Laboratorio: Producción de alginato a partir de Azotobacter vinelandii en medio
sumergido a nivel matraz
OBJETIVO
 Familiarizar a los estudiantes con la técnica de fermentación en lote en medio sumergido para la generación de
procesos biotecnológicos
 Determinar el rendimiento en la producción de alginato y biomasa a partir de glucosa usando Azotobacter vinelandii
INTRODUCCIÓN
Estequiometria del crecimiento celular y generación del
producto
El crecimiento de celular con generación de producto es
una reacción que consume una fuente de carbono, una
fuente de nitrógeno y si es aerobia oxígeno gaseoso; y
como toda reacción se deben cumplir los balances de
materia y energía.
En términos generales se tiene la reacción
, cuando la fuente principal de carbono tiene nitrógeno y
la fuente principal de nitrógeno no presenta carbono.
La anterior ecuación puede sufrir modificaciones
dependiendo de las fuentes de carbono y nitrógeno
empleadas, así como del tipo de célula usada, el
producto generado y si la fermentación es anaerobia o
aerobia. Lo que si no cambia es el hecho que cuando hay
crecimiento celular siempre se produce dióxido de
carbono y agua.
Por ejemplo, cuando se emplea glucosa, el primer
término de la ecuación es C 6H12O6, y si se emplea una
fuente de nitrógeno inorgánica como es el amoniaco, el
término acompañando el coeficiente b es NH 3. Cuando
se hace la fermentación con bacterias se puede emplear
la formula molecular promedio CH1.79O0.50N0.20
acompañando al coeficiente estequiométrico c.
Muchas veces balancear teóricamente la ecuación de
crecimiento celular no es posible, ya que no se conocen
las formulas moleculares aproximadas para las fuentes
de nitrógeno o carbono cuando se emplean hidrolizados
de proteínas, al igual que muchas veces tampoco se
pueden conocer las formulas moleculares de la biomasa
producida, por lo que se hace necesario a nivel
experimental definir los coeficientes estequiométricos a,
b, c, d y f. Pero vale la pena recordar que esos
coeficientes molares en la ecuación de crecimiento
celular y generación de producto están planteados en
base a un mol de fuente de carbono (sustrato principal), y
si no se conocen los pesos moleculares de los
compuestos de la ecuación no es posible balancearla.
Es así que para evitar el problema de no tener una
ecuación balanceada estequiométricamente y poder
observar el comportamiento de una fermentación se
emplean las relaciones estequiométricas no en base
molar sino en base masa, las cuales si son medibles
experimentalmente, llamándoles a esas relaciones
rendimientos.
Por ejemplo Yx/s significa rendimiento de sustrato en
biomasa y corresponde a la relación biomasa producida
en gramos sobre sustrato consumido en gramos (el
sustrato en este caso es la fuente principal de carbono).
Igualmente puede existir Yp/s, Yx/O2, Yp/x, Yx/N (donde N
es la fuente principal de nitrógeno), etc.
De acuerdo a lo anterior, desde el punto de vista
experimental, reportar los rendimientos es lo más
empleado cuando se realizan fermentaciones, pues evita
