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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

CBS

Reporte de Laboratorio Practica 3.- Ciclo del glioxilato

UEA: Bioqumica Microbiana Catedrtico(a): Armando Meja lvarez Grupo: BG58 Laboratorio: A2-AB

Integrantes: Equipo No. 5 Huerta Jimnez Luca Paulina Jimnez Maganda Lesley Milln Snchez Viridiana Palma Hernndez Luis Alberto Ninive Ortiz Fierros Snchez Brcenas Hanzonit Etelberto Fecha de entrega del Reporte: 19 de marzo de 2012

Introduccin:
La levadura Saccharomyces cerevisiae se adapta al agotamiento de glucosa a travs de diversos mecanismos, incluyendo la reprogramacin de la expresin gnica y la sntesis de protenas. La liberacin de la represin por glucosa altera la transcripcin de genes implicados en diversos procesos celulares, tales como la gluconeognesis, el ciclo del glioxilato, el cido tricarboxlico (TCA) del ciclo, la respiracin, la -oxidacin, y la utilizacin o el transporte de azcares alternativas. Las enzimas de la va de la gluconeognesis y el ciclo de glioxilato son indispensables para el crecimiento en fuentes de carbono no fermentables, tales como etanol, lactato, o glicerol.

Objetivo:

Reactivos:
Medio Semilla, 200 ml (7 tubos 25 ml c/u) A pH = 7
Glucosa 0.5 % (NH4)2SO4 0.1 % KH2PO4 0.05 % Extracto de levadura 0.2 %

Medio de Fermentacin o Produccin 200 ml (6 tubos con 25 ml c/u) a pH=7


(NH4)2SO4 0.1% KH2PO4 0.05 % Extracto de levadura 0.2 % Alcohol etlico absoluto 3 %

Materiales
15 tubos de 50 ml con tapn y rosca 5 tubos de ensaye de 2 ml 1 probeta graduada de 50 ml 1 vaso de precipitados de 250 ml 1 vaso de precipitados de 100 ml 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml 1 2 1 1 1 1 1 1 1 2 pipeta de 5 ml esptulas asa de siembra mechero Fisher Piceta con agua Piceta con alcohol parrilla de agitacin barra magntica potencimetro pipetas Pasteur

Metodologa:
Preparamos dos medios de cultivo lquido. Del primer medio preparamos 200 ml en total, agregndole Glucosa 1 g, (NH4)2SO4 0.2 g, KH2PO4 0.1 g, Extracto de levadura 0.4 g, pH 7. El medio 2 tambin fue de 200 ml, contena (NH4)2SO4 0.2 g, KH2PO4 0.1 g, Extracto de levadura 0.4 g, Alcohol etlico absoluto 7. 633 ml. Hicimos los clculos necesarios para cada reactivo y cada medio, despus los pesamos. Para cada medio hicimos el mismo procedimiento de preparacin (medio 1 y medio 2), agregamos 100 ml de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y los reactivos correspondientes en cada medio, los mantuvimos en constante agitacin para que se diluyeran, les medimos el pH, que estuviera en 7, despus lo aforamos a 200 ml. Al terminar de preparar los medios los esterilizamos en la autoclave por 15 minutos a 115 lb/pulg, Cuando terminamos de esterilizar los medios, los vaciamos en los tubos con rosca, en un rea desinfectada con alcohol al 70 % previamente, el medio 1 lo vaciamos en 7 tubos con rosca y el medio 2 en otros 6 tubos con rosca, despus dejamos

enfriar un poco los tubos, para que posteriormente le sembramos el microorganismo a cada tubo, bajo las mismas condiciones de desinfeccin del rea. Ya que tuviramos nuestros cultivos con el microorganismo, a cada tubo le pusimos en su interior una campana de Durham, con la boquilla hacia abajo, tapamos cada tubo con la rosca y las dejamos por una semana en el laboratorio (esto con el objetivo de detectar desprendimiento de gases, en este caso CO2).

Resultados
Primero observamos el estado de los tubos, en su estado de reposo, para ver si no hubo contaminacin (turbidez), si hubo biomasa en el fondo de los tubos y la presencia de CO2. Obtuvimos crecimiento en de levadura en los dos medios, salvo algunos tubos, de acuerdo a la siguiente tabla: Tubo Medio 1 Medio 2 1 Si Si 2 Si No 3 Si No 4 Si No 5 Si Si 6 Si Si 7 Si Si

De los tubos que obtuvimos crecimiento de levadura, las que tuvieron presencia de CO2 en las campanas de Durham fueron las siguientes: Tubo Medio 1 Medio 2 1 Si Si 2 Si 3 Si 4 Si 5 Si Si 6 Si No 7 Si No

Despus se agitaron los tubos, para observar la turbidez (proporcional a la concentracin de biomasa la levadura) y si hubo liberacin de CO2, esto debido a que la levadura aun segua metabolizando el sustrato (glucosa o etanol)

Medio 1 (Con Burbujas, al agitar ligeramente)

Medio 1 al agitar (presencia de burbujas, CO2 en el tubo y turbidez, debido a la alta concentracin de biomasa)

Medio 2 (Liberacin de CO2 en el tubo y biomasa en el fondo)

