Licenciatura en Biotecnología Módulo 2

Bioprocesos I Trabajo Práctico

ESTEQUIOMETRÍA Y CINÉTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

OBJETIVOS

General
 Aplicar los conceptos de rendimiento y estequiometría del crecimiento
microbiano.

Específico
 Producir etanol por fermentación en condiciones anaeróbicas de la levadura
Saccharomyces cerevisiae.

1. INTRODUCCIÓN

Actualmente, el bioetanol es producido por fermentación alcohólica de los azúcares

presentes en materiales renovables. Dicha fermentación está influenciada por factores como
la concentración de azúcares del sustrato y el microorganismo fermentador que se emplee.
Se sabe que cuando S. cerevisiae se encuentra cultivada a altas concentraciones de
azúcar (menores a 30 – 40%) se incrementa la producción de etanol.
Adicionalmente, cuando S. cerevisiae se encuentra bajo condiciones de alta
concentración de oxígeno disuelto y la concentración de azúcares supera 0,16 g/L o 9 g/L,
la levadura convierte su metabolismo oxidativo a oxidoreductivo o fermentativo
incrementandose la producción de etanol. Dicho fenómeno se conoce como efecto
Crabtree.
Las enzimas piruvato descarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa (adh) están
presentes en microorganismos etanologénicos como Saccharomyces cerevisiae y
Zymomonas mobilis. Dichas enzimas son claves en la producción de etanol y presentan
algunas diferencias de acuerdo con el microorganismo. Se ha encontrado que las enzimas
de Z. mobilis presentan mayor afinidad por sus respectivos sustratos, por lo cual Z. mobilis
produce mayor rendimiento de etanol comparado con S. cerevisiae con valores de 0,49 y
0,46 g/g respectivamente, en medio de cultivo con 100 g/L de glucosa, 200 rpm, pH 5 y 30
ºC.
Si bien el rendimiento de etanol de Z. mobilis es mayor que el de S. cerevisiae, la
presencia de sales en medios de uso industrial como la melaza de caña de azúcar inhibe la
producción de etanol Z. mobilis. Por tal razón, S. cerevisiae continúa siendo el
microorganismo usado industrialmente.

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Es por ello que actualmente existen en el mercado cepas de S. cerevisiae que han
sido modificadas o seleccionadas genéticamente para incrementar el rendimiento de etanol.
Por ejemplo, la cepa Etanol Red ® es una cepa de levadura que ha sido seleccionada
específicamente para la producción de etanol industrial. Esta levadura posee una elevada
tolerancia al alcohol, presenta rendimientos de alcohol elevados y mantiene alta viabilidad
durante varias generaciones de cultivo.
En este trabajo práctico se evaluara, los rendimientos de producción de etanol de la
cepa de S. cerevisiae Etanol Red, empleando melaza de caña de azúcar como FCE (fuente
de carbono y energía).

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Microorganismo de estudio

Saccharomyces cerevisiae de Panificación.

2.2 Medios de cultivo

MEDIO YBD
Glucosa 20 g
(NH4)2SO4 1g
MgSO4.7H2O 0.5 g
Extracto de levadura 0.5 g
Add Buffer Fosfato 100 mL
Agua destilada estéril csp 1L

PREPARAR SOLUCIONES STOCK

MEDIO YBD 10X

Glucosa 20 g
(NH4)2SO4 1g
MgSO4.7H2O 0.5 g
Extracto de levadura 0.5 g
Agua destilada csp 100 mL

BUFFER FOFATO 1 M pH 6.0

Soluciones stock 1 M K2HPO4 y 1 M KH2PO4,
1 M K2HPO4 132 ml (174.2 g/mol)
1 M KH2PO4 868 ml (136.09 g/mol)
Esterilizar por autoclave
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2.3 Condiciones de cultivo y preparación de inóculo

Se prepara una suspensión de levadura (Levex®) disolviendo un sobre en 30 mL de

Buffer Fosfato 0.1M inóculo
Posteriormente, se determina la DO660 del inóculo y se realizan los cálculos de
forma tal de inocular los Erlenmeyer de experimentación con una DO inicial de 0,05 DO 600
considerando 150mL de medio de cultivo final.
NOTA Realizar los cálculos pertinentes para inocular el mismo.

En los Erlenmeyer Kitasato de experimentación se realizarán fermentaciones sin

suplementación de oxígeno, por un período de 24h. El cultivo se desarrolla a 30°C y pH=6
empleando el sistema que se muestra a continuación.

Figura 2. Sistema hidroneumático para la medición del CO2 producido durante la

fermentación alcohólica. El CO2 generado se acumulará en la probeta invertida desplazando
el nivel de agua de su interior.