tener que trabajar con una ecuación estequiométrica de
la cual no se conoce mucha información.
El género Azotobacter
Figura 1: Ruta metabólica tentativa de producción de alginato y PHB a partir de sacarosa o glicerol. Tomado
de Yoneyama et al, 2015.
Azotobacter sp. es una bacteria Gram negativa, la cual
es aerobia y fija nitrógeno atmosférico. Azotobacter está
presenta en diferentes ambientes, tales como suelo,
agua y sedimentos, presentando una amplia diversidad
metabólica, por lo que es capaz de emplear diferentes
sustratos y producir diferentes metabolitos.
Azotobacter vinelandii ATCC® 12518 durante su
crecimiento y cuando presenta deficiencia de algún
nutriente sea este fosfato, oxígeno o nitrógeno forma
estructuras conocidas como quistes, los cuales consisten
en células vegetativas rodeadas de una cápsula babosa
de polisacárido, en este caso alginato.
La ruta metabólica de producción del polisacário alginato
está asociada también a la producción del poliéster
biodegradable conocido como polihidroxibutirato (PHB),
en donde se puede partir de diversos sustratos como los
son sacarosa, glucosa, fructosa o glicerol (ver figura 1).
Los factores que influyen en la producción ya sea de
alginato y/o PHB son la tasa de consumo de oxígeno,
tipo y concentración de sustrato como fuente de carbono,
fuente de nitrógeno orgánica o inorgánica y su
concentración, concentración de microelementos y Erlenmeyers de 500
10
macroelementos, pH del medio de cultivo, temperatura ml
de incubación y agitación (la cual se asocia Erlenmeyers de 25
9
principalmente a la transferencia de oxígeno). ml
Glucosa 40g
Extracto de levadura 3g
MgSO4.7H2O 0.4 g
NaCl 0.4 g
Alginato KH2PO4 0.16 g
K2HPO4 0.64 g
El alginato es un polisacárido producido por varios tipos CaCl2.2H2O 84 mg
de seres vivos, especialmente algas marrones y NaMoO4.2H2O 2 mg
bacterias del género Azotobacter. El alginato ha sido FeSO4.7H2O 6 mg
empleado en la industria biotecnólogica como agente H3BO4 2.9 mg
CoCl2 1.2 mg
viscosante, gelificante y estabilizador coloidal. El
CuSO4.5H2O 0.1 mg
alginate al ser biocompatible también tiene la capacidad
MnCl2. 4H2O 0.09 mg
de ser usado como una matriz para atrapar y/o dispensar ZnSO4. 7H2O 1.2 mg
una variaedad de moléculas y/o partículas sin importar NaOH o HCl entre
que sea resistente a la biodegradabilidad. .El alginato es 20 ml
0.2 M y 1 M
un copolímero lineal compuesto de dos unidades EDTANa2 0.5M 60 ml
monoméricas, una primera con uniones β-1-4 de D- ácido NaCl 5 M 30 ml
manurónico (ManA) y una segunda con uniones α-1-4 de Puntas estériles 1 ml 20
L-ácido gulurónico (GulA). La composición química y Puntas estériles
20
0.2ml
secuencia de los monómero M y G depende del ser vivo
Probetas 100 ml 10
que produce el alginato (ver figura 2) Reactivo DNS 10 ml
Reactivo Biuret 10 ml
Figura 2. Estucura del aginato producido por el alga Isopropanol frio 500 ml
marrón Laminaria digitaria. Tomado de Belalia y Djelali, Tubos de ensayo
50
2014. para biuret y DNS
Recipientes para
10
viscosimetria
Espectrofotómetro 1
Viscosímetro 1

