Huella genética humana mediante ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD) y

filogenia bioinformática en base al 12S ARNr de vertebrados

Human genetic fingerprint by random amplified polymorphic DNA (RAPD) and
bioinformatics phylogeny based on 12S rRNA of vertebrate
Angie Patricia Duarte Tayo
Johan Sebastián Villarraga Jiménez
Estudiantes de Biología Marina, Facultad de Ciencias e Ingeniería. Universidad de Bogotá
Jorge Tadeo Lozano, Carrera 87A # 6A – 15. E-mail: angiep.duartet@utadeo.edu.co;
johans.villarragaj@utadeo.edu.co

Resumen
La huella genética mediante la técnica RAPD comprendió dos etapas, la extracción
de la muestra de ADN y la preparación del MIX de PCR para RAPDs, el ADN se extrajo a
partir de células de la mucosa bucal de 16 sujetos con la ayuda de un enjuague de solución
salina con NaCl al 0.9% luego de una serie de sometimientos a centrifuga el pellet de la
muestra que contenía el ADN fue usado para el MIX de PCR, dicho MIX se depositó en el
termociclador al cual se le selecciono el programa RAPDs que comprende 3 fases de
sometimiento a tiempos y temperatura que permiten la amplificación de los fragmentos
de ADN, posteriormente se realizó electroforesis en gel de agarosa para RAPDs y en la
muestra de ADN para determinar su calidad, los resultados arrojaron contaminación por
estructuras celulares ajenas al ADN en las muestras JB, CG y VR, la determinación de
huella genética solo fue satisfactoria para 9 individuos lo que pudo deberse a la pureza del
material genético, las huellas genéticas fueron diferentes entre individuos pero entre
algunos individuos como AD-CS y LG-MC hubo similitud en el análisis de clúster; en cuanto
a la filogenia mediante el uso de bioinformática se tomaron datos del 12S ARNr de 25
organismos del phylum vertebrados y se realizó un análisis in sillico con diferentes
software de bioinformática en línea y así se determinó con un ayuda de un árbol el
parentesco que presentaba cada una de las especies en su genoma.

Palabras clave: RAPD, 12S ARNr, bioinformática, molecular fingerprinting, filogenia.

Abstract

Key words: RAPD , 12S rRNA , bioinformatics, molecular fingerprinting , phylogeny.

Introducción

El ribosoma consta de dos subunidades, una grande y una pequeña, formadas por
el ensamble de varias proteínas diferentes entre sí y de una o dos moléculas de ARN. El
tamaño y coeficiente de sedimentación (S) de estas subunidades varían según su origen,
la subunidad grande tiene dos moléculas de RNA de 28S y 18S en las células eucarióticas y
de 26S y 16S en las procarioticas, la pequeña es de 5S (Pena, 1988); El número de copias
de ADNr presentes en el genoma es variable en los diferentes organismos por esta razón
la secuenciación del mismo y los estudios basados en su hibridación del mismo han
permitido desarrollar estudios taxonómicos (Reinheimer y Zalazar, 2006). La técnica de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) consiste en la multiplicación in vitro de
secuencias específicas de ADN utilizando la actividad enzimática de la ADN polimerasa,
generalmente la secuencia a amplificar suele ser la que codifica para el 16S rRNA en
procariotas y para eucariotas l de 18SrRNA (Elosegui, 2009), en el caso de este estudio
para la realización del árbol filogenético se usó la sub unidad de ARN ribosomal 12S.
Un marcador molecular es una característica visible en un individuo que indica la
constitución de un gen en particular con el suficiente número de marcadores se puede
construir un mapa de ligamiento genético, los primeros marcadores utilizados fueron las
isoenzimas, que son enzimas que comparten el mismo substrato especifico, pero difieren
en su movilidad electroforética. Los RFLP y los RAPD (ADN amplificado al azar)
representan una nueva clase de marcadores moleculares con los cuales se es posible
analizar el genoma de manera directa, los RFLP y RAPD permiten estudiar la segregación
de regiones homologas del genoma de un individuo en una población segregante como un
retro cruce los requisitos son los mismos para ambos aunque los RAPDs requieren de un
conjunto de primers para actuar, ambos son utilizados en estudios de ligamiento y
biodiversidad (Moncada, 1992).
La Bioinformática es una disciplina cuyos orígenes se remontan a los primeros
análisis con ordenador de las secuencias de ADN y proteínas. El enfoque principal de esta
rama de la ciencia es el de aplicar la computación y las ciencias artificiales a las ciencias
biológicas (Lahoz, 2010). Es usada comúnmente para analizar, organizar entender e
integra la información derivada de la biología molecular como lo es datos de secuencias,
estructuras e interacciones entre distintos componentes genéticos etc. Como propósito
final la bioinformática tiene el objetivo de facilitar el descubrimiento de nuevas
propiedades biológicas así como el de proporcionar perspectivas a partir de las cuales sea
más fácil crear principios de unión en la Biología (Pallas et al, 2008).
El desarrollo de árboles filogenéticos con enfoque molecular comprende las
relaciones que no pueden ser explicadas por la anatomía comparada por lo que es capaz
de desvelar las relaciones evolutivas entre grupos que tienen pocos puntos en común para
una comparación morfológica, como los seres humanos y las bacterias. la sistemática
molecular permite a los científicos comparar la divergencia genética dentro de una
especie, la capacidad de los arboles moleculares en abarcar grandes periodos de tiempo
se basa en que diferentes genes evolucionan a tasas diferentes incluso en el mismo linaje
evolutivo, como ejemplo está el ADN que codifica el ARN ribosomal cambia relativamente
poco, por lo que la comparación de las secuencias en estos genes sirven en la
investigación de las relaciones entre taxones, por otro lado el ADN mitocondrial
evoluciona de manera rápida y es usado en la exploración de sucesos evolutivos recientes
(Campbell y Reece, 2007)
 El objetivo del estudio fue el de familiarizarse con los marcadores moleculares tipo
RAPDs en la obtención de un fingerprinting humano, además de reconocer las
herramientas bioinformáticas en el desarrollo de alineamientos de secuencias evolutivas
del 12S RNA en diferentes especies animales.

