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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN / RESEARCH ARTICLE

CUANTIFICACIÓN COLORIMÉTRICA DE LA
CONCENTRACIÓN
Colorimetric Quantification of the Concentration
Maria Camila VERGARA RODRIGUEZ, Gloria Lizeth BABATIVA MELGAREJO
Estudiantes pregrado biología, Universidad Nacional de Colombia. Carrera 45 # 26-85 Bogotá

Citation/ Citar este artículo como: Vergara Rodríguez MC, Babativa Melgarejo GL.
asaCuantificación colorimétrica de la Concentración

RESUMEN
La espectrofotometría consiste en medir el espectro que es absorbido por una sustancia respecto a la
emisión de una fuente de radiación. El aparato utilizado para esto es el espectrofotómetro, el cual
emite una luz que pasa por un lente, luego a través de un prisma que separa las diferentes longitudes
de onda, más tarde, atraviesan la muestra y finalmente la cantidad de luz absorbida es medida por el
fotómetro. En esta investigación, se utilizó este método para conocer la concentración de una
sustancia problema de azul de metileno, esto se logró a partir de la creación de una curva de
calibración que, al mismo tiempo, fue generada a partir de los datos de una curva espectral de la
máxima absorbancia de la sustancia. Se utilizaron además los conceptos de diluciones para la
creación de 9 disoluciones de azul de metileno, y, además, se utilizó como base la ley de Beer
Lambert. Se logró concluir que los métodos utilizados para hallar la concentración de la solución
problema fueron exactos para hallar la absortividad, pero poco precisos al momento de determinar
la concentración del analito, además de ser de gran influencia las limitaciones de la ley de Lambert-
Beer. Adicionalmente, esta ley permitió establecer una proporcionalidad entre las propiedades
estudiadas de la solución problema y los factores que la determinan.

Palabras clave: Absorbancia, curva de calibración, disolución, espectrofotometría, azul de

metileno.
ABSTRACT
Spectrophotometry consists of measuring the spectrum that is absorbed by a substance with respect
to the emission of a radiation source. The machine used for this is the spectrophotometer, which
emits a light that passes through a lens, then through a prism that separates the different
wavelengths, later, they pass through the sample and finally the amount of light absorbed is
measured by the photometer. In this investigation, this method was used to know the concentration
of a problem substance of methylene blue, this was achieved from the creation of a calibration
curve that, at the same time, was generated from the data of a spectral curve of the maximum
absorbance of the substance. The concept of dilutions for the creation of 9 solutions of methylene

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blue was also used, and additionally, Beer Lambert's law was used as a basis. It was concluded that
the methods used to find the concentration of the substance were accurate to find the absorptivity,
but not precise when determining the concentration of the analyte, besides being of great influence
the limitations of the law of Lambert-Beer. Additionally, this law allowed to establish a
proportionality between the properties studied of the substance and the factors that determined
them.

Keywords: Absorbance, calibration curve, dissolution, spectrophotometry, methylene blue.

INTRODUCCIÓN:
Una solución es una mezcla con composición
homogénea formada por la unión de un
soluto, el cual se encuentra en menor
cantidad, y un solvente, que por lo general es
agua. Para saber que tanto soluto hay en una
disolución, se pueden utilizar diferentes
medidas de concentración (molaridad, partes
por millón, molalidad, etc), del mismo modo,
hay gran variedad de de métodos para saber
esta concentración. El color, por ejemplo,
cuando el soluto es un tinte, es una medida
cualitativa, entre más sólido es el color,
mayor es la concentración.
Por otro lado, la espectrofotometría es un
método cuantitativo para medir de forma
indirecta la concentración, pues dice cuanta
luz absorbe una sustancia química midiendo
la intensidad de luz emitida por un haz de luz
y comparándola con la cantidad que logra
atravesar la solución muestra. El principio
básico es que cada compuesto absorbe o
transmite luz en un cierto rango de longitud
de onda (Atkins P y Paula de Julio 2006) Esto
significa que para saber a qué longitud de
onda, o en qué parte del espectro es absorbida
más luz por una sustancia, es necesario saber
cuál es el máximo de absorbancia, por medio
de diferentes mediciones.
Esta técnica puede usarse en aplicaciones que
tratan con sustancias químicas,
estandarización de colores en materiales como
plásticos y pinturas, detección de niveles de
contaminación de agua, e impurezas en
alimentos y reactivos. Además, en el área de
la bioquímica se puede utilizar para
determinar reacciones catalizadas por enzimas y,
en cuanto a aplicaciones clínicas, para examinar
sangre o tejidos.
En el estudio presente, esta técnica es
indispensable para hallar la concentración de azul
de metileno en 9 disoluciones, preparadas a partir
de una solución inicial de azul de metileno;
tomando diferentes cantidades en mL de esta
solución y mezclando con agua destilada.
La ley de Beer-Lambert explica cómo las
propiedades únicas de cada sustancia están
relacionadas con la absorbancia (A) a una
determinada longitud de onda, la distancia que
recorre dicha onda en la sustancia (L), el
coeficiente de absortividad (E), el cual es un
valor constante para cada sustancia y la
concentración a la que se encuentra la especie
absorbente (c). Tal como se expresa de forma
matemática en la fórmula: A= E.b.c
Para entender esta ley debemos tener en cuenta
dos expresiones importantes. La primera es
transmitancia, la cual se define como la relación
entre la energía de la luz transmitida a través de
una solución problema (P) y la energía incidente:
T= P/Po
La segunda es absorbancia que se refiere a la
cantidad de luz que absorbe una muestra, esta se
representa como menos logaritmo de la
transmitancia: A= - log T
Como se mencionó anteriormente, la sustancia
de concentración desconocida a trabajar es azul
de metileno o Cloruro de fenazationio, su
fórmula química es C16H18N3ClS, esta
sustancia en un colorante orgánico, presenta un
color verde oscuro con brillo bronceado pero sus

