polar, y
por tanto la fase mvil era un disolvente orgnico poco polar. Una serie
eluotrpica es un rango de sustancias de diferentes polaridades que actan
como fase mvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una
fase estacionaria.

Separacin de clorofilas mediante cromatografa en papel

Tipos

Fase
mvil

Fase estacionaria

Cromatografa en
papel

Lquido

Papel de celulosa.

Cromatografa en
capa fina

Lquido

Gel de slice o almina.

Cromatografa de
gases

Gas

Columnas capilares de slice fundida, columnas

empacadas con tierras diatomeas hechas de
tubos de vidrio o metal.

Cromatografa
lquida
en fase reversa

Lquido
(polar)

Empaques de siloxano de octilo o siloxano de

octadecilo.

Cromatografa
lquida
en fase normal

Lquido Empaques de slice, almina o un soporte al que

(menos
se unen qumicamente grupos polares (ciano,
polar)
amino, etc).

Cromatografa
lquida
de intercambio
inico

Lquido
(polar)

Resinas de intercambio inico.

Cromatografa
lquida
de exclusin

Lquido

Empaques de pequeas partculas de slice o

polmeros con red de poros uniforme.

Cromatografa
lquida
de adsorcin

Lquido

Partculas finamente divididas de slice o de

almina.

Lquido

Columnas abiertas de slice fundida con

recubrimientos internos de varios tipos de
siloxanos enlazados y de enlaces cruzados.

Cromatografa de
fluidos
supercrticos

Trminos empleados en cromatografa3 [editar]

Analito es la substancia que se va a separar durante la mensografa.

Cromatografa analtica se emplea para determinar la existencia y

posiblemente tambin la concentracin de un analito en una muestra.

Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de

forma covalente a las partculas de soporte o a las paredes internas de la
columa.

Cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso

de separacin ptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se
corresponden a los componentes de la mezcla separada.

En el eje X se representa el tiempo de retencin, y en el eje Y una seal

(obtenida, por ejemplo, a partir de un espectrofotmetro,
un espectrmetro de masas o cualquier otro de los diversos detectores)
correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos
existentes en la muestra. En el caso de un sistema ptimo, la seal es
proporcional a la concentracin del analito especfico separado.

Cromatgrafo es el equipo que permite una separacin sofisticada.

Por ejemplo, un cromatgrafo de gases o un cromatgrafo de
lquidos.

Cromatografa es el mtodo fsico de separacin en el cual los

componentes que se van a separar se distribuyen entre dos fases,
una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras la otra
(la fase mvil) se mueve en una direccin definida.

Eluyente es la fase mvil que atraviesa la columna.

Serie eluotrpica es una lista de disolventes clasificados segn su

poder de dilucin.

Fase inmovilizada es una fase estacionaria que est inmovilizada

sobre partculas de soporte, o en la pared interior del tubo
contenedor o columna.

Cromatograma correspondiente a una cromatografa liquida en fase

reversa para compuestos fenlicos

Fase mvil es la fase que se mueve en una direccin definida.

Puede ser un lquido (cromatografa de lquidos o CEC). un gas
(cromatografa de gases) o un fluido supercrtico (cromatografa de
fluidos supercrticos). La fase mvil consiste en la muestra que est
siendo separada/analizada y el disolvente, que se mueven por el
interior de la columna. En el caso de la cromatografa lquida de alta
resolucin, HPLC, la fase mvil es un disolvente no-polar como
el hexano (fase normal) o bien algn disolvente polar (cromatografa
de fase reversa) y la muestra que va a ser separada.. La fase mvil
se mueve a travs de la columna de cromatografa (fase
estacionaria) de forma que la muestra interacciona con la fase
estacionaria y se separa.

Cromatografa preparativa se usa para purificar suficiente cantidad

de sustancia para un uso posterior, ms que para anlisis.

Tiempo de retencin es el tiempo caracterstico que tarda un

analito particular en pasar a travs del sistema (desde la columna de
entrada hasta el detector) bajo las condiciones fijadas. Vase
tambin: ndice de retencin de Kovats

Muestra es la materia que va a ser analizada en la cromatografa.