Materiales y métodos

El estudio se dividió en dos etapas el uso de RAPDs como marcadores moleculares

y bioinformática, en la primera etapa se realizó una extracción de ADN humano a partir de
enjuague bucal salino en esta 16 sujetos tomaron 10 ml de solución de NaCl 0.9% durante
1 minuto, se transfirieron 1000 µl a un tubo eppendorf de 1.5 ml se centrifugo a 10000 revol/m
por 1.5 minutos, se desechó el sobrenadante y se adicionaron 30 µl de solución salina al pellet, se
resuspendio por pipeteo seguidamente se tomaron 30 µl de la suspensión celular y se adicionaron
en un tubo con 100 µl de Chelex 10% se mezcló con vortex y se calentó a baño maría por 10
minutos a 99°C luego se centrifugo a 10000 revol/m durante 1 minuto y se transfirieron 30 µl de
sobrenadante a un tubo eppendorf limpio de 1.5 ml. Luego de esto se realizó un MIX de PCR al que
se adicionaron buffer de PCR 2.5 µl, MgCl2 1.5 µl, primer OPA 7 1 µl, Taq polimerasa 0.2 µl, dNTPs
4 µl, ADN molde 1 µl, agua destilada 14.8 µl, estos tubos de PCR se colocaron en un termociclador
y se seleccionó el programa RAPDs se corrió y comprendió 3 fases (Fase I: 96°C X 5 min; Fase II:
96C X 40 seg °C y 36°C X 40 seg además de 40 ciclos a 72°C x 1.3 minutos; Fase III: 72°C X 4 min) y
finalmente se realizó electroforesis en gel agarosa con el marcador de peso Hyperladder II.

En la segunda etapa de bioinformática se analizó el ARNr 12S de 25 organismos del

phylum vertebrados los cuales fueron:

Como primer paso para el análisis se procedió a abrir un navegador de internet y

se ingresó a la página NCBI (National Center for Biotechnology Information). Una vez
dentro de la página, en la casilla de búsqueda se introdujo el código previamente
obtenido del ADN mitocondrial de cada una de los individuos para los que no se conocían
los códigos, se escribió el nombre científico más las palabras 12S rRNA. Después que
aparecía el genoma completo de cada individuo, se buscaba allí la porción del genoma que
pertenecía al 12S y se copiaba en formato FASTA en un documento Word. Al iniciar cada
secuencia se colocaba el nombre científico separado por un guion bajo y el signo mayor
que “>” antes de cada nombre. Después de tener las 25 secuencias se volvió al navegador
y se buscó el software CLUSTAW la versión de Japón. Allí en la casilla de análisis se
introdujo las secuencias (las 25 a la vez) con sus respectivos nombres y se oprimió en la
casilla “execute multiple alignment” allí el programa arrojaba datos de las secuencias
repetitivas de cada especie. En esa ventana se hizo clic y se escogió la opción “rooted
phylogenetic tree (UPGMA)” el cual arrojo el árbol según el parentesco de su rARN.
Posteriormente a esto se volvió al navegador y se buscó el software PRIMER3, para
la creación de los cebadores para las secuencias de los organismos. Acto seguido en esta
página se cambió la opción “Product size ranges” a 700-800 pb. Luego se en la ventana de
analisis se introdujeron las 25 secuencias, sin los nombres y se le dio clic en “pick
primers” para así obtener los mejores primers para todas las secuencias. Luego se volvió al
buscador y se fue hacia la página IPCR para obtener un PCR virtual de las secuencias, se
colocaron las secuencias en la ventana de análisis y los cebadores (normal y reverso) en
las casillas correspondientes y se dio clic en “run IPCR” y se esperó los resultados.

Este estudio se realizó en los días 18 marzo y 25 de marzo del 2015 en el

laboratorio de biología molecular y sala de cómputo 304-7ª de la universidad de Bogotá
Jorge Tadeo Lozano, en Bogotá, Colombia.

Resultados
La calidad de ADN extraído de la mucosa bucal de los 16 sujetos se muestra en la
figura 1. en esta se puede observar que las muestras JV, AD, AC,JZ y CO son altamente
puras ya que no hay gran corrido de moléculas ajenas al ADN como si se observa en las
muestras JB, CG y VR en las cuales las partículas que corrieron en el gel pueden atribuirse
a proteínas o demás componentes celulares de la mucosa bucal.

Figura 1. Calidad del ADN

En la figura 2 se muestra el ADN de los sujetos luego de la amplificación con
marcadores moleculares tipo RAPD esta fue satisfactoria solo para 9 de los 16 sujetos (JV,
AD, JS, CG, CS, JM, LG, MC, GR), para la mayoría de los sujetos con calidad de ADN baja la
técnica no fue satisfactoria (JB, JM, JP) aunque para algunos como CG la amplificación fue
apreciable.
Figura 2. Marcador RAPD
Con la ayuda de la amplificación mostrada en los marcadores RAPD para facilitar el
análisis de datos se realizó una matriz de datos a partir de la presencia ausencia de bandas
en el gel (véase tabla 1. En la sección de anexos) dicha matriz fue analizada en el programa
estadístico Statgraphics centurión X.V. en el que por métodos multivariados se realizó un
análisis de conglomerados con el método del vecino más cercano y la distancia
matemática tipo euclideana cuadrada el resultado final fue el dendograma que se muestra
en la figura 3. En este se puede observar que las bandas en los sujetos LG, GR y MC son
más parecidas entre sí que las demás, además se ve que los individuos con amplificaciones
más similares son AD-CS y LG-MC lo que se puede deber a linaje evolutivo entre los
sujetos.
Dendograma
Método del Vecino Más Cercano,Euclideana Cuadrada

50

40
Distancia

30

20

10

0
CS

JV

JS

MC
AD

GR
CG

LG
JM

Figura 3. Dendograma final de RAPDs

Figura 4. Filogenia obtenida a partir del 12S ARNr de vertebrados
En la figura cuatro se muestra la relación filogenética que existe entre 25
diferentes especies de vertebrados en base a la secuencia del ARN ribosomal 12S, se
observa el gran parentesco que existe en la familia de primates incluido el homo sapiens,
como también entre cetáceos los (P. catodon, B. physalus y B. musculus). Se observa La
relación que existe entre los organismos acuáticos (P. volitans H.erectus e H. coronatus).
Los rinocerontes (R. unicornis y E. simum) muy emparentados con los equinos en este caso
E. asinus. Los roedores (R. norvegious y O. cuniculus) comparten mucha similitud en su 12S.
Por otro lado se puede ver la gran similitud que existe en especies poco emparentadas
morfológica y ecológicamente hablando, como Canis lupus familiaris y Halichoerus grypus
y bus Taurus y los cetáceos.
Mapa de los mejores pares de oligonucleótidos. Fragmentos de 20 pares de bases obtenidos por el
software PRIMER 3 para las 25 secuencias 12S de los diferentes vertebrados trabajados en la
práctica de bioinformática (ANEXO).

