Identificación de un espectrofotómetro UV-VIS y Ley de Beer

Arleidys Rodríguez, Carolina Villegas, Heidy Altamiranda y Norleivys Núñez

arleidysrodriguez@mail.uniatlantico.edu.co , cvillegas@mail.uniatlantico.edu.co ,
hatlamiranda@mail.uniatlantico.edu.co , nvnuñez@mail.uniatlantico.edu.co

Universidad del Atlántico, Facultad de Química y Farmacía, Programa de Farmacía, Laboratorio de Análisis
Instrumental
Barranquilla, Colombia
Noviembre 29 de 2020

I. ITEMS DEL INFORME

RESUMEN la longitud de onda, constituye una verdadera

Un espectrofotómetro es un instrumento con el seña de identidad de cada sustancia o molécula.
que se apoya la espectrofotometría para medir la
cantidad de intensidad de luz absorbida después 2. OBJETIVOS
de pasar a través de una solución muestra.  Identificar las partes de un
La siguiente práctica consiste en la identificación espectrofotómetro UV-VIS y los
de un espectrofotómetro, el funcionamiento, sus diferentes tipos de cubetas porta
partes, software. Se empleó un simulador para muestra.
obtener la concentración y la absorbancia de  Obtener el espectro de absorción del
diferentes muestras de Cl₂Co para resolver los Cl₂Co * 6 H₂O y determinar, a partir del
diferentes interrogantes propuestos con la ayuda espectro el coeficiente de absortividad
de la Ley de Beer. molar y la concentración de una muestra
problema.
PALABRAS CLAVES  Determinar el efecto de la concentración
Absorbancia, absortividad molar, concentración, con la absorbancia empleando la ley de
cubeta, disoluciones, espectrofotómetro, Ley de Beer.
Beer, longitud de onda.
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO
1. INTRODUCCIÓN  Vaso de precipitado 50 mL
 Matraz aforado de 25 mL
La Espectrofotometría es el conjunto de  Pipeta aforada de 10 mL
procedimientos que utilizan la luz para medir  Ayuda de pipeteo
concentraciones químicas. Es una de las técnicas  Disolución de Cl₂Co * 6 H₂O.
experimentales más utilizadas para la detección  Agua destilada
específica de moléculas. Se caracteriza por su  Espectrofotómetro UV-VIS 1900
precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a Shimadzu Cubetas para UV
moléculas de distinta naturaleza como: fármacos,  Simulador PhET
contaminantes, biomoléculas, entre otras. La
absorción de luz se puede utilizar en química 4. PARTE EXPERIMENTAL
analítica para la caracterización y determinación Espectro de absorción del Cl₂Co * 6 H₂O a
cuantitativa de sustancias. En esta región del diferentes concentraciones.
espectro electromagnético (UV-VIS), las 1. Tomar nota de los componentes y el
moléculas se someten a transiciones electrónicas. funcionamiento del espectrofotómetro,
Cuando una molécula absorbe un fotón en este las cubetas que se emplean para colocar
intervalo espectral, se excita pasando un electrón muestra y el software para controlar el
de un orbital del estado fundamental a un orbital equipo.
excitado de energía superior. Como la energía se 2. Agregar en una cubeta agua destilada, la
conserva, la diferencia de energía entre el estado cual se utilizará como blanco y en otra
fundamental de la molécula y su estado excitado cubeta agregar disolución de Cl₂Co * 6
debe ser exactamente igual a la energía del fotón. H₂O (Muestra 1).
Cada sustancia absorbe la luz de una manera 3. Medir el espectro de absorción del Cl₂Co
diferente (dependen de su estructura electrónica) * 6 H₂O a partir de la Muestra 1.
y por lo tanto existe una relación única y 4. Tomar 10 mL de la disolución de Cl₂Co *
específica entre la sustancia y su espectro de 6 H₂O, trasvasarlo a un matraz aforado
absorción, es decir, la luz absorbida en función de de 25 mL y llevar hasta el aforo con agua