2.4 Evaluación del crecimiento celular

2.4.1 Determinación por espectrofotometría

Se realizará el seguimiento al crecimiento celular por el método de DO 600, el cual se
desarrolla de la siguiente forma.
1. Tomar 1mL de cultivo de cada Erlenmeyer y colocar el mismo en una cubeta para
espectrofotómetro.
2. Realizar un blanco de lectura empleado otra cubeta que contenga el mismo medio
de cultivo.
3. Determinar la absorbancia a OD600
4. Registrar la lectura, el rango de linealidad para este método se encuentra entre
valores 0,2< DO600< 0,6. De registrar una lectura menor a 0,2 se reporta como cero

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si el valor es mayor a 0,6 se debe diluir la muestra con el medio adecuado para que
la misma ingrese en el rango de lectura.
Una vez registrada concentración de la biomasa por este método se puede correlacionar la
misma con su concentración en peso seco (DCW, dry cell weigth) mediante la siguiente
expresión
1 OD600 = 0.62 g DCW/L
2.5 Evaluación del consumo de sustrato

El contenido de glucosa residual se realizará empleando el método enzimático para

la determinación de glicemia. Donde la glucosa por acción de la glucosa oxidasa da acido
glucónico y peróxido de hidrogeno el cual reacciona con la 4-aminofenazona y el 4-
hidroxibenzonato para dar quinonimina roja en una reacción catalizada por la peroxidasa.

Para determinar la concentración de glucosa residual se procede según

1. Rotular tres tubos como B, S y D
2. Agregar al tubo S 10 ul de solución standard (glucosa 1 g/L).
3. Agregar al tubo D 10 ul de muestra.
4. Agregar al tubo a los tres tubos 1 mL de reactivo A.
5. Incubar 5 min en baño de agua a 37ºC o 25 min a temperatura ambiente.
6. Luego leer en espectrofotómetro la Abs a 505nm realizando el blanco con la
solución contenida en el tubo B.

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Realizar los cálculos de la concentración de glucosa

Donde D y S son las Abs de la muestra y estándar respectivamente.

2.6 Evaluación de la producción de CO2

La producción de CO2 se determina emplenado el sistema hidroneumático. El CO2

generado durante la fermentación se acumulará en la probeta invertida desplazando el nivel
de agua de su interior. El volumen de gas acumulado, puede ser empleado para calcular los
moles de CO2 generado durante la fermentación por medio de la ecuación de los gases
ideales.
P.V=n.R.T
Donde
P es la presión del gas en la probeta
V es el volumen de gas en la probeta
R es la constante universal de los gases ideales 0,082 [L. atm/ K. moL]
T es la temperatura absoluta (°C+273K)

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Patm. = Pgas + PvH2O + Pcol.H2O

La presión de la columna de agua en milímetros de mercurio es igual a:

δ mm H O
Pmm Hg=hmm H O 2

2
δ Hg
dH2O = 1 g/cm3
dHg = 13.6 g/cm3
PvH2O @ 25°C = 23,756 mm Hg.
Patm = 784 mm Hg.

2.7 Evaluación de la concentración de etanol

La concentración de Etanol se calcula empleando el balance de Carbono para la
siguiente ecuación de crecimiento.
FCE+ FN  yx/s CH1,7O0,56N0,2 + yp/s CH2,5O0,5H0,5 + yCO2/sCO2

3. RESULTADOS Y CALCULOS

3.1 Evaluación del crecimiento celular

 Determinar el rendimiento experimental para la producción de biomasa.
 Determinar el rendimiento para el producto.

Completar la ecuación estequiométrica

____ FCE + ____ FN  ____ CH1,7O0,56N0,2 + ____ CH2,5O0,5H0,5 + ____ CO2

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Calcule el grado de reducción del sustrato considerando como estado de referencia

NH4; CO2; H2O compare los resultados obtenidos con los rendimientos máximos
teóricos.

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ANEXO 2
MATERIALES Y EQUIPOS

 10 tubos tipo falcón de 50 mL estériles.

 10 tubos tipo falcón de 15 mL estériles.
 Caja de tips p1000 estériles.
 Caja de tips p100 estériles.
 Tubos eppendorf de 1,5 mL
 Pipetas de p20; p200 y p1000
 3 mangueras de longitud mayor a 50 cm
 3 Kitasato de 250 mL
 Un baño termoestatizado
 Una bandeja plástica tipo batea
 3 pies con nuez y agarradera
 3 probetas de 500 mL
 Cubetas para espectrofotómetro
 Vortex
 Espectrofotómetro
 Gradillas para tubos de 50 mL, 15 mL y 1,5 mL
 Autoclave
 Kit de glicemia Winner Lab®
 Glucosa
 (NH4)2SO4
 MgSO4.7H2O
 Extracto de levadura
 Agua destilada
 K2HPO4
 KH2PO4
 Agua destilada estéril 1 L
 Levadura Levex®

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ANEXO 1

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