PRIMER de caretta caretta

Primer izquierdo 5’ CCCAAGACACCTAGCTCTGC 3’

Primer derecho 3’ ACCTCAGGACCGGCTTAAAT 5’
OLIGO start len tm gc% any 3'
PRIMER IZQ. 130 20 60.01 60.00 4.00 2.00
PRIMER DER. 850 20 59.96 50.00 5.00 2.00
SEQUENCE SIZE: 973

La posición de inicio (start), el tamaño (len), la temperatura de melting (Tm), el porcentaje de G-C
(GC%) presentes para cada par de oligonucleótidos. (any) Máxima Complementariedad o auto
complementariedad Loca y (3’) Máxima complementariedad 3’ alineamiento Global Anclado en 3’.
Discusión
Tal como señala Velasco (2005) si bien existen diferentes técnicas empleadas en biología
molecular para el análisis del genoma, estas dependen en gran medida de la habilidad del
experimentador y de la técnica para extraer el ADN, además del tipo de tejido a emplear. Lo
anterior podría explicar las diferencias en la calidad de ADN extraído para los sujetos de prueba,
por lo que errores en el método explicarían la baja calidad de ADN en las muestras JB, CG y VR.
El método de RAPD al hacer apareamiento de PCR a bajas temperaturas puede generar
sesgos en los datos y aunque es un método simple y de bajo costo tiene dos desventajas, ser un
marcador tipo dominante en el que no se pueden discernir la heterocigocidad de los loci
estudiados y además es sensible a la calidad del ADN muestra esto podría explicar porque las
muestras que tenían baja calidad de ADN (JB, JM, JP) no tuvieron resultados en RAPD (Narváez et
al., 2000).
Los primers en los RAPDs son elegidos de manera arbitraria, los fragmentos que se
obtienen se visualizan como un patrón de bandeo característico del individuo y cada banda se
considera un locus por lo cual esta técnica es usada en la realización de fingerprinting, en el
estudio se obtuvieron 9 fingerprinting de humanos (AD, CS, JV, CG, JM, JS, GR, LG, MC), la
diferencia entre estos es debida a cambios en la secuencia de los sitios a los que se alinea el
primer y a la individualidad característica del organismo, que unas bandas (véase fig 2.) tuvieran
mayor tamaño que otras se debe a la inserción de nucleótidos en la secuencia intermedia entre los
sitios de acoplamiento esta eliminación produce un aumento o disminución en el tamaño de la
molécula amplificada por esto se observan bandas fuertemente apreciables en el gel y otras
bandas mucho más tenues (Rocha et al., 2014).
El dendograma resultante de la comparación de huellas genéticas de los 9 individuos
genera dos grupos AD, CS, JV, CG, JM, JS en el primero y GR, LG, MC en el segundo, estos
clúster indican cercanía genética entre dichos individuos, esto puede deberse a factores
ambientales o de herencia en los individuos, aun si los individuos tienen finger printing parecidos
estos no son idénticos y este polimorfismo en el ADN entre individuos puede deberse a 3 razones
en la técnica de RAPD, los primers no se adhirieron al sitio a amplificar, la presencia de un nuevo
primer y la longitud de la región a amplificar entre los sitios de los primers (Kumar y
Gurusubramanian,2011); tal como señalan Hadrys y Schierawater (1992) las ventajas de los RAPD
es su rapidez, no requieren conocimiento de la secuencia ni diseño de primers, se requiere poco
ADN pero las desventajas además de las ya mencionadas están la no adhesión del primer, la falta
de conocimiento sobre la identidad de las bandas amplificadas, problemas en la reproductibilidad
y que fragmentos de loci diferentes tengan el mismo tamaño por lo que no se separan los
fragmentos cualitativamente sino cuantitativamente, aun si las desventajas superan las ventajas
tal como en el estudio los RAPD siguen usándose para análisis de diversidad genética y
polimorfismos en ecología molecular, mapeo genómico, identificación de cultivos y demás; por las
razones mencionadas el análisis de diversidad genética en humanos siempre va a dar como
resultado diferencias entre individuos pero no explica el porqué de dichas disimilaridades (el
significado de la ausencia o presencia de cada banda encontrada) y debido a que como menciona
Mukandama y otros (2004) si bien los RAPD son herramientas poderosas en el estudio de
diversidad en secuencias de una población estos son más aplicados a organismos muy parecidos,
por eso como se mencionó se usan en identificación de cultivos ya que las plantas son más símiles
debido a la hibridación.