PROCEDIMIENTO

MATERIALES Y REACTIVOS Inicialmente se activa la cepa de Azotobacter vinelandii

ATCC® 12518 en medio Ashby suplementado con agar y
Cantidad se incuba durante 48 horas a 30°C. La fermentación se
para 9 realiza en un erlenmeyer de 500 ml con 100 ml de medio
Material y/o Reactivo parejas de
de cultivo o en un erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de
laboratorio
y el blanco medio de cultivo. La composición de dicho medio por litro
Tubos de centrifuga de agua desionizada es: glucosa 40 g; extracto de
50 levadura 3.0 g; MgSO4.7H2O, 0.4 g; NaCl, 0.4 g;
de 15 ml
Tubos de centrifuga KH2PO4, 0.16 g; K2HPO4, 0,64 g; CaCl2.2H2O, 84 mg;
20
de 50 ml NaMoO4.2H2O, 2 mg; FeSO4.7H2O, 6 mg; H3BO4, 2.9 mg;
CoCl2, 1.2 mg; CuSO4.5H2O, 0.1 mg; MnCl2. 4H2O, 0.09
mg; ZnSO4. 7H2O, 1.2 mg.
Debido a que la glucosa es un azúcar reductor y se va a
emplear en alta concentración se requiere esterilizar por
separado para evitar su caramelización con sales y
previo a la inoculación se adiciona en el medio de cultivo.
Igualmente la presencia de hierro y fosfatos hace que se
precipiten ciertas sales en la esterilización por lo que se
recomienda preparar la solución de microelementos
concentrada por separado de la solución de
macroelementos.
Para preparar 10 erlenmeyers de 100 ml de medio de
cultivo cada uno se recomienda:
Prepara inicialmente 100 ml de una solución de glucosa
40% p/v (pesar la glucosa y adicionar poco a poco en 60
ml de agua, manteniendo agitación. Cuando se tenga
disuelta la glucosa aforar a 100 ml). En tubos tapa rosca
dispensar 10 ml de esta solución de glucosa.
Preparar 50 ml de una solución de microelementos 10X,
la cual se prepara pesando CaCl2.2H2O, 84 mg;
NaMoO4.2H2O, 2 mg; FeSO4.7H2O, 6 mg; H3BO4, 2.9 mg;
CoCl2, 1.2 mg; CuSO4.5H2O, 0.1 mg; MnCl2. 4H2O, 0.09
mg; ZnSO4. 7H2O, 1.2 mg. (disolver inicialmente en 30 ml
de agua destilada y luego aforar a 50 ml). En tubos tapa
rosca dispensar 5 ml de esta solución de
microelementos.
Preparar por separado las 10 soluciones de
macroelementos y fuente de nitrógeno (85 ml cada una),
la cual se obtiene pesando para cada solución:extracto
de levadura 0.3 g; MgSO4.7H2O, 0.04 g; NaCl, 0.04 g;
KH2PO4, 0.016 g; K2HPO4, 0,064 g; disolviendo en 75 ml
de agua destilada, ajustando el pH a 7.2 con NaOH o HCl
entre 0.2 M y 1 M y aforando a 85 ml. (También se
pueden preparar los 850 ml y distribuir en 10
erlenmeyers).
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos todas las
soluciones preparadas.
Tomar con el asa microbiológica dos porciones de
bacterias crecidas en el medio Ashby y resuspender en
los medios de cultivo presentes durante 36-48 h a 30°C
y 150 rpm.
NOTA: Se debe dejar mínimo 100 ml de medio de cultivo
sin inocular como blanco de la fermentación, al cual se le
determina la viscosidad, azúcares reductores y proteína.
Luego de terminada la fermentación, tomar 10 ml del
caldo de cultivo y centrifugar a 4000 rpm durante 10
minutos, a los 90 ml de caldo de cultivo restante
adicionar 4 ml de Na-EDTA, 0.5 M y 2 ml de NaCl 5, M, y
agitar por 5 minutos de forma continua.
Al sobrenadante de esos 10 ml inicialmente centrifugados
determinarle azúcares reductores por el método DNS y
concentración de proteína por él método de Biuret. No
olvidar hacer el ensayo de DNS y Biuret con medio de
cultivo sin inocular y tener blancos para medición. Se
emplearan las curvas de calibración realizadas en
prácticas de laboratorio previas.
Centrifugar 50 ml a 4000 rpm durante 30 minutos. Tomar
10 ml de dicho sobrenadante y enfriarlos durante 20
minutos a -4°C. A los 40 ml de sobrenadante restante
determinarle la viscosidad, empleando el viscosímetro
Brookfield RVDVI+. (Ver anexo para generalidades en el
uso del viscosímetro).
Al pellet de la centrifugación de 50 ml, resuspenderlo en
10 ml de agua destilada estéril y centrifugar de nuevo en
tubo de 15 ml previamente pesado, así dos veces a 4000
rpm durante 10 minutos, botando siempre el
sobrenadante. Por último retirar sobrenadante y dejar
secando en horno a 80°C durante 48 horas.
Al sobrenadante previamente enfriado, adicionar 30 ml
de isopropanol frio y centrifugar a 4000 rpm durante 30
minutos. Desechar sobrenadante y adicionar 3 ml de
agua. Transferir a tubo de centrifuga previamente pesado
de 15 ml y adicionar de 9 ml de isopropanol frio.
Centrifugar de nuevo a 4000 rpm durante 30 minutos. Por
último retirar sobrenadante y dejar secando en horno a
80°C durante 48 horas.