Puede consistir en un simple componente o una mezcla de varios.
Cuando la mezcla es tratada en el curso del anlisis, la fase o fases
que contienen los analitos de inters es llamada

igualmente muestra mientras el resto de sustancias cuya separacin

no resulta de inters es llamadaresiduo.

Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser

separado.

Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y

especialmente la fase lquidamvil en cromatografa de lquidos.

Fase estacionaria es la sustancia que est fija en una posicin en

el procedimiento de la cromatografa. Un ejemplo es la capa
de silica en la cromatografa en capa fina.

Vase tambin[editar]

Cromatografa lquida de alta eficacia

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La cromatografa lquida de alta eficacia o high performance liquid
chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografa en columna utilizada
frecuentemente enbioqumica y qumica analtica. Tambin se la denomina a
veces cromatografa lquida de alta presin o cromatografa lquida de alta
resolucin (high pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque esta
terminologa se considera antigua y est en desuso. El HPLC es una tcnica
utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en

diferentes tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la

columna cromatogrfica.
ndice
[ocultar]

1 Principio
o

1.1 Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)

1.2 Tipos de HPLC

1.3 Cromatografa de fase normal

1.4 Cromatografa de fase reversa

1.5 Cromatografa de exclusin molecular

1.6 Cromatografa de intercambio inico

1.7 Cromatografa basada en bioafinidad

1.8 Cromatografa lquida de alta eficacia en condiciones

desnaturalizantes (DHPLC)

2 Parmetros
o

2.1 Dimetro interno

2.2 Medida de las partculas

2.3 Tamao de poro

2.4 Presin del sistema

3 Fabricantes de aparatos de HPLC

4 Fabricantes de columnas de HPLC y accesorios

5 Vase tambin

6 Referencias

7 Enlaces externos
Principio[editar]
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)[editar]
En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a
travs de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas
partculas redondeadas con ciertas caractersticas qumicas en su superficie)
mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta presin a travs de la
columna. La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus
componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones
qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la
columna. El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de
la naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la
fase mvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se
denomina tiempo de retencin y se considera una propiedad identificativa
caracterstica de un compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria.
La utilizacin de presin en este tipo de cromatografas incrementa la velocidad
lineal de los compuestos dentro de la columna y reduce as su difusin dentro
de la columna mejorando la resolucin de la cromatografa. Los disolventes
ms utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener
tampones, sales, o compuestos como el cido trifluoroactico, que ayudan a la
separacin de los compuestos.
Una mejora introducida a la tcnica de HPLC descrita es la variacin en la
composicin de la fase mvil durante el anlisis, conocida como elucin en
gradiente. Un gradiente normal en una cromatografa de fase reversa puede
empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en
25 minutos. El gradiente utilizado vara en funcin de la hidrofobicidad del
compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una
funcin de la afinidad del compuesto por la fase mvil utilizada respecto a la
afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente
agua/acetonitrilo los compuestos ms hidroflicos eluirn a mayor
concentracin de agua, mientras que los compuestos ms hidrofbicos eluirn
a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una
serie de pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita
una buena separacin de los compuestos.
Tipos de HPLC[editar]
Cromatografa de fase normal[editar]
La cromatografa de fase normal o normal phase HPLC (NP-HPLC) fue el
primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se

caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica

utiliza una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el
compuesto de inters es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es
retenido por la fase estacionaria. La fuerza de adsorcin aumenta a medida
que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin entre el compuesto
polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta el
tiempo de retencin.
La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del
compuesto de inters, sino tambin en factores estricos de forma que los
ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La
utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de
retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos
tienden a aumentar el tiempo de retencin.
La NP-HPLC cay en desuso a los aos setenta con el desarrollo del HPLC de
fase reversa o reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de
los tiempos de retencin puesto que los disolventes prticos cambiaban el
estado de hidratacin de la silica o almina de la cromatografa.
Cromatografa de fase reversa[editar]
La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar
y una fase mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms
comunes de este tipo de cromatografa es la silica tratada con RMe 2SiCl, donde
la R es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retencin es
mayor para las molculas de naturaleza apolar, mientras que las molculas de
carcter polar eluyen ms rpidamente.
El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase
mvil y disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofbicos. La
cromatografa de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina
HPLC sin ninguna especificacin adicional. La cromatografa de fase reversa
se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las
fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto
relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la
unin del compuesto a la fase estacionaria es la disminucin del rea del
segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofbico est
dominado por el aumento de la entropa, y la consecuente disminucin de
la energa libre, asociada con la minimizacin de la interfase compuestodisolvente polar. El efecto hidrofbico disminuye con la adicin de disolvente
apolar a la fase mvil. Esto modifica el coeficiente de particin de forma que el
compuesto se mueve por la columna y eluye.