Como se sabe los métodos para estudiar la filogenia basados en el análisis de secuencias
de proteínas y ácidos nucleicos han producido un avance considerable en el conocimiento sobre la
biodiversidad en los últimos años. Sin embargo, su correcto uso tiene muchos problemas. Uno de
sus principales problemas es la discriminación total de la ecología de los individuos (Meléndez et
al, 1997). Como se presenta en los resultados de la figura 4 la foca gris (Halichoerus grypus) es el
pariente más próximo del perro común (Canis lupus familiaris) y la vaca común (bus taurus) la
más emparentada con los mamíferos acuáticos, ya que su secuencia 12S es altamente similar.
Teniendo en cuenta que todos son mamíferos tienen una alta similitud sin embargo las
condiciones de vida de una especie comparada con la otra, son totalmente diferentes, las focas
tienen hábitos de vida asociados al mar con una disposición morfológica un tanto diferente a las
de los perros, con hábitos terrestres y más parecidos a fenotípicamente al organismos como
roedores o equinos. Así ocurre con la vaca común que genotípicamente está más asociada a los
mamíferos acuáticos pero fenotípicamente es bastante diferente. También como dice Meléndez y
colaboradores (1997) esto puede deberse a la velocidad y las frecuencias de las mutaciones que
dieron lugar a la diferenciación de las especies y es necesario tener relojes moleculares para medir
los cambios evolutivos. Esto quiere decir que se debe tener un grupo externo para comparar las
diferencias y ver si la proximidad de los individuos es totalmente aseverativa. Así pues es necesario
tener un grupo externo para poder poner tan cerca evolutivamente hablando, a la foca gris y al
perro común o la vaca común y los mamíferos acuáticos. Otros autores como Gingerich (2001)
sustentan que a través del registro fósil por supuesto apoyado por los estudios moleculares y por
otros estudios muestran que las ballenas comparten un ancestro común con los animales
cuadrúpedos y con pezuñas, tales como las vacas y los hipopótamos pero por eventos evolutivos
muy rápidos no son tan semejantes con en realidad son. Esto corroboraría el parentesco del ARN
de Bus Taurus y el de las ballenas Balaneoptera physalus, Balaenoptera musculu y, Physeter
catodon
El árbol filogenético resultante para los demás individuos mostro una gran aproximación a
lo reportado por la literatura como por ejemplo señala Garrido (2008) el orden de los
perisodáctilos son el grupo de mamíferos que comprende equinos, tapires y rinocerontes por que
comparten característica tanto genotípicas como fisiológicas. Lo que se observa en el árbol con
con rhinoceros unicornis, ceratotherium simum y equus asinu. A pesar que los anfibios
representan el eslabón entre la vida en el medio acuático y la adaptación a la vida terrestre, en
conceptos anatómicos y fisiológicos los anfibios están más relacionados a los reptiles que a otro
grupo de vertebrados. Los reptiles y anfibios están lejanamente emparentados entre sí, y no
comparten muchas similitudes con un grupo inferior conocido como osteíctios (Samaniego et al,
2007). En lo representado en el árbol el anfibio Phyllobates terribilis está más relacionado con el
RNAr de los peces óseos que de las tortugas marinas caretta caretta y eretmochelyes imbricata
teóricamente debería estar más emparentada con las tortugas ya que son reptiles pero las
secuencias están más asociadas a los peces puede ser por la fase acuática que presenta los
anfibios y muchos genes codifican para la vida acuática al igual que en peces. Para la filogenia de
los primates los chimpancés (pan troglodytes) y los bonobos (pan paniscus) difieren en su genoma
completo un 0.4. Estos a su vez, difieren de los humanos en un 1.3% de su genoma. Los gorilas
están 1.75% alejados del código genético de los tres anteriores, y los más diferentes, son los
orangutanes (pongo pygmaeus), difieren de todos los demás en un 3% según lo reportado por
Gómez (2010). Lo cual confirma lo que se observa en el árbol.
Conclusiones
-La calidad del ADN es un aspecto importante en la realización de RAPDs
-Las huellas genéticas encontradas muestran polimorfismo en la población, el análisis de
clúster no arrojo ningún patrón idéntico entre individuos
-Las muestras con baja calidad de ADN no generaron fingerprinting
-la filogenia molecular es un aporte importante para el entendimiento del desarrollo
evolutivo en este caso de los vertebrados
-la bioinformática es un apoyo para el análisis y entendimiento de la evolución de los
organismos a partir de sus secuencias de DNA y RNA.
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Anexos

