OPTIMIZACIÓN DE LA RELACIÓN CARBONO/NITROGENO PARA LA

ACUMULACIÓN DE PHA A PARTIR DE ALMIDÓN HIDROLIZADO

OPTIMIZATION OF THE CARBON/NITROGEN RELATIONSHIP FOR

ACCUMULATION OF PHA FROM HIDROLYSATE STARCH
JOSÉ LUIS HOYOS C., ELIZABETH ROJAS F., KATHERIN RUIZ M., ROCÍO
ELEJALDE U., HECTOR SAMUEL VILLADA C.

RESUMEN
En la presente investigación se estudió la producción de polihidroxialcanoatos (PHA) mediante
fermentación bacteriana de glucosa obtenida de un medio convencional empleando Ralstonia
eutropha, la cual se activó y conservó en medio Tripticasa soya (TSB). La fermentación se realizó
empleando cinco relaciones carbono/nitrógeno diferentes (12, 16 20, 24, 28) y arrojó como
resultado que con la relación carbono/nitrógeno 20 se alcanza una producción de 0,69 g/L de
PHA, por lo tanto esta relación es la que más favorece a la acumulación intracelular de
biopolímero.
PALABRAS CLAVES: Fermentación, glucosa
ABSTRACT
In this investigation polyhydroalkanoate (PHA) production was studied by bacterial fermentation
of glucose obtained of conventional medium using Ralstonia eutropha, which was activated and
kept in trypticase soy medium (TSB). The fermentation was carried out using five different
relations carbon / nitrogen (12, 16, 20, 24, and 28) and results showed that using the carbon /
nitrogen ratio 20 achieved production of 0.69 g / L of PHA, so this ratio is most conducive to the
intracellular accumulation of biopolymer.
KEY WORDS: Fermentation, glucose

1. INTRODUCCIÓN
Entre los plásticos biodegradables más estudiados actualmente, se encuentran los
polihidroxialcanoatos (PHAs), dentro de los cuales el más común es el polihidroxibutirato PHB
Universidad del Cauca, Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Agroindustria, Popayán Colombia,
jlhoyos@unicauca.edu.co
Universidad del Cauca, Facultad de Ciencias Agrarias, Popayán Colombia. elirojas@unicauca.edu.co
Universidad del Cauca, Facultad de Ciencias Agrarias, Popayán Colombia. lkruiz@unicauca.edu.co
Universidad del Cauca, Facultad de Ciencias Agrarias, Popayán Colombia. rochielejalde@hotmail.com
(Naranjo, 2010), los cuales fueron descubiertos y detectados en el Bacillus megaterium por
primera vez en 1925, en el instituto Pasteur por el microbiólogo. La Ralstonia eutropha es una de
las bacterias más utilizadas en la producción de polihidroxialcanoatos (PHA) debido a que es
capaz de almacenar hasta un 96% de este material en peso seco, usando fuentes renovables de las
que puede obtener carbono o energía, entre ellas la fructosa y la glucosa provenientes de
diferentes productos agroindustriales (Betancur, 2011).
Alrededor del mundo muchos investigadores se han dado a la tarea de indagar sobre nuevas
formas de producir plásticos biodegradables y uno de los mayores retos es la búsqueda de
sustratos accesibles y asequibles que puedan ser aprovechados por el microorganismo
(Malincolico, 2013). Por lo tanto en este trabajo se evaluaron cinco relaciones carbono/nitrógeno
(12, 16, 20, 24 y 28) para la acumulación de PHA empleando almidón hidrolizado como fuente
de carbono.
2. MATERIALES Y MÉTODOS:
2.1 Activación de la bacteria. Para la activación del microorganismo se empleó el medio de
cultivo Tripticasa soya, basándose en la metodología descrita por Betancur, 2011. Primero en
medio líquido y después en medio sólido en periodos de incubación de 48 h a 32 °C.
2.2 Fermentación
Se realizó un diseño experimental de bloques completamente al azar, donde el factor a evaluar
fue las relaciónes 12, 16, 20, 24 y 28 Carbono/Nitrógeno. Se realizó una fermentación en batch
con un volumen de 400 mL por cada relación, utilizando un shaker Thermo SCIENTIFIC MAXQ
4450, que permitió mantener el control sobre la temperatura y la agitación. El medio mineral
mínimo de sales (MSM) estandarizado para el microorganismo está compuesto por:
Na2HPO4.7H2O, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7 H2O, Citrato de Hierro y Amonio, CaCl2.2H2O
y 1 mL de elementos traza (H3BO3, CoCl2.6H20, ZnSO4.7H2O, MnCl2.4H2O, NaMoO4.2H2O,
NiCl2.6H2O, CuSO4.5H2O) (Betancur, 2011), y una variación en la relación carbono/nitrógeno.
Este proceso se llevó a cabo utilizando jarabe de glucosa obtenido del proceso de hidrólisis del
almidón de yuca variedad Cumbre 3, como fuente de carbono para el microorganismo
Durante las 36 horas de fermentación se llevó a cabo la toma de muestras para determinar
consumo de sustrato mediante la técnica del Ácido Dinitrosalicílico (DNS) y microscopia óptica
de alta resolución (MOAR), para determinar la formación intracelular del biopolímero.
Para el consumo de sustrato mediante DNS se aplicó el protocolo de determinación de azúcares
reductores mediante DNS las cuales fueron leídas en un espectrofotómetro SHIMADZU UV-
1800. La prueba de microscopia óptica de alta resolución se realizó en un microscopio NIKON
MICROPHOT, Japón, adaptado al software Image Pro Analizer ®, con una resolución máxima
de 100X para observar la acumulación del biopolímero, se tomó una pequeña muestra del medio
MSM obtenido al final del proceso de fermentación y se realizó una tinción Negro sudan (Zazali
y Irene, 2004).
2.3 Extracción del polihidroxialcanoato
Una vez terminada la fase de fermentación, las bacterias fueron inactivadas y se realizó una
extracción del polímero acumulado con ácido sulfúrico 0.1 M y se neutralizó con NaOH 5N. El
biopolímero obtenido fue decolorado con hipoclorito al 3% por 3 horas.
3. RESULTADOS
3.1 Activación de la bacteria. Transcurrido el tiempo de incubación, se evidencio que el mayor
desarrollo de la bacteria se manifestaba en el medio TSB a partir del cual se generó el banco de
trabajo.
3.2 Fermentación bacteriana utilizando Ralstonia eutropha
Para la formación intracelular del biopolímero en la bacteria se estableció una limitación
nutricional. Luego de 20 h de fermentación, la bacteria inicia la fase estacionaria donde empieza
a consumir la fuente de carbono con el fin de sobrevivir y generar reservas en su organismo
(PHA). La prueba de microscopia óptica de alta resolución muestra la formación intracelular de
PHA a partir de las 18 h en las bacterias mediante tinción con negro sudan (figura 1).
Figura 1. Consumo de sustrato y formación intracelular del biopolímero en medio MSM con
diferentes relaciones Carbono/Nitrógeno
15
Glucosa g/L