Las caractersticas del compuesto de inters juegan un papel muy importante

en la retencin. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se
asocia con un tiempo de retencin mayor porque aumenta la hidrofobicidad de
la molcula. Aun as, las molculas muy grandes pueden ver reducida la
interaccin entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. El tiempo
de retencin aumenta con el rea de superficie hidrofbica que suele ser
inversamente proporcional al tamao del compuesto. Los compuestos
ramificados suelen eluir ms rpidamente que sus ismeros lineales puesto
que la superficie total se ve reducida.
Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmvil, otras modificaciones de la fase
mvil pueden afectar la retencin del compuesto; por ejemplo, la adicin de
sales inorgnicas provoca un aumento lineal en la tensin superficial, y como
que la entropa de la interfase compuesto-disolvente est controlada
precisamente por la tensin superficial, la adicin de sales tiende a aumentar el
tiempo de retencin.
Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad
del compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos utilizan
un tampn como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH. Estos
tampones controlan el pH, pero tambin neutralizan la carga o cualquiera resto
de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actan como
contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones
sobre la cromatografa puede variar, pero en general mejoran la separacin
cromatogrfica.
Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las
columnas de silica normales. Aun as, muchas columnas de fase reversa estn
formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca
con bases en medio acuoso puesto que stas podran daar el esqueleto de
silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en cidos en medio acuoso
pero no deberan estar expuestas demasiado tiempo al cido porque puede
corroer las partes metlicas del aparato de HPLC.
Cromatografa de exclusin molecular[editar]
La cromatografa de exclusin molecular, tambin conocida como
cromatografa por filtracin en gel, separa las partculas de la muestra en
funcin de su tamao. Generalmente se trata de una cromatografa de baja
resolucin de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de
purificacin. Tambin es muy til para la determinacin de laestructura
terciaria y la estructura cuaternaria de las protenas purificadas.

La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en

columna por el cual las molculas se separan en solucin segn su peso
molecular, o ms precisamente, segn su radio de Stokes.
En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros
entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los fines prcticos,
la columnas se empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas
por esos polmeros entrecruzados. En consecuencia, estas partculas son
porosas, y el tamao de los poros es tal que algunas molculas (las demasiado
grandes) no podrn ingresar a esos poros, en tanto que otras (las
suficientemente pequeas) podrn pasar libremente. Los poros quedan
conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos
a ser recorridos por las molculas que acceden al interior de esta.
Cromatografa de intercambio inico[editar]
Artculo principal: Cromatografa de intercambio inico
En la cromatografa de intercambio inico, la retencin se basa en la atraccin
electrosttica entre los iones en solucin y las cargas inmovilizadas a la fase
estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de
carga opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores
inicos son: i) Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores inicos de celulosa
y dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamao de poro controlado.
En general los intercambiadores inicos favorecen la unin de iones elevada
carga y radio pequeo. Un incremento en la concentracin del contrain
(respecto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retencin.
Un incremento en el pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de
intercambio catinico mientras que una disminucin del pH reduce el tiempo de
retencin en las cromatografas de intercambio aninico. Este tipo de
cromatografa es ampliamente utilizado en las siguientes aplicaciones:
purificacin de agua, concentracin de componentes traza, Ligand-exchange
chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins, High-pH anionexchange chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc.
Cromatografa basada en bioafinidad[editar]
Este tipo de cromatografa se basa en la capacidad de las sustancias
biolgicamente activas de formar complejos estables, especficos y reversibles.
La formacin de estos complejos implica la participacin de fuerzas
moleculares como las interacciones de Van der Waals, interacciones
electrostticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones
hidrofbicas y puentes de hidrgeno entre las partculas de la muestra y la fase
estacionaria.