Tabla 1. Matriz datos RAPDs (0: ausencia; 1: presencia)

JV AD AC JS JB CG TC CS JM LG MC GR
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0
1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0
1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0
1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0
1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0
0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0
0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Primers para las secuencias del 12S de los 25 organismos
Caretta caretta

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 130 20 60.01 60.00 4.00 2.00 CCCAAGACACCTAGCTCTGC
PRIMER DER. 850 20 59.96 50.00 5.00 2.00 ACCTCAGGACCGGCTTAAAT
SEQUENCE SIZE: 973

Eretmochelys imbricata

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 120 20 61.00 55.00 4.00 0.00 ACCATGACAGCCCAAGACAC
PRIMER DER. 845 20 59.96 50.00 5.00 2.00 ACCTCAGGACCGGCTTAAAT
SEQUENCE SIZE: 969

Hippocampus coronatus

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 7 24 59.13 29.17 3.00 1.00 TCAAAATAATAGAAATCGGCGTAA
PRIMER DER.710 23 58.80 43.48 3.00 2.00 TGAGATGCTTTGACTACTTCAGC
SEQUENCE SIZE: 710

Hippocampus erectus

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 132 20 59.90 50.00 5.00 1.00 CAACACCTTGCTTAGCCACA
PRIMER DER.929 20 60.04 55.00 4.00 0.00 GCACACCTTCCGGTACACTT
SEQUENCE SIZE: 938

Pterois volitans

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 220 20 60.10 55.00 4.00 1.00 GCTAAGAGGGCCGGTAAAAC
PRIMER DER. 935 20 60.07 55.00 6.00 2.00 CCTTCCGGTACCCTTACCAT
SEQUENCE SIZE: 946

Phyllobates terribilis

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 72 20 59.92 50.00 2.00 2.00 ACGCCCTTATTTCCCCTCTA
PRIMER DER. 810 20 59.60 50.00 4.00 0.00 CCCAGTGCCAGGTTAAAAAG
SEQUENCE SIZE: 928

Homo sapiens

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 92 20 60.07 45.00 4.00 2.00 CGATCAAAAGGGACAAGCAT
RIGHT PRIMER 819 20 59.74 55.00 5.00 1.00 GGCCCTGTTCAACTAAGCAC
SEQUENCE SIZE: 954

Canis lupus familiaris

OLIGO start len tm gc% any 3' seq
PRIMER IZQ. 5 20 59.58 55.00 5.00 0.00 GGTTTGGTCCTAGCCTTCCT
PRIMER DER.718 20 60.82 50.00 2.00 0.00 TAGCCCATTTCTTCCCACCT
SEQUENCE SIZE: 954

Balaenoptera physalus

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 163 20 59.72 50.00 6.00 0.00 CGGGACACAGCAGTGATAAA
PRIMER DER. 909 20 59.73 55.00 6.00 0.00 GGCCTGAGTTAACGAACTGG
SEQUENCE SIZE: 976

Halichoerus grypus

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

LEFT PRIMER 255 20 59.85 50.00 8.00 2.00 ACCGCGGTCATACGATTAAC
PRIMER DER. 956 20 59.62 50.00 3.00 2.00 ACCCAAGCACACTTTCCAGT
SEQUENCE SIZE: 960

Equus asinus

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 64 20 60.21 55.00 4.00 2.00 CCCAGTGAGAATGCCCTCTA
PRIMER DER. 771 20 60.09 50.00 3.00 1.00 GAGACTTCCGTTTGGGTTGA
SEQUENCE SIZE: 974

