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Instituto Politcnico Nacional, UPIBI (2013) Equipo 1

Caracterizacin molecular de microorganismos para distintas muestras de suelo de la ciudad de Mxico mediante RAPDs
Cuevas Cosme Juan Carlos, Martnez Len Ral, Prado Rojas Omar, Ramrez Aguilera Edgar Alejandro Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa- Instituto Politcnico Nacional, Av. Acueducto s/n, Barrio La Laguna, Ticomn, Del Gustavo A. Madero, C.P. 07340, Mxico, Distrito Federal.

RESUMEN En las ltimas dcadas, la tcnica de RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) basada en la tcnica de PCR (Polimerase Chain Reaction) ha sido una de las tcnicas ms usadas en la rama de la biologa molecular, sin embargo esta tcnica se ha tomado tambin para otras ciencias como lo es la ingeniera Ambiental gracias a la identificacin de algunos organismos de gran inters. La tcnica RAPD-PCR consiste en la amplificacin enzimtica de fragmentos de ADN, utilizando cebadores de secuencia arbitraria que hibridan aleatoriamente en todo el genoma. Ello revela la existencia de polimorfismos que son utilizables como marcadores genticos y taxonmicos en todo tipo de organismos, y entre ellos, insectos, dpteros y de microorganismos en suelo, aire y aguas (P. Guairo, 1994) este estudio tiene como objetivos 1. 2. 3. 4. Aplicar el conocimiento terico sobre la tcnica de RAPD para su correcto desarrollo. Realizar la caracterizacin de nuestra muestra de DNA Obtener fragmentos de DNA en regiones aleatorias del genoma. Observar el polimorfismo que se observa entre las distintas muestras.

Palabras clave: DNA, PCR, RAPD, polimorfismo

INTRODUCCION La variabilidad gentica o diversidad molecular, adems de comenzar a tener una importancia para la evolucin, un ejemplo,

para verificar la afinidad y los limites entre especies para detectar formas de reproduccin y estructuras familiares. Para evaluar niveles de migracin y dispersin en poblaciones y para identificar especies en

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peligro de extincin. La base de estos estudios son los marcadores moleculares que son un locus gentico que presenta algunas variabilidades, diferentes las tasas de sustitucin y evolucin entre individuos, poblaciones y especies. En la dcada pasada, varias tcnicas han sido desarrolladas para identificacin del tipo de organismos eucariotas y procariotas para el nivel de DNA. Cada uno difiere en su rango taxonmico, poder de discriminacin, reproductibilidad, replicacin y estandarizacin. Las tcnicas moleculares basadas en PCR ensayados para amplificacin de DNA proporcionan nueva s ideas dentro de la sistemticas y evolutivas tendencias de diferentes organismos. Los mtodos mas comunes empleados, son Hibridacin-PCR tamao polimrfico, restriccin de fragmento longitudinal polimrfica al azar y amplificacin polimrfica de DNA-PCR al azar. Una limitante para la inmediata implantacin escala de tecnologa PCR, para el anlisis gentico de organismos de inters, fue el requerimiento de anterior conocimiento de la secuencia de nucletidos del organismo para diseo y sintetizar los primers. Para resolver esta limitante, una PCR basada arbitrariamente en un ensayo gentico preparado al azar llamado Amplificado Polimrfico de DNA (RAPD). Tambin referida ala arbitrariedad preparado PCR(AP-PCR) o amplificacin toma de huellas dactilares DAF. En si el RAPD trabaja con un solo primer de secuencia aleatoria formado por 10 nucletidos unidos a muchos loci por su menor especificidad y en consecuente, amplifica secuencias DNA al azar. Han sido tiles en la optimizacin de procesos de conservacin y uso de germoplasma para identificar duplicados y obtener colecciones ncleo a partir de colecciones con un gran nmero de accesiones. Evidencias experimentales muestran que una mutacin puntual es suficiente para evitar una perfecta complementariedad del primer con el sitio de iniciacin (priming site) impidiendo que el fragmento sea amplificado. Las principales ventajas de la tcnica radica en su simplicidad, rapidez y bajo costo. Ocupa poco DNA y generan diferentes polimorfismos distribuidos por el genoma. Los marcadores RAPD pueden hacer un muestreo tanto de regiones de DNA repetitivo como de DNA de copia nica es decir explora todo el genoma. Un conjunto nico de primer arbitrarios, pueden usarse para cualquier organismo con alto grado de xito y eficiencia. Lamentablemente hay bajo contenido de informacin gentica por locus. Solo un alelo es detectado, el segmento amplificado, mientras las dems variaciones allicas son clasificadas en conjunto como alelo nulo. Excepto para los alelos codominantes resultantes de pequeas inserciones o deliciones en el locus RAPD. Los genotipos heterocigoticos no pueden ser discriminados de los homocigticos, limitacin denominada dominancia

