TEMA 2: ESTUDIO MORF DE CEL SANGUÍNEAS EN

SANGRE PERIFÉRICA Y MÉDULA ÓSEA

Estudio morfológico en sangre periférica y médula ósea, se realiza en la sección de

citología, calcula la proporción de distintos tipos celulares normales presentes en la
muestra y detectar parámetros anormales,se realiza en extensiones y hay que
teñirlas para poder observar.Nos permite distinguir:
● Forma y tamaño
● Presencia o ausencia de núcleo
● Características nucleares:cromatina, número de nucleolos,etc
● Características citoplasmáticas:cantidad,prop tintoriales,gránulos,etc

2.2 LA EXTENSIÓN DE SANGRE PERIFÉRICA

Consiste en una capa fina de sangre dispuesta sobre un porta para realizar un
análisis morfológico de sus células con el MO y tinciones.Vías de obtención de la
sangre:
● Por venopunción: se debe anticoagular con EDTA
● Por punción de la yema del dedo: sangre capilar
2.2.1 TÉCNICA DEL PORTA EN CUÑA
Técnica de extensión más habitual , se usa dos portas, uno de soporte y uno
extensor.Proceso:
1. Depositar una gota de sangre en uno de los extremos
2. Colocar el portaobjetos extensor sobre el soporte, delante de la gota de sangre
formando un ángulo de 35-45º
3. Deslizar el portaobjetos extensor hacia atrás para que su borde entre en contacto
con la gota de sangre. La sangre se distribuye por capilaridad
4. Deslizar el portaobjetos extensor con movimiento suave, rápido y continuo,
manteniendo el ángulo y una presión homogénea.
5. La gota se extiende formando una monocapa que ocupa aproximadamente 2/3-
3/4 de la longitud del portaobjetos soporte.
6. Bordes laterales de la extensión a 1 mm de los bordes del porta.
7. Cola cercana al otro borde de la puerta, pero sin llegar a él.
Debe ser lisa, sin agujeros ni rayas,disminución continuada y progresiva de su
grosor, bordes laterales de la extensión a 1 mm de los bordes del porta y cola
cercana al otro borde de la puerta, pero sin llegar a él.
Tiene tres zonas:
● Cabeza: zona inicial, aparecen hematíes aglomerados en pila de monedas
● Cuerpo:intermedia,contiene la zona ideal de observación. Hay una adecuada
proporción de leucocitos
● Cola:final hay elevada proporción de leucocitos grandes (granulocitos y
monocitos) y plaquetas grandes. Los hematíes suelen estar deformados
2.2.3 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA CALIDAD DE EXTENSIÓN
● La extensión debe tener una disminución progresiva de su grosor
● Los portaobjetos deben estar limpios y desengrasados
● Si el volumen de sangre es excesivo se obtienen extensiones ,muy gruesas,
sin cola.
● Si el volumen de sangre es escaso las extensiones son muy cortas y cuesta
diferenciar las tres zonas.
● Es preferible usar sangre anticoagulada con EDTA
● Si se usa sangre capilar se debe realizar con rapidez. Si se coagula se
observan artefactos y distribución de células no uniforme.
● Técnica:
○ Distribuir sangre por todo el canto del porta extensor
○ El ángulo debe ser 35-45º
○ La velocidad debe ser constante
○ La presión debe ser homogénea
● Utilidades de las extensiones:Fórmula leucocitaria, estudio morfológico de
leucocitos, hematíes y plaquetas, su disposición, recuentos de reticulocitos y
plaquetas,etc.

2.3 TINCIONES HEMATOLÓGICAS PARA EXT SANGN

Las tinciones hematológicas convencionales son aquellas tinciones que se realizan
para colorear las diversas estructuras de las células sanguíneas, aumentando el
contraste entre ellas y colorear el medio para identificar los tipos celulares en MO.
(Tinciones polícromas y supravitales)
Las tinciones especiales: permiten detectar actividades enzimáticas, principios
inmediatos, elementos inorgánicos o moléculas específicas de utilidad para el
diagnóstico y seguimiento de hemopatías.(Tinciones en médula ósea)

2.3.2 TINCIONES CONVENCIONALES POLICROMAS

Utilizan combinaciones de colorantes con distintas afinidades para que las
estructuras celulares se tiñen con colores diferentes, se aplica sobre células
muertas y se requiere fijación previa , para evitar alteraciones de la estructura y
facilitar la adherencia al porta.
Las más usadas derivan de las tinciones de Romanowsky, que se basa en la
combinación de derivados del azul de metileno y eosina.