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 destilada (Muestra 2). Medir el espectro ley de Beer.
de absorción del Cl₂Co * 6 H₂O de esta
nueva disolución.
5. De la muestra 2, tomar 10 mL de la
disolución de Cl₂Co * 6 H₂O, trasvasarlo a
un matraz aforado de 25 mL y llevar
hasta el aforo con agua destilada
(Muestra 3). Medir el espectro de
absorción del Cl₂Co * 6 H₂O de esta
nueva disolución.
6. Escoger a partir de los espectros
obtenidos, la longitud de onda de
máxima absorbancia, a dicha longitud de
onda medir la absorbancia de las La absorbancia está relacionada con la
muestras 1, 2, 3 y una muestra problema concentración de la sustancia, c, por la ley de
de concentración desconocida. Anotar Lambert-Beer, que se resume con la ecuación: A =
los correspondientes valores de ε b c. Están relacionadas directamente, a medida
absorbancia frente a concentración para que se aumenta la concentración, aumenta la
hacer una recta de calibrado. absorbancia.

3. Determinar el coeficiente de
5. PARA EL INFORME absortividad molar del Cl₂Co * 6 H₂O a la
1. Realizar los cálculos correspondientes longitud de onda máxima, usando la
para establecer la concentración de la absorbancia de la muestra 1 a la misma
muestra 2 y 3. longitud de onda.
A
La concentración de la muestra 2 es de 90 nM y la A=εbc → ε=
b.c
de la muetsra 3 es de 135 nM. Estos datos se
obtuvieron en el simulador. ε=
1.45 L∗cm−1
=7.25
Muestra 2. 1cm . 0.2 M mol

4. Representar la absorbancia a longitud de

onda máxima de las disoluciones 1,2 y 3
frente a la concentración y ajustar los 3
puntos a una recta por el método de
mínimos cuadrados. A partir de la
regresión lineal obtenida, determinar la
concentración de la muestra problema.

Muestra 3. Absorbancia vs concentración

1.6
f(x) = − 0.73 x + 2.32
1.4 R² = 0.89
1.2
Absorbancia

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
2. Graficar los espectros de absorbancia a Concentración
las diferentes concentraciones (en una
misma gráfica) y discutir el efecto de la
concentración en la absorbancia según la
y = mx + b → y = -0,725x + 2,32