Rhinoceros unicornis

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 227 20 60.63 50.00 6.00 2.00 CAGAGCCGGTAAATTTCGTG
PRIMER DER. 965 20 60.05 50.00 6.00 2.00 CAAGCGCACTTTCCAGTACA
SEQUENCE SIZE: 971

Felis catus

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 10 20 60.82 55.00 4.00 1.00 GGTCCTGGCCTTTCCATTAG
PRIMER DER. 731 20 59.05 45.00 4.00 0.00 AAATGTAGCCCATTGCTTCC
SEQUENCE SIZE: 960

Didelphis virginiana

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 63 20 60.07 50.00 3.00 2.00 CCCAGTGAGAATGCCCTTTA
PRIMER DER. 833 20 60.05 45.00 4.00 3.00 CGCCCTATTGCCTAATTCAA
SEQUENCE SIZE: 951

Bos taurus
OLIGO start len tm gc% any 3' seq
PRIMER IZQ. 111 20 59.90 55.00 3.00 2.00 TCAAGCACACACCCTGTAGC
PRIMER DER. 830 20 60.61 50.00 4.00 2.00 CGTGCTTCATGGCCTAATTC
SEQUENCE SIZE: 955
Balaenoptera musculus
OLIGO start len tm gc% any 3' seq
PRIMER IZQ. 163 20 59.72 50.00 6.00 0.00 CGGGACACAGCAGTGATAAA
PRIMER DER. 888 20 60.26 55.00 4.00 2.00 CTGTGGCTTTAGCTGGGGTA
SEQUENCE SIZE: 972

Physeter catodon
OLIGO start len tm gc% any 3' seq
PRIMER IZQ. 112 20 59.95 55.00 6.00 2.00 CAAGCACGCTTCACTAGCAG
PRIMER DER. 883 20 60.02 50.00 4.00 1.00 GCGTTCGCTGTGATACTTGA
SEQUENCE SIZE: 970
Ceratotherium simum

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

LEFT PRIMER 164 20 59.86 55.00 4.00 2.00 CACGGGAGACAGCAGTGATA
PRIMER DER. 885 20 59.95 50.00 4.00 2.00 TGTGGCTCGGGGTATTTAAG
SEQUENCE SIZE: 970

Oryctolagus cuniculus

OLI start len tm gc% any 3' seq

LEFT PRIMER 9 20 59.93 45.00 4.00 0.00 TGGTCCTGGCCTTTTTATTG
PRIMER DER. 779 20 60.03 50.00 4.00 1.00 ATCCTCCTTTGGCCCTTAGA
SEQUENCE SIZE: 957

Pan paniscus

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 62 20 60.10 55.00 7.00 2.00 CCCGTGAGTCACCCTCTAAA
PRIMER DER. 815 20 59.74 55.00 5.00 1.00 GGCCCTGTTCAACTAAGCAC
SEQUENCE SIZE: 950

Pan troglodytes

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 81 20 59.90 40.00 6.00 0.00 AAATCGCCATGATCAAAAGG
PRIMER DER. 813 20 59.74 55.00 5.00 1.00 GGCCCTGTTCAACTAAGCAC
SEQUENCE SIZE: 949

Gorilla gorilla

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 63 20 59.92 55.00 7.00 2.00 CCCCAGTGAATCACCCTCTA
RIGHT PRIMER 814 20 59.74 55.00 5.00 1.00 GGCCCTGTTCAACTAAGCAC
SEQUENCE SIZE: 949

Pongo pygmaeus

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 135 20 60.04 60.00 5.00 0.00 GACGCTTAGCCTAGCCACAC
PRIMER DER. 892 20 59.99 50.00 2.00 0.00 TGCGTGGGGGTTTTAGTTAG
SEQUENCE SIZE: 953

Rattus norvegicus
OLIGO start len tm gc% any 3' seq
PRIMER IZQ. 4 20 59.83 50.00 4.00 2.00 AGGTTTGGTCCTGGCCTTAT
PRIMER DER. 709 20 59.85 50.00 3.00 0.00 CTTTCCGCTTCATTGGCTAC
SEQUENCE SIZE: 958

Sus scrofa

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

PRIMER IZQ. 128 20 59.87 55.00 4.00 2.00 GGTAGCTCATAACGCCTTGC
PRIMER DER. 867 20 60.12 55.00 4.00 3.00 ACATGCTTGAGGAGGGTGAC
SEQUENCE SIZE: 960