TINCIÓN DE MAY GRUNWALD-GIEMSA

Es muy utilizada en hematología, se basa en la combinación de 2 colorante, que en
solución acuosa se ionizan y se unen a distintos componentes celulares y genera
sales insolubles de diferentes colores:
● May Grünwald: fijador. Eosina y azul de metileno (básico-catiónico) en
metanol
● Giemsa: mezcla de eosina (ácido-aniónico) y derivados de azul de metileno
Los neutrófilos reaccionan con ambos al ser neutro, y la reacción de tinción depende
del pH, y tiñe:
● Eritrocitos:rosa salmón
● Núcleos de las células:azul oscuro-violeta
● Gránulos citoplasmáticos de neutrófilos:azul claro, lila
● ….eosinofilos:aazul oscuro, negro
● ….basófilo:rojo, anaranjado
Proceso:primero tinción de mary grunwald, se escurre, se echa otra vez diluido ,se
lava y después giemsa y se lava.

TINCIÓN DE WRIGHT
Técnica habitual, en este caso se usa un solo colorante, que es una mezcla de
eosina, azul de met y derivados del azul de met en metanol.Se realiza en dos pasos,
1º se incuba con el colorante sin diluir, y después una dilución tamponada del
mismo colorante y después lavar con agua.

TINCIÓN PANÓPTICA RÁPIDA

Muy usada en lab de urgencias, combina las tec anteriores para conseguir mayor
rapidez.Usa tres reactivos:
● Una solución fijadora, a base de metanol
● Colorante ácido tamponado, normalmente derivado de eosina en tampón
fosfato
● Colorante básico tamponado, derivado de azul de met
El procedimiento:hay que incubar por inmersión secuencial, se usan 3 cubetas,no es
necesario lavar entre una y otra, y al final se lava.

2.3.2 TINCIONES CONVENCIONALES SUPRAVITALES

Son funciones diseñadas para la observacion de celulas vivas, por tanto , no
requieren una fijación previa, se detectan estructuras granulares internas en
azul.Primero se mezcla el colorante con la sangre, y después se extiende

TINCIÓN DE AZUL CRESIL BRILLANTE PARA RETICULOCITOS

Los reticulocitos un conservan algunos organelos y restos de ARN y esta se tiñe de
azul, se realiza en 3 pasos:
● En tubo de hemólisis, colorante y sangre perf anticoagulada con EDT,mezclar
● Incubar en baño maria
● Depositar una gota y extender
Los hematies se tiñen de color verde palido u los reticulocitos en su interior se ven
estructuras granulares de azul.

2.3.3 TINCIONES ESPECIALES

Se usan más en extensiones de médula ósea, pero hay una que se usa en sangre
periférica para diferenciar determinados tipos celulares
FOSFATASA ALCALINA GRANULOCÍTICA
Fosfatasa alcalina: enzima que hidroliza monoésteres del ácido fosfórico a pH
alcalino, formando un compuesto insoluble azul en el citoplasma
Detecta la actividad enzimática (FAG) en los gránulos secundarios de leucocitos
neutrófilos.Para hacerlo se valoran el grado de reacción en 100 neutrófilos y se
asigna un valor entre 0 y 4 dependiendo de la intensidad del precipitado en el
citoplasma de cada uno,se multiplica el n de cel de cada grado por el valor asignado
y se suma las 100 puntuaciones es el índice FAg, normalmente tiene un valor entre
20 y 100.
Se usa en el estudio de síndromes mieloproliferativos, sobretodo para el diagnóstico
de leucemia mieloide crónica, con puntajes FAG muy bajas o nulas , también sirve
para diferenciar entre leucemia mieloide crónica y reacciones neutrofílicas
secundarias.

2.4 EXAMEN MICROSC DE EXTENSIONES DE SANG PRF

El examen está indicada cuando:
● hemogramas que muestran alguna desviación significativa en los recuentos
● Sospecha clínica de una enfermedad hematológica
● Sospecha clínica de una enfermedad no hematológica con manifestaciones
hematológicas(parásitos)

Examen a 10x
● Calidad general del frotis
● Distribución adecuada de leucocitos
● Presencia de células grandes anormales (blastos)
● Posibles aglutinaciones de leucocitos, plaquetas o hematíes
● Presencia de parásitos
Examen a 40x
● Estimación del recuento leucocitos/mm3
● Contar leucocitos en 10 campos
● Calcular media y multiplicar X 2000
Examen a 100x.
● Evaluación de leucocitos
○ Recuento diferencial
○ Análisis morfológico
● Evaluación de eritrocitos
○ Detección y recuento de eritroblastos
○ Análisis morfológico

