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Informe 7 Determinacion DE Carbohidrados POR

Colorimetria 123.docx
Bioquimica (Universidad de los Llanos)

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UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS INFORME N° 7 DE

Facultad de Ciencias agropecuarias y Recursos Naturales LABORATORIO
Departamento de Biología y Química PRINCIPIOS
QUÍMICOS

DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS POR COLORIMETRÍA

Angie Paola Acuña 1, Juan David Cortes 2
1
Facultad de Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales, Universidad de los Llanos, Km 12 Vía a Puerto
López, Vda. Barcelona 500017, Villavicencio, Colombia
2
Facultad de Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales, Universidad de los Llanos, Km 12 Vía a Puerto
López, Vda. Barcelona 500017, Villavicencio, Colombia.

Docente: Lissette Johana Hernández Arrieta

Facultad de Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales.

Programa Ingeniería Agroindustrial
Resumen
En esta práctica se desarrolló de manera experimental la determinación de carbohidratos por
colorimetría por medio de la implementación del equipo espectrofotómetro el cual tiene la capacidad
de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es
absorbida por la muestra, teniendo como objetivo dar información sobre la naturaleza de la muestra
en diferentes concentraciones de la glucosa al 0.2%. Para el desarrollo de la elaboración de la
práctica se usó el reactivo orto-toluidina con la finalidad de determinar la reacción de la glucosa
donde a partir de esta se generó una condensación, formando grupos aminas aromáticas. Por medio
de cada uno de los datos se determinó la transmitancia, el porcentaje de transmitancia y la
concentración de la glucosa por medio de la ley de Lambert-Beer. Finalmente por medio de los
resultados se observó una variación de gran nivel en la absorbancia de la glucosa al igual que su
longitud de onda.

Palabras clave: glucosa, colorimetría, absorbancia, carbohidratos.

1. Introducción que estén en el mismo estado de movimiento. Es igual,

Para entender mejor el presente informe definimos
como sucede la absorción conocida como luz
monocromática formada por componentes de un solo
color, tiene una única longitud de onda
correspondiente a cada color, es utilizada en cámaras
monocromáticas, provee mejor visibilidad en ciertos
aspectos y mediante contrastes, ya que todos los
colores opuestos se absorben.
como en cualquier otro tipo de onda, a la velocidad de
propagación de la onda dividida por la frecuencia.
Debemos tener en cuenta que vamos a mantener
constante la frecuencia, pero la velocidad va a
depender del medio que esté atravesando en ese
momento, por lo que, al ser la velocidad muy variable
en tejidos orgánicos, la longitud de onda también lo
será.

Longitud de onda conocida como la distancia existente Espectro electromagnético distribución energética del
entre dos planos inmediatos de partículas del medio conjunto de ondas electromagnéticas, referido a un

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DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS POR COLORIMETRÍA

objeto se denomina espectro electromagnético a la coeficiente así expresado, en términos de unidades de