Cromatografa lquida de alta eficacia en condiciones desnaturalizantes

(DHPLC)[editar]
Se trata de un mtodo que se emplea para el rastreo de mutaciones (ya casi
totalmente en desuso debido al auge de la secuenciacin), que permite
detectar la presencia de variaciones en el ADN aunque no se determinan
especficamente cules. En este caso, se utiliza la tcnica cromatogrfica para
la deteccin de heterodplex de ADN, en lugar de utilizar un gel para correr las
molculas de cidos nucleicos.
El procedimiento consiste en desnaturalizar (aumentando la temperatura
normalmente) una muestra que contenga tanto el ADN problema como un ADN
control, que no es ms que el mismo ADN problema pero en su versin
silvestre o normal (sin mutaciones). Luego se procede a renaturalizar
(disminuyendo la temperatura), de manera que aquellas cadenas de ADN que
vuelvan a unirse con sus respectivas complementarias (cadena "a" silvestre
con cadena "b" silvestre; o bien cadena "a" mutante con cadena "b" mutante)
no presentarn diferencia con el estado original; sin embargo, si por ejemplo
una cadena "a" silvestre hbrida con una cadena "b" mutante, aquella regin
(ms o menos amplia) en la que exista mutacin no complementar,
formndose un bucle u horquilla, es decir, una regin en la que las bases
nitrogenadas no son complementarias y no establecen las uniones
caractersticas por puentes de hidrgeno en la doble hlice de ADN. Dichas
estructuras son los denominados heterodplex (dplex de ADN hbridos). Estos
heterodplex migran de forma diferente a los homodplex en la columna de
cromatografa de fase reversa(al igual que lo hacen en un gel de agarosa o
acrilamida). La separacin se realiza en condiciones desnaturalizantes
variables, detectndose las molculas de ADN midiendo la absorbancia a 260
nm. Esto origina un pico de elucin a un tiempo caracterstico. A medida que se
incrementan las condiciones desnaturalizantes los heterodplex migran por
delante de los homodplex, apareciendo los picos correspondientes a
heterodplex antes en el grfico resultante, el cromatograma. De esta manera,
como los heterodplex se desnaturalizan a temperaturas distintas a los
homodplex, ambas molculas dan lugar a picos de elucin distintos.
Previo al proceso inicial de desnaturalizacin se suele llevar a cabo una PCR
para la amplificacin del ADN molde en fragmentos de unas 150-450 pb.
Con este sistema pueden detectarse fcilmente sustituciones de una base,
inserciones o deleciones, con un coste reducido y de manera rpida
(aproximadamente 16 minutos).1
Parmetros[editar]

Dimetro interno[editar]
El dimetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crtico que
determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y tambin
influye en su sensibilidad. Las columnas de dimetro interno ms grande
(>10mm) se utilizan normalmente en la purificacin de compuestos para su
utilizacin posterior. En cambio, las columnas de dimetro interno menor (45 mm) se utilizan en el anlisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan
por el aumento la sensibilidad y la minimizacin del consumo de disolventes
que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango
analtico y normalmente estn asociadas a un detector UV-VIS. Aparte, existen
otros tipos de columnas, como las de tipo capilar, con un dimetro inferior a
0.3 mm, utilizadas principalmente en espectrometra de masas.
Medida de las partculas[editar]
La mayora de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida
al exterior de partculas esfricas de silica. Estas partculas pueden tener
diferentes medidas, siendo las de 5\mum de dimetro las ms utilizadas.
Partculas ms pequeas ofrecen una mayor superficie y una mejor separacin,
pero la presin que se requiere por obtener una velocidad lineal ptima
aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del dimetro de la
partcula. Esto significa que disminuir la medida de las partculas a la mitad,
aumentara la resolucin de la columna, pero a la vez, aumentara la presin
necesaria en un factor de ocho.
Tamao de poro[editar]
Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor
superficie. Los poros pequeos proporcionan una mayor superficie mientras
que los poros de mayor medida proporcionan una cintica mejor,
especialmente para los compuestos de tamao ms grande; por ejemplo, una
protena que sea ligeramente ms pequea que el tamao de los poros puede
entrar, pero difcilmente saldr con facilidad.
Presin del sistema[editar]
La presin de las bombas es variable segn el modelo y fabricante, pero su
rendimiento se mide en su habilidad para generar un flujo constante y
reproducible. La presinpuede lograr valores de hasta 40 MPa (o unas 400
atmsferas). Los aparatos ms modernos de HPLC incorporan mejoras para
poder trabajar a presiones ms altas y, por lo tanto, poder utilizar partculas de
tamao ms pequeo en las columnas (< 2 micrmetros). Estos nuevos
aparatos, denominados ultra performance liquid chromatography(UPLC)
pueden trabajar con valores de hasta 100 MPa de presin (unas 1000