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MATERIALES Y MTODOS Se utilizaron muestras de suelo colectadas en distintos puntos de muestreos, las cuales estn resumidas en la siguiente tabla
Tabla 1 Procedencia de las muestras de suelo Tabla 2 Primer o indicadores utilizados para cada muestra

Muestra Clave 1 2 3 4 5 6 7 INALE 1 INALE 2 INALE 3 INALE 5 INALE 6 INALE 8 INALE 10

5 3 CCCAAGGTCC GGTGCGGGAA GAGTCTCAGG TCAGGGAGGT AAGACCCTTCC GCTGACTGTG CACCAGGCTA

Muestra 1 2 3 4 5 6 7

Fuente de la muestra Bosques de Nativitas Maceta Parque recreativo Jardn casero Rio de los remedios Gasolinera Huerta (limones)

*En cada muestra se utilizo un primer diferente

Las reacciones PCR se realizaron bajo las siguientes condiciones en un termociclador (ver tabla 3 )
Tabla 3 Parmetros y ciclos controlados durante la PCR

Extraccin de DNA Se utilizo muestras de DNA ya extraido previamente (practica 1) el cual se mantuvo en congelacin Amplificacin de fragmentos RAPD La mezcla de reaccin para un total de 25 L contuvo; 2.5 L de dNTPs (200 M) ; Buffer enzima (1X) 2.5 L; 1 L de MgCl 2, Agua estilada 19 L. el contenido apropiado de cada uno de los reactivos ates mencionados son fundamentales para el xito del mtodo Se tomo 18.2 L de la mezcla de reaccin para que se mezclara con 4.0 L del indicador o primer (20 pMol)*; 100 ng de DNA (aproximadamente 2.5 L, pero depender de la concentracin del DNA); 1.5 U de Taq polimerasa (0.3 L). Estas concentraciones y volmenes de reaccin fueron para cada muestra en tubos individuales

Ciclo Desnaturalizacin 1-3

Tiempo 1 min 30 seg 30 seg 90 seg 38 seg 30 seg 90 seg 150 seg

Temperatura, C 99 94 35 72 94 35 72 72

4-38 Extensin final

Los productos de la amplificacin fueron separados mediante la tcnica de electroforesis en gel de agarosa, aplicndole una corriente elctrica por aproximadamente 1.5 horas, el colorante usado fue Rojo Texas, y con buffer de corrimiento TAE (tris, Acido Actico y EDTA)

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RESULTADOS

Figura 1 Fragmentos de DNA separados mediante electroforesis en ge de agarosa visualizados en luz ultravioleta. a) corrimiento de DNA antes de aplicar la tcnica de RAPD, b) Extraccin y corrimiento de DNA despus de aplicada la tcnica de RAPD,: MPM: Marcador de peso molecular; MPM: Marcador de peso molecular; (1) muestra de bosques de nativitas; (2) muestra de maceta; (3) Parque recreativo; (4) Jardn Casero; (6)Gasolinera; (7) Huerta

En la figura 1a anterior se observa que se la mayora de las muestras presentaban DNA, a excepcin de la muestra 5 , sin embargo despus de aplicar la tcnica de RAPD no se observa corrimiento de DNA en ningno de los pozos, pero se aprecia un ligero corrimiento muy tenue en el carril 6 (muestra de la Gasolinera). Esto se atribuye principalmente a la mala calidad del DNA, ya que el PCR es una reaccin enzimtica, por lo tanto depender de la concentracin de la pastilla del DNA, concentracin de los componentes, y las condiciones de ciclos del PCR cualquier variable en los parmetros antes mencionados, pueden modificar notoriamente los resultados , por lo tanto esta prueba es dependiente de las

condiciones y manejo de los reactivos (Senthil Kumar N., 2011) Se atribuye directamente a la mala calidad del DNA o a la inexistencia del DNA til, ya que en la figura 1b no se observa la presencia del DNA, dado que se usaron las mismas muestras que en la figura 1a se esperara observar por lo menos las mismas bandas que en la figura 1a independientemente si el primer utilizado para RAPD se hibridara con la cadena de DNA, La calidad del DNA es un factor muy importe que siempre definir el xito de la prueba de DNA, la presencia de grandes concentraciones de RNA funcionan como agentes quelantes que secuestran al ion Mg+2, que es el un factor importante para la