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Abosrbaancia = 1.45
λ Max= 549nm
y – 2,32 1,45−2,32
X= → =1 , 2 M
−0,725 −0,725
6. INTERROGANTES
1. ¿Cuál es la relación entre absorbancia
y transmitancia?
La transmitancia (T) de una sustancia en
solución es la relación entre la cantidad de
luz transmitida que llega al detector una vez
que ha atravesado la muestra, It, y la
cantidad de luz que incidió sobre ella. La
transmitancia nos da una medida física de la
relación de intensidad incidente y transmitida
al pasar por la muestra.
La absorbancia (A) es un concepto más
relacionado con la muestra puesto que nos
indica la cantidad de luz absorbida por la
misma, y se define como el logaritmo de 1/T,
en consecuencia:
A = log 1/T = -log T = -log It/ Io
La transmitancia óptica se refiere a la
cantidad de luz que atraviesa un cuerpo, en
una determinada longitud de onda. Cuando
un haz de luz incide sobre un cuerpo
traslúcido, una parte de esa luz es absorbida
por el mismo, y otra fracción de ese haz de
luz atravesará el cuerpo, según su
transmitancia.
La transmitancia se relaciona con la
absorbancia (o absorbencia) A como:
o componentes en la muestra que también
Donde T% es el porcentaje de transmitancia y
T es transmitancia en "tanto por uno".
El término transmisión se refiere al proceso
físico de la luz pasando por una muestra,
mientras que transmitancia se refiere a una
cantidad matemática.
2. Explique la ley de Beer e identifique los
factores que causan que la relación de
dicha ley no sea lineal.
La ley de Lambert-Beer establece que la
absorbancia está directamente relacionada
con las propiedades intrínsecas del analito,
con su concentración y con la longitud de la
trayectoria del haz de radiación al atravesar
la muestra. La expresión matemática de la ley
de Lambert-Beer es:
A=εbc
Dónde:
A = Absorbancia de la muestra
C = Concentración del cromóforo (mol/L)
b = Longitud del paso óptico que contiene la
muestra
ε = Absortividad molar
La ley de Lambert-Beer es necesario
seleccionar previamente una longitud de
onda puesto que tanto A como ε varían con
ella. Para ello se obtiene previamente el
espectro de absorción de la sustancia, que
consiste en una representación de los valores
de absorbancia frente a la longitud de onda
expresada en nanómetros (nm). Del espectro
de absorción puede seleccionarse el valor de
longitud de onda para el cual la absorbancia
es máxima.
• Si la solución del analito es concentrada se
pierde la relación lineal entre la A y la c, las
moléculas muy próximas entre si comienzan
a interferir entre ellas en el proceso de
absorción de energía.
• Se pierde la relación lineal entre A y c
cuando existen interferencias en la solución,
tales como: asociación o disociación del
analito en solución, reacciones del analito
con el solvente, presencia de otros
absorben luz incidente.
3. Exprese las siguientes absorbancias en
términos de % de transmitancia.
A=−logT
T =10−A
%T =T ×100
a. 0.0356
T =10−A =10−0,0356 =0,9212
%T =0,9212 ×100=92,12 %
 b. 0.895

T =10−A =10−0,0356 =0,9212

%T =0,9212 ×100=92,12 %

c. 0.379

T =10−A =10−0,379=0,4178
%T =0,4178 × 100=41,78 %

d. 0.753
 Fuente de luz: La fuente de luz que
−A
T =10 =10 −0,753
=0,1766 ilumina la muestra debe cumplir con
las siguientes condiciones:
%T =0,1766 × 100=17,66 %
estabilidad, direccionabilidad,
distribución de energía espectral
4. Convierta los siguientes datos de
continua y larga vida. Las fuentes
transmitancia en absorbancias
empleadas son: lámpara de
wolframio (también llamado
A=−logT tungsteno), lámpara de arco de
xenón, lámpara de deuterio y
lámpara LED que se utilizan en los
a. 27.2% laboratorios.
 Monocromador: sirve para dispersar
A=−logT =−log ( 27.2 % )=0,5654 la luz separando las longitudes de
onda que la componen, y selecciona
una banda estrecha de longitudes de
b. 0.579 onda, que es la que atraviesa la
muestra y llega al detector. Se usa
para obtener luz monocromática
A=−logT =−log ( 0.579 )=0,23 73 Está constituido por las rendijas de
entrada y salida, colimadores y el
c. 3.98% elemento de dispersión. El
colimador se ubica entre la rendija
de entrada y salida. Es un lente que
A=−logT =−log ( 0.579 )=0,23 73 lleva el haz de luz que entra con una
determinada longitud de onda hacia
un prisma el cual separa todas las
d. 0.093 longitudes de onda de ese haz y la
longitud deseada se dirige hacia otra
lente que direcciona ese haz hacia la
A=−logT =−log ( 0,093 )=1,0315 rendija de salida.
 Cortador: es un espejo rotatorio que
dirige el haz de luz
5. Dibuje un esquema de un  Detector: produce una señal
espectrofotómetro para UV-VIS de doble eléctrica cuando incide en él un haz
haz y explique brevemente cada una de de fotones. es el encargado de
sus partes captar la radiación y, a su vez,
dejarla en evidencia para su estudio
posterior. Existen dos tipos:
a) los que responden a fotones;
b) los que responden al calor.

