Microscopio Coloración Bacterias

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL 2014
Ao de la promocin de la industria responsable y del desarrollo sostenible
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA

Facultad de Ingeniera Ambiental
INFORME DE LABORATORIO N 2 DE MICROBIOLOGA SANITARIA I

USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO - COLORACIN DE
BACTERIAS
PROFESOR: JORGE TELLO

ALUMNO:
CANDIOTTI PORTILLO GIUSSEPPI
LIMA 2014
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 1

1. OBJETIVOS
Para el microscopio:
Aprender a utilizar el microscopio compuesto
Conocer las partes mecnicas y pticas del microscopio
Saber de los cuidados que se debe tener al manejar el microscopio
Para la coloracin de bacterias:
Interpretar el fundamento de las coloraciones en la prctica microbiolgica.

Identificar el tipo de bacterias mediante el mtodo de tincin de Gram
Describir las caractersticas de las diferentes formas observadas
2. FUNDAMENTO TEORICO
MICROSCOPIO:
El microscopio, el instrumento ms peculiar del laboratorio de microbiologa, proporciona la

amplificacin gracias a la cual el hombre es capaz de ver organismos y estructuras que a simple vista
seria invisible. Se dispone de microscopios que permiten amplias escalas de aumento, desde
centenares hasta centenares de miles de dimetro. Se cuenta tambin con varios tipos de
microscopios y se han ideado muchas tcnicas por las cuales las muestras de microorganismos se
preparan para el examen con el mximo detalle. Cada tipo de microscopio y cada mtodo de
preparar las muestras ofrecen alguna ventaja precisa para demostrar algunos aspectos.
Los microscopios pertenecen a dos clases, el de luz (ptico) y el electrnico, segn el principio en
que se base la amplificacin. El microscopio mediante el cual la amplificacin se obtiene por un
sistema de lentes pticos (microscopios de luz) abarca los siguientes tipos:
Microscopio de campo claro o luminoso.
Microscopio de campo oscuro o ultramicroscopio.
Microscopio de luz ultravioleta.
Microscopio de fluorescencia.
Microscopio de contraste de fases.
El microscopio electrnico, como su nombre lo indica, se basa en un haz de electrones en lugar de

ondas luminosas para obtener la imagen en lugar de ondas luminosas para obtener la imagen
amplificada.

Los estudiantes hacen casi la totalidad de sus exmenes, acaso todos, con el microscopio de campo
luminoso, el instrumento de uso ms comn para el trabajo diario. Los otros tipos de microscopia
se usan para propsitos especiales o trabajos de investigacin. Sin embargo, los estudiantes
conocen sus aplicaciones porque cada uno tiene propiedades convenientes para demostrar
estructuras morfolgicas especficas.
MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO
Un microscopio ptico es un instrumento que consiste bsicamente en un tubo con lentes de

aumento en ambos extremos.
El objeto a observar es atravesado con luz visible, que es refractada por las lentes del microscopio
y as se amplifica la imagen.
Permite visualizar estructuras pequeas, cuyas dimensiones son inferiores al lmite del poder de
resolucin del ojo humano.
Un microscopio ptico tiene dos caractersticas fundamentales:
1. la amplificacin (aumento)
2. el poder de resolucin, que a su vez depende de:
a. la calidad de las lentes

b. la longitud de onda de la luz que ilumina
Poder de resolucin es la capacidad de separar dos puntos muy prximos y dar de ellos imgenes
claras y definidas. El del ojo humano es de 100m y el de un microscopio ptico es de 0.24m.
En los microscopios pticos el material biolgico a examinar se observa por transparencia, significa
que la luz debe atravesar los tejidos para formar imgenes. La consecuencia de esto es que se hace
necesario estudiar:
- clulas aplanadas sobre la superficie de un vidrio o, - finos cortes de tejidos suficientemente

delgados como para ser atravesados por radiacin luminosa.
La gran mayora de los componentes celulares no tienen color debido al gran contenido de agua.
Esto plantea la necesidad del uso de colorantes selectivos, los cuales presentan a la vez la dificultad
de matar a las clulas, ya que previamente los tejidos deben ser fijados, deshidratados, incluidos en
un material endurecible y cortados.
Un microscopio ptico consta de una parte mecnica, una parte ptica y un sistema de iluminacin:
1) Parte mecnica:

Consta del pie, la columna o brazo, la platina, el tubo y los tornillos macromtrico y micromtrico.
El pie se encuentra en la base, suele tener forma

de herradura y en l descansa el resto del
microscopio.
La columna o brazo, ubicada sobre el pie, sirve de

soporte a los dems accesorios y debe tomarse de
la misma cuando se desea trasladar el microscopio.
La platina, ubicada en la parte media, de forma