Con los datos de peso seco de biomasa, peso seco de
alginato, concentración de glucosa y concentración de
proteína determinar los rendimientos Yx/s, Yx/ N, Yp/s,
Yp/N.
Bibliografía
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Yoneyama F., Yamamoto M., Hashimoto W. y Murata K.
Production of polyhydroxybutyrate and alginate from
glycerol by Azotobacter vinelandii under nitrogen-free
conditions. Bioengineered, 2015, 6(4).
Anexo
Generalidades del uso del viscosímetro Brookfield
RVDVI+.
Primero asegurarse que el motor/cabezote de control
está bien asegurado al soporte y a la altura necesaria, al
igual que el soporte se encuentra en una superficie
plana.
No se va a realizar calibración del equipo ya que tiene
almacenada una calibración previa.
En el display va a aparecer la viscosidad dinámica en
centipoises (cP) cuando se hace la medición. Si el % de
torque esta entre 10% y 100% se considera que se está
utilizando el spindle (eje con disco) adecuado y la
velocidad (rpm) de giro adecuada para la medición de la
viscosidad.
La viscosidad del agua pura a 20°C es 1 cP.
Para empezar se enciende el viscosímetro con el switch
de la parte trasera y aparece en el display un mensaje
indicando la marca del viscosímetro. (siempre se debe
hacer este procedimiento de autozero cada vez que se
enciende el equipo).
Se debe esperar para que aparezca el mensaje de
remover el spindle y presionar cualquier tecla. Cuando se
remueva el spindle (eje con disco) oprimir cualquier tecla
y esperar a que termine de parpadear el mensaje de
remover spindle y presionar cualquier tecla, se debe
presionar cualquier tecla (lo anterior después de
aproximadamente 15 segundos). Luego de presionar
cualquier tecla aparece el letrero mostrando cP, % , rpm
y número del spindle. Aquí finaliza el procedimiento de
autozero del equipo.
Hay 7 spindles disponibles y él número del spindle
aparece en la parte externa de la rosca. Se debe escoger
el spindle a usar dependiendo de la viscosidad esperada
de la solución. Igualmente dependiendo del splinde
usado asimismo se puede usar un recipiente diferente y
por lo tanto una cantidad de muestra diferente.
Con el motor encendido o apagado (oprimiendo tecla
“Motor On/Off” se puede ajustar la velocidad o el spindle.
Se recomienda con el motor apagado, mientras se
aprende como usar el equipo.
 Si se emplea el cilindro macizo como spindle (para bajas
Oprimiendo la tecla “select spindle” permite habilitar la viscosidades) se escoge en el display el 00, y por
selección del número del spindle instalado con las teclas defecto la velocidad 60 rpm.
“up” and “down”. Se tiene 3 segundos para volver a
presionar “select spindle” mientras titilea el display para Un fluido se considera newtoniano cuando a diferentes
poder guardar en la memoria el spindle escogido. rpm se aprecia un mismo valor de viscosidad y no-
newtoniano cuando a diferentes rpm se aprecia un
Para definir la velocidad se oprime la tecla “up” o diferente valor de viscosidad.
“down”.Hay 18 opciones de velocidad, las cuales están
agrupadas en dos. Hay un grupo que comienza en 0.0 y
termina en 60.0. Hay otro grupo que comienza en 0.0 y
termina en 100.0. Después de seleccionar la velocidad se
debe oprimir la tecla “set speed” para que se emplee esa
velocidad. Tiene dos segundos mientras titilea el display
después de soltar la tecla “up” o “down” para oprimir “set
speed”.

Encender el motor con la tecla “Motor On/Off”, si se está

entre un torque de 10% a 100% el display muestra una
viscosidad, pero si está el torque por encima por debajo
de esos valores muestra símbolos como ? o EEEE, por
lo que se debe cambiar la agitación o el spindle.

Con el motor encendido se puede presionar la tecla

“Autorange” y eso permite ver a las condiciones de
velocidad con el spindle seleccionado cuanto es lo
máximo de viscosidad que se puede medir. Con el motor
apagado muestra valores de 0.0.

Si ya se tiene algo de destreza manejando el equipo y el

torque no es el correcto se puede con el motor encendido
hacer los cambios de velocidad de giro del spindle.

Entre más grande sea el diámetro del disco del spindle

menor la viscosidad que puede medir.

Para agua se usaría el spindle número 1, aunque por su

baja viscosidad puede que no se tenga una buena lectura
con el viscosímetro, lo mínimo recomendado para
buenas lecturas de viscosidad con el spindle 1 son 100
cP.

Existen adaptadores que permiten medir viscosidades

bajas. De hasta 0.3 cP.