radiación electromagnética que emite o absorbe una concentración molar (o un submúltiplo apropiado), se
sustancia, dicha radiación sirve para identificar la denomina coeficiente de extinción molar (εM).
sustancia de manera análoga a una huella dactilar. Los Cuando, por desconocerse el peso molecular del
espectros se pueden observar soluto, la concentración de la disolución se expresa en
mediante espectroscopios que, además de permitir ver otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1, las
el espectro, permiten realizar medidas sobre el mismo, dimensiones de ε resultan ser distintas, por ejemplo g-
como son la longitud de onda, la frecuencia y la 1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina
intensidad de la radiación. (Ordoñez, 2012) coeficiente de extinción específico (εs). La ley de
Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para
En el espectro de absorción la representación gráfica valores de c altos, ε varía con la concentración, debido
trabajada que indica la cantidad de luz absorbida (ε) a a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de
diferentes valores de λ. A partir de una solución moléculas, cambios del medio, etc. (Díaz, 2010)
diluida de un compuesto, cuya absorbancia máxima
entra dentro del rango de medida del 2. Objetivos
espectrofotómetro, se verá el valor de absorbancia a
diferentes longitudes de onda frente a un blanco que ● Se implementó las bases de la colorimetría
o espectroscopia visible.
contenga el disolvente de la solución de la muestra a
caracterizar. A partir del espectro de absorción se ● Aplicando las técnicas para la
determinación de la glucosa en una muestra
obtendrá el valor de λ al que el compuesto presenta la
problema.
mayor absorbancia (λmax). Dicho λ se utilizará a la
● Se logró adquirir destreza en la aplicación
hora de hacer determinaciones cualitativas y
de la espectroscopia.
cuantitativas del compuesto. El espectro de absorción
● Se midió la concentración de la glucosa en la
de un cromóforo depende, fundamentalmente, de la
muestra problema.
estructura química de la molécula. (Díaz, 2010)
Para la realización de cálculos y base del informe se 3. Materiales y reactivos
empleo la ley de Beer es la ley expresa la relación Tabla 1. Materiales equipos y reactivos utilizados en
entre absorbancia de luz monocromática (de longitud la práctica y elaboración del presente informe.
de onda fija) y concentración de un cromóforo en Reactivos
solución: Equipos Materiales y/o
sustancias
A = log I/Io = ε·c·l Tubos de Agua
ensayo (16) destilada
La absorbancia de una solución es directamente Espectrofo Pipeta de 1ml Orto-
proporcional a su concentración –a mayor número de (1) toluidina

tómetro Glucosa al
moléculas mayor interacción de la luz con ellas-; Gradilla (1)
0.2%
también depende de la distancia que recorre la luz por Muestra
la solución –a igual concentración, cuanto mayor Pera
problema
distancia recorre la luz por la muestra más moléculas
se encontrará-; y por último, depende de ε, una 4. Sección experimental
constante de proporcionalidad -denominada Primeramente se utilizó el método conocido como la
coeficiente de extinción- que es específica de cada determinación de glucosa por colorimetría con o-toluidina
cromóforo. Como A es adimensional, las dimensiones para la formación de glucosamina coloreada donde se
de ε dependen de las de c y l. La segunda magnitud (l) determinó cuantitativamente por su colorimetría,
se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) posteriormente con el uso de la tabla uno se realizó las
soluciones necesarias que se muestran a continuación.
se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las
dimensiones de ε resultan ser M-1·cm-1. Este

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Tabla 2 Medidas con las sustancias para las soluciones Figura 1. La coloración de la glucosa posterior
utilizadas en cada tubo. al baño maria de izquierda a derecha tubo B ́, 1 ́,
2 ́ y 3 ́ respectivamente.
G. Vol.
M. P. H 2O T. Figura 2. La coloración de la glucosa posterior
Tubo 0.2% (mL) (mL) al baño maria de izquierda a derecha tubo 4 ́, 5 ́
(m (mL)
L) y m ́ respectivamente.
B 0.0 0.0 5 5.0
.
0
1 0.1 0.0 4 5.0
.
9
2 0.2 0.0 4 5.0
.
8
3 0.3 0.0 4 5.0
.
7
4 0.4 0.0 4 5.0
.
6
5 0.5 0.0 4 5.0
.
5
M 0.0 0.3 4 5.0
.
7

en segunda instancia se escogió otros 7 tubos de

ensayo estos serán los prima como B´ al M´
sucesivamente, donde se adiciono 1 ml a estos tubos y
4 ml del reactivo orto-toluidina donde se desarrolló
una coloración posteriormente de pasar al baño maria
verdosa presentadas a continuación.

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5. Resultados y análisis
Tabla 3. La transmitancia y el porcentaje de transmitancia
con su longitud de onda con mayor absorbancia resaltada.