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disoluciones en agua o alcohol son de color Curva de calibración

azul intenso. El azul de metileno tiene gran
uso en el sector de la salud como teñir partes
del cuerpo antes o durante una cirugía, uso
antiséptico tópico y cicatrizante interno,
también se usa en las tinciones para
observaciones en el microscopio y teñir
resultados en laboratorio.
A partir de esta longitud de onda (630.3 nm), se
trabajaron las nueve disoluciones nombradas
anteriormente, pues en este punto la absorbancia
sería la mayor para cada disolución. La curva
resultante de esta relación entre la absorbancia y
la concentración, se llama curva de calibración,
la cual se puede apreciar en la gráfica 2.

MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación soluciones RESULTADOS
Se realizaron 9 disoluciones de azul de
metileno a diferentes concentraciones (0.0,
1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 40.0 y
50.0 ppm) Para ello, se utilizó como solución
stock el azul de metileno contenido en una
bureta de 25.000ml marca Brand fabricada en
Alemania (con una incertidumbre de
±0.075ml). Sabiendo que el volumen
requerido para cada muestra era de 10.00 ml,
se halló la cantidad necesaria de azul de
metileno por medio del despeje de V1 en la
fórmula V1M1=V2M2. Donde V1 y M1 son el
volumen y la concentración del azul de
metileno, y V2 y M2 son los correspondientes
al volumen total (10ml) y la concentración
deseada.
Después de colocar la cantidad necesaria de Gráfica 1: Curva espectral para azul de metileno
solución stock para su correspondiente a una concentración de 50.0 ppm desde 350 nm
concentración en un balón aforado de hasta 700 nm.
10.00ml (± 0.06ml) marca Brand fabricado en
Para determinar la ecuación que contiene la
Alemania, se completó la disolución con agua
concentración, fue necesario utilizar los datos
destilada hasta el punto de afore (proceso de
entre el intervalo de 0.0 ppm hasta 25.0 ppm,
dilución), y se vertió cada solución en
pues es necesario tener una tendencia
probetas debidamente rotuladas.
relativamente recta para obtener una ecuación
Máximo de absorbancia lineal en la que los datos de concentración
Para hallar la longitud de onda con máxima coinciden al ser evaluados con su respectiva
absorbancia, se utilizó la solución con mayor absorbancia.
concentración, es decir, 50.0 ppm. Esto se
Como se puede ver en la gráfica 2, la curva de
realizó por medio de un espectrofotómetro
absorbancia completa para el azul de metileno es
(SpectroVis Plus / LabQuest2) fabricados en
86.71% lineal (según su ), mientras la recta
Beaverton Estados Unidos. La muestra se
obtenida en el intervalo tomado es 99.4% lineal,
analizó con longitudes de onda entre 350 nm
como se aprecia en la gráfica 3.
hasta 700 nm. Lo que se obtuvo fue que la
máxima absorbancia era de 2.325 a 630.3 nm,
tal como se ve en la gráfica 1.

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Gráfica 2: Curva de calibración para azul de Gráfica 3: Curva de calibración para azul de
metileno desde 0.0 ppm hasta 50.0 ppm a una metileno en un intervalo de 0.0 ppm hasta 25.0
longitud de onda de 630.3 nm ppm a una longitud de onda de 630.3 nm.