atmsferas). (Hay que tener en cuenta que las siglas UPLC son una marca
registrada de Waters Corporation aunque a veces se utilizan de forma general
para designar este tipo de aparatos).

Cromatgrafo de lquidos de alta resolucin (HPLC) La cromatografa de

lquidos de alta resolucin (HPLC) es un proceso analtico que utiliza un
instrumento especialmente diseado para separar, cuantificar y analizar los
componentes de una mezcla qumica. La muestra de inters se hace pasar
mediante un flujo de disolvente hasta una columna rellena del material especial
para llevar a cabo la separacin de los componentes, posteriormente dichos
componentes pasan a un sistema de deteccin acoplado con un sistema de
grabacin de datos. Los componentes bsicos del sistema HPLC incluyen:
contenedor de disolventes, inyector automtico, bomba cuaternaria, columna
analtica, detector/es y el registrador de datos. Los detectores de los que se
dispone son 2: (a) detector ultravioleta-visible de longitud de onda variable y (b)
detector LSD (evaporative light-scattering detector). Posee un ordenador donde
se incluye el programa Chemstation para controlar tanto los instrumentos como
los datos obtenidos.

Cromatografa lquida de alta presin (HPLC)

Aplicacin
Separacin, identificacin, purificacin y cuantificacin de una gran variedad de compuestos
qumicos.

Descripcin

La cromatografa lquida de alta presin es una tcnica de separacin basada en la distinta

retencin de los componentes de una muestra disueltos en la fase mvil al pasar por la fase
estacionaria. Se caracteriza por la elevada presin de operacin necesaria para conseguir una
velocidad ptima de la fase mvil. La interaccin entre el soluto de la fase mvil y la fase
estacionaria puede ser modificada eligiendo diferentes disolventes y fases estacionarias, siendo
en consecuencia una tcnica de gran versatilidad.

Modelos disponibles
Jasco HPLC Model HSS-900.

Aplicaciones en el campo de la industria papelera

Determinacin de cidos resnicos en efluentes de industrias papeleras.

Determinacin de almidones en papel.

Ms informacin

Birosel-Boettcher, N. Measurement of starch in paper by high-pressure liquid

chromatography, TAPPI JOURNAL, Vol. 76(3), 1993.

Braithwaite, A; Smith, F.J. Chromatographic methods, Kluwer Academic Publishers,

Dordrecht, pp 258-365, 1999.

Chow, S.Z; Shepard, D. High performance liquid chromatographic determination of resin

acids in pulp mill effluent, TAPPI JOURNAL, Vol. 79(10), 1996.