● Evaluación de plaquetas
○ Recuento de plaquetas/mm3
○ Detección de agregados plaquetarios
2.5 LA EXTENSIÓN DE MÉDULA ÓSEA
Consiste en una capa fina de aspirado de médula ósea dispuesta sobre un porta
para realizar un análisis morfológico de sus células con ayuda de un microscopio y
de tinciones.Permite el análisis morfológico de las células hematopoyéticas,
precursores de la sangre periférica, tanto en el estudio de enfermedades
hematológicas y no hematológicas(metástasis de tumores y enfermedades
parasitarias)Las extensiones en muestras son obtenidas por punción y aspirado y
conservadas en anticoagulante.(cresta iliaca post sup)normalmente 0,5 ml o 5 ml.
COMPONENTES DEL ASPIRADO DE MÉDULA ÓSEA
● Grumo medular:material propio de la médula .contiene células
hematopoyéticas y estromales, grasa y matriz extracelular.
● Sangre medular:Sangre procedente de la vascularización de la médula,
sangre sinusal.
● Punción blanca o punción seca: En ocasiones es imposible obtener grumos o
sangre medular. Se realiza biopsia: fragmento de hueso de la cresta ilíaca
posterior. Anatomopatólogo observa
○ Distribución celular.
○ Relación del componente hematopoyético frente al componente graso.
○ Se ven osteoblastos y osteoclastos (células de la matriz osea)
OBTENCIÓN
Se deben hacer lo más rápido posible y fundamental que incluya grumo y no solo
sangre.Si no se puede practicar inmediatamente después del aspirado, se
transporta en un tubo con EDTA.
Las preparación se puede obtener por aplastamiento o mediante técnica en cuña, se
usa cuando el grumo es escaso.Para ver si hay grumos se coloca en un vidrio de
reloj y ver si hay material amarillento.

TÉCNICA POR APLASTAMIENTO

1.Colocar aspirado medular con grumo en portaobjetos
2. Apoyar otro portaobjetos sobre el anterior aplastando el grumo
3. Sujetar los dos portaobjetos y deslizar
4. Dejar secar la extensión al aire
El factor que más influye en la calidad es la presión ejercida al desplazar el porta
sobre otro, debe ser el suficiente para aplastar el grump y hacer que el material se
extienda uniformemente, pero no excesiva para evitar que se rompan las células.

2.6 TINCIONES HEMATOLÓGICAS PARA EXT DE MO

2.6.1 TINCIONES CONVENCIONALES
Son las mismas tinciones policromas usadas en sangre periférica, con
procedimientos similares , pero con la única diferencia de que los tiempos de
incubación son más rápidos debido a que las extensiones tienen mayor grosor, el
tejido conectivo y matriz en el grumo se tile de azul oscuro o púrpura, lo demás se
tiñe igual que en el frotis de sangre periférica.