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  Compartimiento de muestras: Es el
componente de espectrofotómetro
donde se desarrolla la interacción,
es decir, donde se coloca la muestra
que se va a trabajar.
 Fotodetectores: son los que reciben
la señal de manera simultánea con
el espectro visible, con el fin de
reducir el tiempo de medida y
minimizar las otras partes del
aparato.
 Cubeta para la muestra: Son los
recipientes donde se depositan las
muestras líquidas a analizar. El
material del cual están hechas varía
de acuerdo a la región que se esté
trabajando; son de vidrio o plástico
si se trabaja en la región visible, de
cuarzo si se trabaja en la ultravioleta
y de NaCl si se trabaja la región de
infrarrojo. Se caracterizan por tener
dos paredes correspondientes a los
lados ópticos por donde cruza el haz
de luz.
6. ¿Para qué sirve el monocromador en un
equipo de UV?
Un monocromador sirve para dispersar la luz
separando las longitudes de onda que la
componen, y selecciona una banda estrecha
de longitudes de onda, que es la que
atraviesa la muestra y llega al detector. Se
usa para obtener luz monocromática.
Está constituido por las rendijas de entrada y
salida, colimadores y el elemento de
dispersión. El colimador se ubica entre la
rendija de entrada y salida. Es un lente que
lleva el haz de luz que entra con una
determinada longitud de onda hacia un
prisma el cual separa todas las longitudes de
onda de ese haz y la longitud deseada se
dirige hacia otra lente que direcciona ese haz
hacia la rendija de salida.
7. ¿Qué tipo de muestras se pueden
analizar por espectrofotometría de luz
UV-Vis?
Se pueden analizar muestras tanto líquidas
como sólidas o en suspensión pero las
muestras deben presentarse en disolución
con la concentración adecuada para el
análisis.
La espectrometría UV/Vis se utiliza
habitualmente en la determinación
cuantitativa de soluciones de iones metálicos
de transición y compuestos orgánicos muy
conjugados.
Las soluciones de iones metálicos de
transición pueden ser coloreadas (es decir,
absorben la luz visible) debido a que los
electrones en los átomos de metal se pueden
excitar desde un estado electrónico a otro.
Los compuestos orgánicos, especialmente
aquellos con un alto grado de conjugación,
también absorben luz en las regiones del
espectro electromagnético visible o
ultravioleta.
8. Los equipos de espectroscopia UV-Vis
emplean lámparas, ¿de qué
características?, ¿estas tienen una vida
útil?
Los equipos de espectroscopia UV-Vis si emplean
lámparas, entre ellas podemos encontrar
 La lámpara de deuterio, la cual produce
una intensidad adecuada en la región
ultravioleta. El funcionamiento de esta
lámpara se basa en la aplicación de una
corriente eléctrica a un gas, de tal
manera que origina que las moléculas
del gas colisionan con los electrones
provocando excitaciones electrónicas,
vibracionales y rotacionales, las cuales a
su vez generan la iluminación. La vida útil
de esta lámpara es de aproximadamente
1000 horas
 La lámpara de tungsteno, la cual
proporciona una intensidad adecuada en
toda la región visible e infrarrojo, este
tipo de lámpara tiene muy bajo ruido y
poca deriva. Su funcionamiento se basa
en hacer pasar una corriente eléctrica a
lo largo de un filamento de tungsteno, lo
cual incrementa su temperatura y
produce la emisión de energía. La
lámpara de tungsteno tiene una vida útil
de aproximadamente 10 000 horas
 La lámpara de arco de xenón, la cual
proporciona una intensidad continua a lo
largo de todo el espectro ultravioleta-
visible. Su funcionamiento se basa en la
ionización del xenón, debido a una