Poole, C.F; Poole, S.K. Chromatography today Elsevier, New York, pp 545-595, 1991.

seccypiq@quim.ucm.es
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High Performance Liquid Chromatography

alta

Cromatografa lquida de

Cromatografa lquida
La Cromatografa lquida, tambin conocida como Cromatografa de
lquidos, es una tcnica de separacin y no debe confundirse con una tcnica
cuantitativa o cualitativa de anlisis. Es una de las tcnicas analticas
ampliamente utilizadas, la cual permite separar fsicamente los distintos
componentes de una solucin por la adsorcin selectiva de los constituyentes
de una mezcla. En toda cromatografa existe un contacto entre dos fases, una
fija que suele llamarse fase estacionaria, y una mvil (fase mvil) que fluye
permanente durante el anlisis, y que en este caso es un lquido o mezcla de
varios lquidos. La fase estacionaria por su parte puede
ser almina, slice o resinas de intercambio inico que se encuentran
disponibles en el mercado. Los intercambiadores inicos son matrices slidas
que contienen sitios activos (tambin llamados grupos ionognicos) con carga
electrosttica (positiva o negativa). De esta forma, la muestra queda retenida
sobre el soporte slido por afinidad electrosttica. Dependiendo de la relacin
carga/tamao unos constituyentes de la mezcla sern retenidos con mayor
fuerza sobre el soporte slido que otros, es decir sern adsorbidos, lo que
provocar su separacin. Las sustancias que permanecen ms tiempo libres en
la fase senil, avanzan ms rpidamente con el fluir de la misma y las que
quedan ms unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por
tanto tardarn ms en salir o fluir. ste es el principio fundamental de la
cromatografa. Un ejemplo notable es la cromatografa de intercambio inico.
Las columnas ms utilizadas son las de slice.
== Mtodos de cromatografa lquida ==

Mtodo

Abreviat
Mecanismo predominante
ura

Lquido, slido o
de adsorcin

LSC

Adsorcin sobre la superficie

Lquido

LLC

Reparto entre fases lquidas, una mvil

y la otra estacionaria.

Fase enlazada

BPC

Reparto y / o adsorcin entre las fases

mvil y enlazada.

Afinidad

--

Uso de la estructura de ligantes

inmovilizados para unir

bioselectivamente la protena deseada.
Seleccin de un mtodo de cromatografa lquida[editar]
El conocimiento de la estructura molecular de los componentes de la muestra
puede ser muy til en la seleccin de un mtodo de cromatografa lquida. Una
gua muy general para la seleccin de un mtodo se da a continuacin.
La cromatografa de absorcin opera mejor en la separacin por clases de
compuestos o para la separacin de compuestos isomricos. La tcnica de
cromatografa lquido lquido es mejor para la separacin de homlogos. Los
grupos funcionales que son capaces de formar enlaces de hidrgeno fuertes se
retienen mucho en cromatografa de adsorcin, sin embargo la CLL(Lquido
lquido) proporciona una alternativa para la separacin de estos compuestos,
estas sern las muestras que tienen polaridad media.

3.3 APLICACIONES AL ANLISIS DE LOS ALIMENTOS

La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias ogrupos de sustancias en
un tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente.Como condicin, es imprescindible que la
muestra sea soluble en un disolvente al ser lafase mvil un lquido.Es la tcnica analtica de separacn
ms ampliamente utilizada debido a suscualidades de sensibilidad, su fcil adaptacin a las
determinaciones cuantitativasexactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o
termolbiles y sugran adaptabilidad a sustancias que son de gran inters para la industria, la ciencia y
lasociedad.El empleo de HPLC en sus muchas variantes se ha especializado mucho.Algunas
aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como aminocidos, protenas,cidos nuclicos,
hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenos, plagucidas,antibiticos, esteroides,
especies organometlicas y una gran variedad de sustanciasinorgnicas.Ejemplos de utilizacin de
HPLC:-Deteccin y cuantificacin de sacarina, benzoatos, cafena y aspartameen refrescos.-Deteccin
de ciclomato en jugos de fruta.-Separacin de steres de cidos grasos por fase inversa y
conargentizacin de columnas (Silicato de Al con Ag).-Separacin de Triglicridos por
la longitud de la cadena y el grado deinsaturacin por fase inversa y detector de dispersin
luminosa, para el estudio deaceites y grasas adulteradas.-Determinacin del contenido de Vit A y sus
precursores (y caroteno)en margarina y aceites de hgado por fase inversa.-Determinacin del
contenido en Vit D en leche en polvo y cereales por fase normal.