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actividad del DNA, en ausencia de este ion la reduce significativamente el rendimiento de esta tcnica (Senthl Kumar N., 2011) Por otro lado las impurezas contenidas en la muestra del DNA (pastilla) puede contener inhibidores de polimerasa que dificultando impiden la tcnica de PCR, Otro factor importante es, el tamao del DNA, este debe de ser de gran peso molecular. Las muestras de DNA que se utilizaron para la tcnica de RAPD fueron muestras refrigeradas, es decir la extraccin y El PCR no se hicieron de forma continuas, esto pudo interferir en cuanto a la pureza del DNA, permitiendo la actividad del RNA sobre los iones Mg+2, Aplicacin de la tcnica de RAPD Segn Senthil Kumar N (2011) los RAPD tienen un gran campo de aplicacin, algunos son: 1. Estudios de Diversidad gentica /poliformismos 2. Caracterizacin de germoplasma 3. Estructura gentica de poblaciones 4. Estudios de poblacin y la gentica evolutiva, etc. Algunos de competencia para la ingeniera ambiental son: Hacer estudios genticos de microorganismos que sean capaces de degradar algn contaminante en especifico, conocer su secuencia para poder asi manipularlos y asi obtener algn beneficio particular de ellos. Tambin se pueden hacer estudios de clasificacin taxonmica (como lo reporta el Investigador en ciencias forestales y Agropecuarias Candelario Mondragn Jacobo en su artculo: CARACTERIZACIN MOLECULAR MEDIANTE RAPDs DE UNA COLECCIN DE NOPAL DE (Opuntia spp. Cactaceae) DEL CENTRO DE MXICO, COMO BASE DEL MEJORAMIENTO GENTICO), en donde estudiaron 32 colectas de nopal de la regin Centro de Mxico por medio de la tcnica RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) incluyendo cultivares comerciales y selecciones de nopal de tuna y verdura. Se probaron 46 iniciadores de diez bases, de los cuales se seleccionaron nueve, asociados con 56 bandas polimrficas. L tcnica RAPD permiti la separacin en once grupos discretos; Algo muy similar se puede aplicar en el ambito de las ciencias biolgicas asi como en la ingeniera Ambiental,adems de clasificar a microorganismos capaces de degradar contaminaste de a cuerdo a la presencia o ausencia de bandas polimrficas. A pesar de que no se obtuvieron resultados para las muestras de suelo, se esperaran resultados similares a los reportados por el investigador Mondragn J. Como se muestran en la figura 2

Figura 2 Resultados obtenidos para la caracterizacin molecular mediante RAPD de una coleccin de nopal donde Ita, Rey, Car etc, son tipos distintos de Nopales y las flechas muestran la accin de un primer enesos 3 tipos de nopal, porque aumenta su concentracin (visualizado en brillo) con respecto a los otros tres

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CONCLUSIONES Se realiz la tcnica de RAPD a 7 muestras de DNA provenientes de suelos distintos del DF, y que corresponden a organismos distintos, es decir, cada muestra de DNA proviene de una mezcla indistinta de microorganismos.El DNA utilizado fue sometido a tcnicas de extraccin de alta pureza (uso de fenol) y cada muestra fue puesta a reaccin con un primer distinto, es decir, la secuencia del cebador fue distinta en cada tubo para desencadenar la replicacin por parte de la TAQ-POLIMERASA. Una vez corrida mediante tcnica de electroforesis, se obtuvo un patrn de bandeo muy escaso, pues en el carril nmero 6 se observa un tenue corrimiento. Dado a que los RAPDS son una amplificacin azarosa debida al apareamiento del primer, se concluye que los resultados obtenidos se deben a la nula existencia de la secuencia complementaria, a la lejana entre los primers hibridados para la seal de alto (lejana al extremo 3), al cruzamiento entre los mismos primers (muy poco probable) e inclusive a la baja calidad del colorante (rojo Texas) al ser un grupo cromforo que se vuelve inutilizable al contacto con la luz. De haberse logrado un corrimiento para todas las muestras, pudo haberse comparado el primer utilizado y su comportamiento en las muestras en las que se utiliz, para as establecer un patrn de bandeo; que de ser igual en alguna de las diferentes muestras, hablara de una misma secuencia hallada en muestras distintas, poniendo de manifiesto la presencia del mismo ADN (o al menos del mismo gen) e inclusive la presencia microorganismo. del mismo

Bibliografa
C.Mondragon, J. (2013). Caracterizacin molecular mediante RAPDs de una coleccin de nopal de (opuntia spp. cactaceae) del centro de Mxico, como base del mejoramiento gentico. Chapingo . Guirao, P., Beitia, F., & Cenis, J. L. (1994). Aplicacin de la tcnica RAPD-PCR a la taxonoma de moscas blancas (Homoptera, Aleyrodidae).http://www.magrama.gob.es/ ministerio/pags/biblioteca/revistas/pdf_plag as%2FBSVP-20-03-757-764.pdf Senthil Kumar, N., & Gurusubramanian, G. (2011). Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) markers and its application . Science Vision.http://www.sciencevision.org/current _issue/dl/Science%20Vision%20433%20Senthil%20Kumar.pdf

Walker, J . Ralph Rapley . Molecular Biomethods. Handbook