13.

3 ENSAYOS BASADOS EN HIBRIDACIÓN

Usa la metodología de la sonda génica que aprovecha que el adn se puede desnaturalizar(adn
queda en dos cadenas simples) y reasociar .
Las sondas génicas consisten en ADN monocatenario (virus en el que el material genético
está compuesto por ADN de cadena sencilla y se replica usando una ADN polimerasa
dependiente del ADN, no usando ARN como intermediario durante la replicación) se
pueden usar par a identificar la presencia de una secuencia de ac nucleico determinado dentro
de una muestra

Aplicaciones ambientales de las sondas:

-(1) examen de la diversidad microbiana del suelo

-(2) identificación de un genotipo particular

-(3) pruebas de genes de virulencia de patógenos sospechosos

Se habla de la construcción de sondas de genes junto con algunas aplicaciones practicas

13.3.1 Selección de marcador

Según el objetivo de estudio las sondas pueden diseñarse para dirigirse a varios genes.

La secuencia de objetivo puede ser única para una especie microbiana particular, allí la sonda
génica permitiría detectar la presencia de ese mo en una muestra ambiental

Alternativamente el gen de objetivo puede codificar la producción de una enzima exclusiva de

una ruta metabolica, allí la sonda génica permite detectar (con resultados positivos) q la
muestra tiene el potencial genetico para esa actividad.  SONDA DE GEN FUNCIONAL (ej:
sonda hecha para ser complementaria a genes q codifican enzimas involucradas en fijación de
Nitr)

Solo se detecta el potencial genetico, no la expresión del gen (q requiere detección de ARNm) o
la actividad real (requiere ensayos de actividad enzimática)
Sondas diseñadas contra secuencias especificas de ARNr,  SONDAS FILOGENETICAS pueden
ser especificas de grupos de bacterias o para detectar un dominio completo  SONDAS
UNIVERSALES

13.3.2 Construcción y detección de la sonda

Estrategia: obtener secuencia de un gen objetivo y desp seleccionar una porción de esa
secuencia para usarla como sonda. Como cada vez hay mas secuencias residentes en las bases
de datos, cada vez es mas fácil el disenar las sondas.

Imagen: muestra el crecimiento de los datos de secuencia en bases de datos

Cuando ya tenes la secuencia objetivo, esta y otras secuancias para el mismo obj en otros
organismos se importan a otro programa y allí se alinean lase secuencias.
Tam: 20-100 pares de bases

Una vez seleccionada la sonda se sintetiza y se marca p/poder detectase post hibridación con la
secuencia de objetivo. Marcado: radioactividad (marca la sec con sust quim radiac 32P), no
radioactivas: digoxigenina,biotina, fluorescencia (se incorporan a la secuencia mediante síntesis
química). Los dif marcadores se detectan con la unión del respectivo anticuerpo o conjugado de
.. q cuando reacciona con el sustrato apropiado dará una señal

13.3.3 Transferencias de puntos, del sur y del norte

Tambien llamada hibridación de puntos: Tecnica usada para evaluar presencia/ausencia de una
secuencia de ac nucleico especifica en un cultivo microbiano( se saca el ac nuc del cultivo , se
pone sobre un filtro de nitrocelulosa y desp se sondea) o para cuantificar el objetivo (la
intensidad de la hibridación dará una estimación de la cant de secuencias en una muestra
cuando se compara con estándares similares)

Para hacer una hibridacion de colonias se presiona un poquito una membrana de nailon cobre
placa de Petri para q algunas células bacrterianas se adhieran a la membrana.

Desp las cells se lisan directamente sobre la membrana y el ADN se fija al filtro y desp se
desnaturaliza en 2 cadenas simples. La sonda génica se desnaturaliza de manera similar y desp
se agrega a la membrana. Luego el ADN se vuelve a rejuntar , e idealmente la hebra singular de
la sonda génica se une con el adn de la secuencia obejtivo de las cells bacteriales.
Desp se lavala membrana para eliminar la sonda sin hibridar , el filtro se somete a la detección
de la sonda. Luego solo las colonias q contienen la sec de adn especifica dan una señal. Como
la placa de Petri orioginal tienen las colonias intactas correspondientes, ahora se puede
identificar, aislar y conservar la colonia viable de interés para su posterior estudio.
Hay veces q es importante sepaear preimero el adn o arn objetivo en fracciones de dif tamaños
antes del sondeo (ej, es impotante saber si un gen se transporta en un plasmido o cromosoma)

Cuando el objetivo es el ADN, este proceso se conoce como transferencia Southern o

hibridación. De manera similar, la transferencia Northern, que detecta el ARN, puede usarse
en estudios de expresión génica para detectar la inducción de un gen específico.