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Tabla 1: Datos estadísticos de 12 estudios
para la concentración del analito a diferentes
longitudes de onda.
Por medio de la ecuación obtenida a partir de
la gráfica 3 se obtiene la concentración de la
solución problema; Y corresponde a la
absorbancia y X a la concentración:
y = 0.0796x + 0.0293
Para hallar el porcentaje de error absoluto se
usó la fórmula %Er = (E/μ) 100. Esto se
realizó para el valor de este estudio (11.6671
ppm) y cada uno de los valores del grupo en
total (Tabla 1). Para determinar el intervalo
mínimo y máximo de datos rechazados se
realizó el cálculo con la fórmula μ=ẋ±tSẋ con
un nivel de confianza (Distribution t Student)
del 95%
DISCUSIÓN
La función obtenida puede facilitar otros
datos, por ejemplo, que al cortar el eje Y en
0.0293 significa que esta es la absorbancia
para el blanco, es decir que la concentración
es cero. Además la pendiente demuestra que
por cada 0.0796 de aumento en absorbancia,
habrá un incremento de 1 ppm en la
concentración.
El valor real de la solución problema de azul
de metileno se tomó como el promedio de los
datos no rechazados en un estudio de 12
grupos, donde cada uno halló la
concentración de la solución a diferentes
longitudes de onda correspondientes a la
máxima absorbancia, en diferentes
espectrofotómetros. Como se puede observar
en la fórmula, el valor hallado para la
concentración (x) en este estudio fue de
5
a 630.30 nm, cuya absorbancia
corresponde a 0.958. Mientras que, el valor real
corresponde a 11.03186 ppm en una longitud de
onda promedio de 634.125 nm (Tabla 1). Esto
significa que el valor obtenido se diferencia del
valor real en 0.63524 ppm, lo que se puede deber
a diferencias en la calibración de cada
instrumento y a errores tanto personales,
sistemáticos y/o aleatorios, lo que se confirma
con la incertidumbre de cada instrumento.
Además, del análisis estadístico de la tabla 1, se
obtiene que el porcentaje de error para el
presente estudio fue de 5.758231%, esto
demuestra que la concentración obtenida se
encontraba por fuera del intervalo aceptado para
los datos, recordando que se trabajó con
confiabilidad de 95.0%. Respecto a otros grupos
de estudio, es destacable mencionar que los
grupos 3, 6 y 7 obtuvieron los porcentajes de
error más grandes, siendo aproximadamente
9.6671%, 11,3964% y 8.2838%
(respectivamente).
En cuanto al porcentaje de error grupal, se
consiguió que fue de 0.331985%, tomando el
promedio inicial como si fuera el valor medido, y
el promedio nuevo (sin los datos rechazados)
como el valor real.
El coeficiente de variación demuestra que el
método utilizado no fue lo suficientemente
preciso, siendo de 6.5384.
Por otro lado, la ley de Lambert-Beer permite
hallar el coeficiente de absortividad molar para la
sustancia, por medio de la fórmula mencionada
anteriormente, donde A corresponde a la
absorbancia 0.958 en una longitud de onda de
630.3nm, b corresponde a 1 cm de longitud de la
celda utilizada, y c es la concentración
previamente obtenida de la ecuación
. De esta manera:
A=E.b.c
E=0.958/(1cm*11.6671ppm)
E=0.08211
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Lo que quiere decir que el coeficiente de
absortividad para el azul de metileno en la
concentración problema es de 0.08211. Es
necesario tener en cuenta que este coeficiente
fue hallado con un valor rechazado, y para
hallar el dato real, cuya concentración es
11.03186 ppm, sería necesario conocer la
función para encontrar la absorbancia.
Se puede observar que entre menor sea la
concentración (ppm) de las disoluciones se
tiende a tener una tendencia más lineal. Así,
para obtener la concentración problema de la
disolución, se puede ver que se debe tomar el
rango de mayor estructura lineal (0.0 a 25.0
ppm) para aplicar la ecuación de este tipo.
Estas concentraciones muy diluidas
demuestran la limitación de la ley de
Lambert-Beer, la cual pierde su funcionalidad
a medida que se aumenta la concentración. En
el caso del azul de metileno, el límite de la
concentración, se encuentra alrededor de las
25.0 ppm.
CONCLUSIONES
Los estudios demostraron que la
espectrofotometría puede llegar a ser un
método no muy preciso para obtener la
concentración de un analito, especialmente
cuando se deben utilizar previamente aparatos
con incertidumbre elevada, disminuyendo a la
vez la exactitud, por ejemplo la bureta y el
balón aforado al momento de elaborar las
disoluciones. La falta de precisión en el
estudio se refleja en el rechazo de los datos al
analizar estadísticamente. Adicionalmente, es
necesaria una curva de calibración para hallar
una función lineal, lo cual puede ser poco
exacto cuando se trata de concentraciones
elevadas, siendo limitantes para la ley de
Lambert-Beer.
También se demostró que esta ley, relaciona
la absortividad, la concentración, la longitud
que atraviesa la onda y el coeficiente de
absortividad molar de forma directamente
proporcional. Siendo E diferente para cada
sustancia, lo que significa que existe una
longitud de onda (parte del espectro) que se
absorbe en una mayor cantidad debido a las
propiedades específicas de cada sustancia, lo
cual corresponde a la mayor absorbancia.
Finalmente, existen diferentes formas de
representar la concentración, ya sea
cualitativamente, en el caso del color de las
disoluciones (a mayor color, mayor
concentración, y por tanto mayor absorbancia y
menor transmitancia), o cuantitativamente por
medio del espectrofotómetro.
REFERENCIAS
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aaaOxford University Press, 2006.
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