LONGITUD DE
ONDA %T T A
550 73,961 0,7 0,1
40 31
570 70,146 0,7 0,1
01 54
590 62,806 0,6 0,2
28 02
610 55,976 0,5 0,2
60 52
630 53,333 0,5 0,2
33 73
650 57,016 0,5 0,2
70 44
670 71,285 0,7 0,1
13 47
690 86,896 0,8 0,0
69 61
710 95,280 0,9 0,0
53 21

T = 1/ 10A %T = 1/10A x 100 Ec 1.

Donde:

T = transmitancia A =

absorbancia

%T = Porcentaje de transmitancia

Dados para la tabla 3:

Para longitud de onda 550; T =

1/10 0,131 = 0,7396

%T = 0,7396 x 100 = 73,961

Así sucesivamente con cada longitud de onda para la

muestra en del tubo 3 respaldando en la tabla 3 el valor con
mayor absorbancia representada por 630 nm. La
transmitancia es la luz transmitida respecto a la luz incidente
por la celda dada por el espectrofotómetro típico.

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0,004% = [ ]2

Tubo 1´: 0,004 x 1/5 = 0,0008

[0,004%]1 (1 ml)1 = [ ]2 (5 ml)2

[0,004%]1 (1ml)1 / (5 ml)2 = [ ]2

0,0008% = [ ]2

Así para todos los tubos hasta completar la tabla 4

para encontrar su concentración de glucosa % mg/ml
por medio de la ecuación 2.
Gráfica 1. Absorbancia respecto a la longitud de
onda estudiada, resalta el punto rojo como el Tabla 5. Concentración de glucosas de los tubos
valor mayor de absorbancia. primas y su absorbancia (A) a una longitud de onda de
630 nm.
Tabla 4. Concentración de glucosa de cada tubo.
TUB C. GLUCOSA % (mg/ml) A.
C. C. OS
TU TU
GLUCOSA GLUCOSA B' 0 0
BO % (mg/ml) BO % (mg/ml) 1' 0,00 0,1
B 0 B' 0 08 24
1 0,0 1' 0,00 2' 0,00 0,2
04 08 16 13
2 0,0 2' 0,00 3' 0,00 0,2
08 16 24 73
3 0,0 3' 0,00 4' 0,00 0,4
12 24 32 08
4 0,0 4' 0,00 5' 0,00 0,5
16 32 4 01
5 0,0 5' 0,00 M' x 0,2
2 4 76
M 0 M' 0

[ ] 1 V1 = [ ]2 V2 [ ]2 = V1 [ ]1 / V2 Ec 2.

Donde:
[ ] = Concentración
V = Volumen

La anterior ecuación se utiliza para hallar las

concentraciones de glucosa en cada uno de los tubos
desde el B al M para los tubos prima se realiza
multiplicando la concentración hallada
multiplicándose por 1/5 esto se debe a que se mide un
1 ml de cada tubo a los tubos prima.
Gráfica 2. Absorbancia de las muestras primas
Datos para la tabla 4;
con respecto a la concentración de glucosa.
Tubo 1: [0,2]1 (0,1 ml)1 = [ ]2 (5 ml)2 Para hallar la muestra problema M´ con la ecuación de
la gráfica 2 esta recta se escribe de la forma y = mx +
: [0,2]1 (0,1ml)1 / (5 ml)2 = [ ]2 b o y = 122,04x + 0,0091 se le llama la forma
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pendiente-intersección de la ecuación. Donde m es la disolución, esto se basa en utilizar la transmisión de la