3.3.4 Micromatrices
Microarreglos son colección de oligonucleótidos (o sondas de genes) q se “arreglaron” en un
portaobjetos de vidrio o en un chip. (en contraste con las hibridaciones mencionadas antes , las
sondas se unien a la matriz solida y los ac nucl de objetico luego se hibridan con las sondas
unidas.
Se pueden usar para ver presencia/abundancia de ADN y/o actividad de microorganismos
(ARNm).

2 tipos:

-matrices impresas(o machadas)

-matrices sintetizadas (in silicio)

Una vez producidas las sondas se depositan robóticamente en un portaobjetos de microarrays

y desp se unen químicamente al portaobjetos.

2 tipos de micromatrices + usadas para micro ambiental:

-Matrices de oligonucleotidos filogenéticos (POA): se basan en genes de ARNr y se usan para
detectar la presencia de organismos. El POA mas gde: Phylochipq se uso para caracterizar
comunidades microbianas en muestras de aire en aviones comerciales, golfo de mexico post
derrame petróleo, aguas subterráneas contaminadas con uranio

-Matrices de genes funcionales (FGA): se basan en genes relacionados directamente con un

proceso ambientalmente relevante. Utilizacion: Detecta presencia y actividad potencial de org
q pueden contribuir a proceso de interés , tamb como medida de la actividad microbiana si se
analiza el ARNm. (ej: GeoCHip contiene sondas q cubren 56990 secuencuas q representan gener
involucrados en ciclo biogeoquímico del C, N, y S, la degradación química organica y la
resistencia a los metales. Se uso en, golfo mexico, suelo de pastizales, remediación de aguas
subterráneas contaminadas con uranio.

Una vez construidos los microarreglos se pueden usar para caracterizar las comunidades
microbianas y determinar como interactian con su entorno .

IMAGEN:

muestra los pasos de un experimento de microarrays en el que el objetivo es caracterizar la

comunidad microbiana mediante la detección de secuencias objetivo.
1-saco el ADN de la muestra (se puede purificar/amplificar)
2-se marca el ADN con 1 molec fluorescente (como Cy3 o cy5)
3-el ADN marcado se desnaturaliza y se hibrida con las sondas dela micromatriz
4-se escanea la matriz para indicar el grado de hibridación
5-se comparan resultados con los de la hibridación de otras muestras p/det diversidad de la
comunidad, presencia de microorg o genes de interés/dinámica de la población.

Tambn microarrays se pueden usar para determ actividad microbiana. Aca el ARNm se saca de
2 muestras:
-Experimental (expuesta a un tratamiento, ej contaminante ambiental)
-De referencia/control (no ha sido expuesta a un tratamiento)
El ARNm se saca de ambas muestras se pasa a ADNc por transcripción inversa, se marca con 2
molec y se hibridan con la misma matriz. Luego se determina si la regulación ascendente o
descendente de cada gen en la muestra de tratamiento comparándole con la hibridación de la
muestra de control

Desafios q presentan: - sensibilidad de detección reducida (solo detectan miembros

dominantes de comunidades microbianas) -dificultad si tengo poca cantidad de ADN o ARNm
para análisis de micromatrices -especificidad mayor problema en micromatrices para muestras
ambientales (a dif de micromatr con cultivos puros, donde se conocen las secuencias
genómicas enteras) donde se sabe poco sobre sec de adn presentes en mayoría de muestras.
Esto quiere decir que las secuencias representan solo una peq fracción de las secuencias
presentes en una muestra determinada

13.3.5 Hibridación fluorescente in situ (FISH)

Sondas con marcadores fluorescente se usan para investigar cells in situ (en un cultivo o en una
muestra ambiental en una técnica llamada hibridacion fluorescente in situ (FISH))

Se agregan reactivos q facilitan la penetración de la sonda a traves de la membrana celular,

donde al final la sonda se hibrida con su secuencia de objetivo. Las cels q tienen la sec de
objetivo se ven bajo microscopio de fluorescencia o confocal.
dificultad: diferenciar señal de ruido de fondo (ej compuesto naturalmente fluorescente como
metales o minerales del suelo)