R C/N 12
10
R C/N 16
05
R C/N 20
00
R C/N 24
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
Tiempo (h) R C/N 28

3.3 Extracción del polihidroxialcanoato

Arrojó como resultado que la mejor relación carbono/nitrógeno fue de 20 al alcanzar una
producción de 0,69 g/L, por lo tanto para la producción de PHA, se empleó la relación
carbono/nitrógeno de 20 con un 1% de glucosa. En el momento de decolorar el
polihidroxialcanoato, se observó una disminución en el porcentaje de rendimiento, posiblemente
por efectos de solubilidad que puede generar el hipoclorito (Zhenggui, 2011). Finalmente se
obtuvieron láminas semitransparentes.
CONCLUSIÓN
La producción de PHA utilizando jarabe glucosado de almidón de yuca variedad CUMBRE 3
como fuente de carbono y las condiciones de proceso descritas, se dió en mayor proporción al
emplear una relación carbono/nitrógeno de 20, con la cual se obtuvieron 0,69 g/L del
biopolímero, una cantidad considerable ya que en otras investigaciones se reportan valores de
hasta 0,19 g/L.
AGRADECEMIENTOS
A la Universidad del Cauca, Ministerio de Agricultura y Desarrollo rural de Colombia y
Corporación Especializada de Centros de Investigación y Desarrollo Tecnológico del Sector
Agropecuario-CENIRED por el financiamiento de esta investigación.
BIBLIOGRAFÍA
 Betancur Cardona, Mariana. 2011. Producción de biopolímeros (polihidroxialcanoatos -
phas) a partir de una cepa comercial empleando sustratos no convencionales. Tesis de
magister en Ingeniería. Medellín: Universidad de Antioquia. Facultad de ingeniería.103 p
 Malincolico, M. 2013. «Biodegradable polymers and additives in commodity and
speciality aplications,» Biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial, vol. 10,
nº 1, p. 3-5.
 Naranjo, J. 2010. Producción de polihidroxibutirato a partir de residuos agroindustriales.
Tesis de Magister en Ingeniería. Colombia: Universidad Nacional de Colombia, sede
Manizales. 56 p.
 Zazali, A.; Irene, K. Isolation of palm oil-utilising, polyhydroxyalkanoate (PHA)-
producing bacteria by an enrichment technique. Bioresource Technology. Vol. 96 (2005):
1229 – 1234.