pendiente de la recta. luz por medio de una solución para así determinar la
concentración de un soluto dentro de la solución, la
Datos para la incógnita x de la tabla 5: luz de una determinada longitud de onda pasa a través
de una muestra a partir de esto se mide la cantidad de
Y = 0,276 la concentración de glucosa del tubo M´ luz que es transmitida.(Pinzon,2017)
Y = 122,04 x + 0,0091 La fracción de luz incidente absorbida por una
solución a una longitud de onda está relacionada con
Y – 0,0091 / 122,04 = el paso óptico y con la concentración de la especie
absorbente. La absorbancia nos sirve más que la
x transmitancia, ya que la absorbancia aumenta con la
concentración creciente del colorante y la
0,276 – 0,0091 / 122,04 = x transmitancia decrece cuando se aumenta la cantidad
de colorante rojo. La relación de la absorbancia con la
0,2669 / 122,04 = x concentración es lineal, por esto se parte de una
medición de una sustancia la cual no contenga
0,002186 % = x colorante (sin absorbancia) = 0 implementando la Ley
de Beer:
A continuación con los datos obtenidos anteriormente,
procedemos a hallar la concentración en el tubo M con � = ε ��
la ecuación 2.
Existen distintos métodos para realiza la
Datos para hallar la concentración de glucosa del cuantificación por medio de espectrofotometría
tubo M: Métodos basados en el poder reductor de los
carbohidratos (método de la o-toluidina) y métodos
[ ] 1 V1 = [ ]2 V2 [ ]2 = V1 [ ]1 / V2 Ec 2. enzimáticos, los cuales utilizan las enzimas como
reactivos para tener más especificidad. (Espinoza,
[ ] 1 (1ml)1 = [0,002186%]2 (5ml)2
2005)
[ ]1 = (5ml)2 [0,002186%]2 / (1ml)1
En nuestra práctica utilizamos el método de la o-
toluidina en el cual se presenta una reacción de
[ ]1 = 0,01039 %
condensación de la glucosa y aminas aromáticas
primarias en un medio de ácido glacial.
Procedemos hallar la concentración de nuestra
muestra problema;

[ ] 1 V1 = [ ]2 V2 [ ]2 = V1 [ ]1 / V2 Ec 2.

[0,01039%] 1 (5ml)1 = [ ]2 (0,3 ml)2

[ ]2 = (5ml)1 [0,01039%]1 / (0,3 ml)2

[ ]2 = 0,1731 %

Por tanto la concentración de glucosa que se encuentra

en la muestra problema es de 0,1731%.

La colorimetría es una técnica frecuentemente

utilizada por los laboratorios de Bioquímica, con ella Imagen 1. Reacción de o-toluidina en las
podemos determinar la información cualitativa y soluciones de laboratorio para la glucosa.
cuantitativa de una sustancia que se encuentra en

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6. Conclusiones
Logramos conocer diferentes técnicas para la
determinación de los carbohidratos por colorimetría,
así mismo conociendo este método a fondo, para así
determinar la concentración de nuestra muestra
problema por medio de la glucosa.

7. Referencias

Bioquímica de Harper, Murray, manual moderno, 16

ed, 2004, México

Libro multimedia de Bioquímica. Santiago Valbuena,

solubilidad de proteínas, Ed universidad de los
Llanos, 2010.

Díaz, N. A. (2010). Espectrofometría: Espectros de

absorción y cuantificación colorimétrica de las
biomoléculas. Departamento de Bioquimica y
Biologia molecular.

Espinoza, M. P. (2005). Preparación y evaluación de un

equipo de reactivos para la determinación de
glucosa. Bioquímica,Vol 3. Asociación Mexicana
de Bioquímica, AC.

Ordoñez, J. L. (2012). Espectro electromagnético y espectro

radioeléctrico. ACEA.

Pinzón García, Ana Delia, Sandoval Hernández, Adrián

Gabriel, & Rivera Diaz, Paola Andrea, & Gómez
Camargo, Doris Esther, & Gómez Alegría, Claudio
Jaime (2017). Determinación colorimétrica de
glucosa y consumo de glucosa en cultivos de
células adiposas 3T3-L1. Acta Bioquímica Clínica
Latinoamericana, 51 (2), 195-202. [Fecha de
Consulta 9 de abril de 2021]. ISSN: 0325-2957.
Disponible en:
https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=535525080
04

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