Medio 2 (Turbidez, sin liberacin de burbujas)

Discusin
La presencia de burbujas en el medio 1 indica la liberacin de CO2, que es normal en el metabolismo de la levadura cuando usa un sustrato de 6 carbonos, en este caso, glucosa, ya que realiza la fermentacin alcohlica, donde se obtiene etanol, pasa por el ciclo de Krebs, y en esta va hay si hay liberacin de CO2, pues se forma del piruvato a acetil Co-A, oxalosuccinato a alfa-cetoglutarato y de este a la succinilCoA. Reaccin global del ciclo de Krebs Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O CoA-SH + 3 (NADH + H+) + FADH2 + GTP + 2 CO2 En el medio 2, con sustrato de etanol, que tiene dos carbonos y en teora no se forma CO2, en el caso de los tubos 6 y 7 del medio dos. Debido a que en la ausencia de un sustrato de 6 carbonos, en este caso, etanol que es un sustrato no fermentable, (la saccaromyces es sensible a este y solo tolera un 20% de la concentracin total, por lo tanto es ms factible en medios minimos) se lleva a cabo el ciclo del glioxilato, donde hay dos enzimas exclusivas, que es la isocitrato liasa que convierte el isocitrato a succinato y glioxalato, la malato sintasa que interniene en la formacin de malato a partir del glioxalato y de la acetil-CoA. Esta ruta evita las descarboxilaciones, (para evitar perdida de carbono) es por eso que no se produce CO2. Por qu se forma CO2 en algunos tubos, si se tiene un sustrato de C2, es decir el etanol? En condiciones aerobias, la levadura puede llevar a cabo la respiracin celular (y en consecuencia el ciclo de Krebs), pero para obtener un mayor rendimiento energtico, el Etanol se convierte en acetato, y a su vez en Acetil

CoA. Y pasa al ciclo del glioxilato. Pero en algunos casos (dependiendo de las condiciones de la levadura, ya sean aerobias y de la disponibilidad de enzimas) el oxalacetato puede entrar para sintetizar glucosa por medio de la gluconeognesis, formndose glucosa, y esta entra de nuevo a la glucolisis, formndose piruvato, este se transforma a Acetil Co A, liberndose una molecula CO2, y este pasa al ciclo de Krebs liberndose dos molculas de CO2. Pero debido al mayor gasto
energtico que esto implica, se forma menos biomasa, por lo tanto esta reaccin es se realiza en menos cantidad y se produce muy poco CO2.

Conclusin
Las levaduras mantienen dos tipos de metabolismo muy bien diferenciados. Por una parte, en condiciones en las que existen altas concentraciones de glucosa, fructosa o maltosa, la tendencia es a realizar una fermentacin alcohlica de estos, es decir, se realiza la gluclisis y posteriormente se forma etanol, debido al fenmeno de represin catablica (fenmeno comn a muchos microorganismos por el cual la transcripcin de los genes implicados en la utilizacin de fuentes de carbono alternativas est reprimida en presencia de azcares represores, fundamentalmente la glucosa y la fructosa, que son metabolizadas con mejor eficiencia). Una vez que estos azcares escasean, se produce la respiracin del etanol, va ciclo de krebs. Evolutivamente esto es un proceso que, a priori, no es ventajoso por ser energticamente desfavorable para la reproduccin del organismo, dado que se obtiene mucha menos energa en el primer proceso que en el segundo. No obstante, la gran mayora de los organismos son muy sensibles al etanol, por lo que se ha entendido como un proceso de competencia por sustrato. Una vez que el ciclo de Krebs presente deficiencias de sustratos, se lleva a cabo el ciclo del glioxilato para crear intermediarios, que reemplazaran a ciertas molculas del ciclo o que pasaran a biosntesis, o para compensar la deficiencia de energa, regresando a gluconeognesis y nuevamente a glucolisis.

Bibliografa:
Palacios, A., Augustin, C., Soto, F., Raginel , F., & Ortiz-Julien, A. (2007). XVI Congreso Nacional de Enlogos. Recuperado el 23 de Febrero de 2012, de

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Enlaces Web:
(Link encontrado usando un buscador web), Fecha de consulta: 26/02/2012, 17:40, Link final: http://enologos2008.unicongress.org/archivos/file/Madrid/ENOLOGOS/09%20g rado%20alcoholico%20segun%20levadura.pdf Clark, Jim (2005).Chemguide: Understanding Chemistry. Recuperado el 22 de Febrero de 2012, de Physical Chemistry: Phase equilibria: Non-ideal mixtures of liquids. http://www.chemguide.co.uk/physical/phaseeqia/nonideal.html Chemstations. Focused on process simulation. Recuperado el 22 de Febrero de 2012, de Support, Technical Articles: Heterogeneous azeotropic distillation. http://www.chemstations.com/content/documents/Technical_Articles/DISTILL ATION.PDF Facultad de Qumica, UNAM. Recuperado el 24 de Febrero de 2012, de Hojas de Seguridad de la Facultad de Qumica: Hoja de Seguridad XII, Etanol. http://www.quimica.unam.mx/IMG/pdf/12etanol.pdf