descarga eléctrica entre dos electrodos
de tungsteno. Una desventaja de esta
fuente es que posee un mayor ruido
comparada con las lámparas de deuterio
y tungsteno
 La lámpara de mercurio, la cual tiene el
mismo principio de funcionamiento de la
lámpara de deuterio, se utiliza para la
 calibración de la escala de longitud de
onda de algunos espectrofotómetros UV-
Vis.
9. Si se perturba una molécula con
radiación dentro del rango de la región
ultravioleta, ¿qué le sucede a la
molécula? Explica esto mediante un
diagrama
La molécula puede absorber una parte de la
radiación. Cada frecuencia de dicha radiación
tiene una energía propia hv. Si el compuesto
contiene algún nivel energético que
corresponda exactamente a una frecuencia
determinada, este absorbe radiación
pasando de un estado basal a un estado
excitado.
Entonces decimos que, la energía absorbente
en la región ultravioleta produce cambios en
la energía electrónica de la molécula que
resulta de las transiciones de electrones de
valencia en la molécula. Estas transiciones
consisten en la excitación de un electrón
desde un orbital molecular lleno al siguiente
orbital de energía mayor.
El espectro UV puede dar información de la
presencia o ausencia de determinados grupos
funcionales (cromóforos) en los compuestos
orgánicos. La energía usada (UV) para excitar
los electrones también provoca cambios
vibraciones y rotatorios en las moléculas
10. Al decir que hay una región de energía
en el ultravioleta, ¿a qué nos referimos
exactamente en cuanto a las longitudes
de onda, que hay en la región?
Un haz de energía luminosa está formado por
radiaciones de diferente longitud de onda y
frecuencia que abarcan el espectro
electromagnético. De acuerdo con la longitud
de onda de las radiaciones se forman las
diferentes regiones.
La región UV se define como el rango de
longitudes de onda de 200 a 400 nm. Es una
región de energía muy alta. La longitud es
inversamente proporcional a la frecuencia.
Las longitudes de onda en la región
ultravioleta generalmente se indican en
nanómetros (lnm=10-7 cm) o angstroms,
(1A= 10-8 cm). Ocasionalmente, la absorción
se indica en números de onda; La atmósfera
es transparente en esta región que resulta
ser fácilmente accesible con la óptica del
cuarzo.
11. Menciona algunas aplicaciones
industriales para la espectrofotometría
de luz UV/Vis.
 Determinación de grupos
funcionales en moléculas orgánicas
 Análisis de muestras bioquímicas
 Determinación de metales en
compuestos de coordinación
 Análisis de semiconductores
 Medidas de color
 Determinación cuantitativa
 Seguimiento de la cinética de
procesos químicos y bioquímicos
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  Determinación de la estabilidad b = 10 mm = 1 cm
térmica de aceites vegetales c = 1,28 x10-4 mol/L
 Determinación de ácidos nucleicos ε=?
como ADN y ARN
 Calibración con patrones de A 0.30
ε= = =
concentración conocida b . c 1cm .1,28 x 10−4 mol /L
 Cuantificación de 2.343,75 L/mol-1 cm-1
macrocomponentes
 Determinación de pigmentos b. Si se duplica la concentración,
calcular la absorbancia y la
transmitancia de la nueva
7. EJERCICIOS disolución.
1. Una agua contaminada contiene cromo
C duplicada = 2,56 x10-4 mol/L
(M= 52 g/mol) en una concentración
másica aproximada de 0,1 ppm. Se elige, A=εbc
para su determinación, el complejo de
CrVI con la difenilcarbazida (lmax= 540 A = 2.351,79 L mol-1 cm-1 . 1 cm * 2,56 x10-4
nm, emax= 41700 L•mol-1 •cm-1 ). mol/ L
Proponer un valor de trayecto óptico de
la cubeta para que la absorbancia sea del A = 0.60
orden de 0,40.
T = anti Log - 0.60