2.6.2 TINCIONES ESPECIALES

Necesarias debido a similitudes morfológicas entre los tipos celulares que tienen
funciones diferentes pero morfología parecida y en ocasiones las cel patológicas
también son similares morfológicamente a las cel normales.
Las tinciones convencionales se suelen complementar con estas tinciones, ya que
permiten detectar act enzimáticas, principios inmediatos,etc.
TINCIONES CITOQUÍMICAS
Se basan en reacciones químicas sencillas que originan productos coloreados y que
ponen de manifiesto determinados componentes celulares.
Un grupo específico pone en manifiesto act enzimáticas, son la mieloperoxidasa,
esterasas y fosfatasa ácida
Tincion de Perls para hierro
Se usa para poner en manifiesto la presencia de hierro iónico intracelular, más
concretamente la hemosiderina.
Fundamento:+Ferrocianuro de potasio disuelto en HCl reacciona con Fe3+ dando
un compuesto azul insoluble.La tincion se completa con un colorante de contraste
Resultado:Se observan depósitos azul turquesa en el citoplasma de cel q contiene
hierro:
● Depositos de hemosiderina de los macrofagos presentes en el grumo
● Sideroblastos(eritroblastos o precursores que contienen hierro)
Utilidad:
● Valoración del hierro macrofágico, da una idea del depósitos de hierro del
organismo
● El porcentaje y tipo de sideroblastos presentes en una médula ósea (valor
normal 30-60%)
Tinciones de PAS(Ácido periódico de Schiff)
Se usa para poner de manifiesto glucógeno y mucopolisacáridos
Fundamento:+Oxidación de glicoles de carbohidratos a grupos aldehído que
reaccionan con fucsina de Schiff.Colorante de contraste la hematoxilina
Resultado:+Se aprecia un precipitado de color rojo púrpura intenso en el interior de
las células PAS-positivas, como mucopolisacaridos,glucogeno y de rosa palido las
glicoproteinas.Los nucleos de azul por el contraste.
Utilidad:+Se utiliza para el diagnóstico de leucemias linfoblásticas agudas y
eritroleucemia, se observa un patrón de positividad grueso, en forma de depósito
globulares, en el citoplasma en el primer caso y en los precursores tempranos en el
segundo.
Mieloperoxidasa(MPO)
La peroxidasa es una enzima contenida en cantidad variable, en el citoplasma de
casi todos los leucocitos. Solo los linfocitos carecen de ella. La reacción positiva se
observa como un precipitado ocre en el citoplasma de la célula.
Fundamento:La act peroxidasa hidroliza el peroxido de H, liberando O, originando
complejos insolubles de color pardo
Resultado:TIle de marrón los organelos citoplasmáticos de neutrofilos, eosinofilos y
monocitos
Utilidad: discriminar entre celularidad blástica mieloide (MPO+) y linfoide (MPO-).El
autoanalizador obtiene el MÁXImo índice de actividad peroxidásica, si está fuera de
los valores normales indicará patología de serie mieloide. Valor normal inferior a 10.
Esterasas
Esterasas son enzimas que hidrolizan ésteres de diferentes sustratos, las más
importantes son la NASDA o CAE.
Fundamento:Los productos de la hidrólisis reaccionan con una sal diazoica
formando un compuesto insoluble coloreado.
Resultado:Depende de la sal usada
Utilidad:distinguir precursores morfológicamente similares. Diagnóstico de leucemias
agudas (linfocíticas, mieloides, mielomonocíticas, monocítica)
Fosfatasa ácida leucocitaria(FAL)
Enzima que hidroliza monoésteres del ácido fosfórico a Ph ácido
Fundamento:Hidroliza un sustrato, liberando productos intermedios que se
combinan con sal diazoica dando un precipitado de color rojo anaranjado en el
citoplasma.Su pH de actuación está entre 4,7 y 5,5.
Resultados:depende de la sal
Utilidad:Identificación de la leucemia de células vellosas o tricoleucemia, que
presentan una reacción positiva,que no se inhibe al añadir ác tartárico, ya que
poseen isoenzima resistente al tartrato.

TINCIONES INMUNOCITOQUÍMICAS
Se basa en el uso de Ac específicos para detectar moléculas(marcadores) que
caracterizan poblaciones celulares concretas.
Método sencillo y potente de identificación de poblaciones celulares ya que los Ac
tienen gran especificidad y afinidad por Ag y unirse a ellas, para acoplar el marcador
al complejo Ag-Ac se emplea el sistema biotina-estreptavidina o polímeros
sintéticos. Pero para poner de manifiesto el complejo Ag-Ac se requiere un sistema
de visualización basado en marcadores.
● +Fluorocromos: Sustancias fluorescentes que se pueden observar con un
microscopio fluorescencia, no son permanentes
● Enzimas:Se revelan usando sustratos solubles que por act enzimática se
transforma en productos insoluble coloreado
En las técnicas que utilizan enzimas, se observa al microscopio un precipitado
coloreado donde está presente el Ag. El color depende de la enzima y sustrato que
se use, si es peroxidasa y diaminobencidina es marrón y si se usa fosfatasa alcalina
y fast red es rojiza.Son útiles para identificar y clasificar células neoplásicas
2.7 EXAMEN MICROSC DE EXTENSIONES DE MO
Observación al MO y valoración de:
● Leucopoyesis: morfología y estado de elementos mieloides y linfoides;
maduración; formas anormales
● Eritropoyesis: proporción de células, maduración, elementos anormales.
● Trombopoyesis: nº y estado funcional de megacariocitos, morfología de
plaquetas:Sistema mononuclear fagocítico: morfología
● Elementos anormales: células neoplásicas, metastásicas, reacciones
granulomatosas…
Examen a bajo aumento 10x y 40x
● Primero se comprueba la calidad de la extensión y se seleccionan las
mejores zonas para visualizar.
● Presencia de grumo: para análisis celular, hierro, presencia células
anormales
● Celularidad global: puntuación 1-4. Son normales valores ˃3
● Relación mieloeritroide: Una proporción 3:1 de las líneas leucocitaria frente a
eritrocitaria
● Cantidad de grasa
● Alteraciones estromales: fibrosis, necrosis…
● Presencia de megacariocitos, osteoclastos, osteoblastos
● Presencia de elementos extracelulares como células metastásicas
● Presencia de parásitos: filarias
Examen a gran aumento (100x)
● Se analizan las alteraciones detectadas
● Se realiza mielograma, que es el recuento diferencial de los elementos que
componen la celularidad medular, se expresa en porcentaje cada tipo de
célula, se obtiene en un examen de gran aumento , se cuentan como min 300
células.