A T = 0.25
A=εbc →→ ε =
b.c
A = 0,40 8. CONCLUSIONES
mg 1g
c = 0.1 ppm = 0.1 x x 9. REFERENCIAS
l 1000 mg
1 mol Cr  HARRIS, Daniel. Análisis químico
=¿ 1.9231 x10-6 mol/L
52 g/mol cuantitativo. 3 ed. Barcelona, España:
Editorial Reverté, S.A., 2006.
ε = 41700 L•mol-1 •cm-1

b =?  Skoog D, Holler F, Crouch S. Principios de

Análisis Instrumental. Cengage Learning
b = Editores, 6ta edición. México 2008.
A 0.40
=
ε . c 41700 L •mol−1 •cm−1 . 1.9231 x 10−6 mol /L  Colaboradores de Wikipedia. (2020, 14
octubre). Espectrofotómetro. [en línea]
b = 0.5 cm [citado 27 de Nov., 2020]. Disponible en:
https://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofo
t%C3%B3metro#Monocromador
2. Una disolución acuosa de permanganato
de potasio (c=1,28 x10-4 mol/L) presenta
 Colaboradores de Wikipedia. (2019, 27
una transmitancia de 0,5 a 525 nm, si se
noviembre). Transmitancia. [en línea]
utiliza una cubeta de 10 mm de trayecto
[citado 27 de Nov., 2020]. Disponible en:
óptico.
https://es.wikipedia.org/wiki/Transmitan
a. Calcular el coeficiente de
cia
absortividad molar del
permanganato para esta longitud de
 Instituto Nacional de Metrologia de
onda.
Colombia (INM), Red Colombia de
Metrología, Organización de acreditación
A de Colombia, Mincomercio. (Bogotá)
A=εbc →→ ε =
b.c
 GUÍA DE CALIBRACIÓN DE
ESPECTROFOTÓMETROS UV-Vis
A = -log T = -log 0,5 = 0,30
INM/GTM-FR-E/01 [en línea] [citado 27
 de Nov., 2020]. Disponible en:
https://www.inm.gov.co/nueva/wp-
content/uploads/2019/12/Guia_calibraci
on_UV-VIS2019.pdf

 DÍAZ, Nieves. BÁRCENA, Antonio.

FERNÁNDEZ, Emilio. GALVÁN, Aurora.
JORRÍN, Jesús. PEINADO, José.
MELÉNDEZ, Fermín. TÚNEZ, Isaac. (s. f.).
Espectrofotometría: Espectros de
absorción y cuantificación colorimétrica
de biomoléculas [en línea] [citado 27 de
Nov., 2020]. Disponible en:
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-
biol-
mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pd
f

 Universidad de Alicante. (s. f.).

ESPECTROSCOPÍA ULTRAVIOLETA
VISIBLE. Servicios Técnicos de
Investigación. [en línea] [citado 27 de
Nov., 2020]. Disponible en:
https://sstti.ua.es/es/instrumentacion-
cientifica/unidad-de-rayos-x-de-
monocristal-y-espectroscopias-
vibracional-y-optica/espectroscopia- Muestra 2.
ultravioleta-visible.html

 GARCÍA, Magdalena. (2016). Apuntes

para Espectrometría de Radiación
Ultravioleta Visible (UV/VIS). [en línea]
[citado 27 de Nov., 2020]. Disponible en:
http://ri.uaemex.mx/bitstream/handle/2
0.500.11799/68318/secme-1814.pdf?
sequence=1&isAllowed=y

 Introducción a la espectroscopía
molecular [en línea] [citado 27 de Nov.,
2020]. Disponible en:
http://www.uco.es/organiza/departamento
s/quimica-fisica/quimica-
fisica/QuiFis/L14_QF_10_11.pdf

 Espectrofotometría [en línea] [citado 27

de Nov., 2020]. Disponible en:
https://aulavirtual.agro.unlp.edu.ar/plugi
nfile.php/43546/mod_resource/content/
3/Espectrofotometr%C3%ADa
%202019%20versi%C3%B3n%20final.pdf

10. ANEXOS
Muestra 1.
Muestra 3.

Página 8 de 9
Muestra 4.

Muestra 5.