cuadrada o rectangular, soporta la preparacin y
presenta un orificio en el centro que permite el
paso de la luz; una pinza de sujecin para el
preparado y sobrepuesta a ella una platina
mecnica que permite mover la preparacin a
voluntad en dos direcciones (llamadas Norte-Sur y
Este-Oeste), mediante el movimiento de tornillos
ortogonales ubicados sobre la platina o pendientes
de ella. Estos tornillos pueden funcionar
independientemente o ser de comando coaxial
(estar sobre el mismo eje). La mayor parte de las
platinas presentan una escala y un nonio que
facilitan la sealizacin de posiciones determinadas en la preparacin. La escala presenta lneas
marcadas a un milmetro de distancia. El nonio es una escala corta que presenta 10 lneas divisorias
que se corresponden con 9 divisiones de la escala principal.
El tubo sostiene al sistema ptico. En su parte superior se ubican las lentes oculares que pueden
ser una (en los microscopios monoculares) o dos (en los microscopios binoculares). En su extremo
inferior se ubica el revlver, que es una placa giratoria que sostiene las lentes objetivos de distintos
aumentos que pueden cambiarse al girar el revlver.
Los tornillos macromtrico y micromtrico se utilizan para efectuar el enfoque movilizando el tubo
o la platina segn el tipo de microscopio. El primero efecta un ajuste rpido y grosero, y el segundo
realiza un ajuste lento y preciso. Ambos tornillos pueden estar separados o bien ser coaxiales
(dispuestos sobre un mismo eje).
2) Parte ptica:
Consta de las lentes oculares, los objetivos y el condensador.
- Objetivos:
Cada objetivo consiste en un conjunto de lentes que en realidad cumplen la funcin de una sola.
Este sistema sirve para corregir errores de observacin que derivaran del uso de una sola lente.
En los microscopios modernos es comn que los objetivos sean parafocales, es decir, que si se
encuentra enfocado uno de ellos, al girar el revlver y cambiar por otro objetivo, ste resulta

prcticamente enfocado, siendo suficiente slo una ligera correccin con el micromtrico para
lograr el enfoque perfecto.
En cada objetivo se pueden observar una serie de numeraciones grabadas que indican:
a. Aumento
b. Abertura numrica
c. Espesor del cubreobjetos a utilizar,
en mm.
a. Aumento: puede ser variable (4X, 16X, 20X, 25X, 40X, 45X, 60X, 95X, 100X, estos dos ltimos se
utilizan como objetivos de inmersin). Respecto del aumento hay que diferenciar:
1) Aumento primario: es el dado por el objetivo en s.
2) Aumento total: es el que se obtiene multiplicando el aumento del ocular por el del objetivo.
Nos dice cuntas veces est amplificada la imagen que obtenemos del material examinado.
3) Aumento til: es el aumento total del microscopio cuando no excede de cierta cantidad
condicionada por la abertura numrica del objetivo. Significa que si el aumento total supera el
aumento til la imagen obtenida es muy grande, pero borrosa, sin definicin. En los objetivos de
tipo acromtico el mayor aumento til posible es de mil veces la abertura numrica (A.N. *
1.000), mientras que en los objetivos ms perfeccionados, como los apocromticos o los de
fluorita, el lmite de aumento til es de 1. 500 veces la abertura numrica (A.N. * 1.500).
b. Abertura Numrica (AN): cada objetivo tiene un determinado poder de resolucin que se mide
en trminos de abertura numrica del objetivo. Cuando un objeto es iluminado, la luz emerge de l
formando un cono que penetra en la lente frontal de un objetivo. Se lo denomina ngulo de
abertura; y a la mitad de este ngulo de abertura se lo llama ngulo x. El medio en el que el objetivo
trabaja (aire, aceite o agua) tiene un ndice de refraccin determinado al que designamos como N.
La abertura numrica se determina entonces del siguiente modo:

La abertura numrica determina las siguientes caractersticas pticas:
1. Resolucin: es la capacidad que posee un objetivo para separar dos puntos muy prximos
entre s.
( )
=
+
2. Lmite de resolucin: es la mnima distancia en que dos puntos prximos se ven como
separados.
Por lo tanto: a menor lmite de resolucin, mayor poder resolutivo
El lmite de resolucin se calcula del siguiente modo:
0.61 = constante
= longitud de onda de la luz incidente
A.N. = abertura numrica
Si se pretende poder observar estructuras muy pequeas se requiere el menor lmite de resolucin
posible. Deduciendo de la frmula esto se consigue a mayor abertura numrica y a menor longitud
de onda de la luz incidente.
- Oculares:
Es un sistema de lentes que aumenta la imagen producida en el objetivo, aumento que est grabado
en la parte superior (4X, 5X, 6X, 8X, 10X, 15X y 20X, siendo los ms comnmente usados los de 6X y
10X).
- Condensador:
Es el tercer elemento de la parte ptica, constituido por una lente que concentra los rayos de luz
iluminando la preparacin en la parte enfocada por el objetivo, de modo que el campo visual
presente una iluminacin uniforme. Adems proporciona al objetivo un cono de luz adecuado en
tamao y naturaleza, para obtener ptimos resultados en la observacin.
El condensador presenta hacia uno o ambos lados un tornillo para subirlo o bajarlo segn las
necesidades. Adems presenta un diafragma semejante al de una cmara fotogrfica que deja
penetrar slo los rayos tiles y elimina los laterales que generalmente molestan.
Antes de enfocar, el diafragma debe estar completamente abierto, gradundose a continuacin su

abertura segn los aumentos del objetivo. Con altos aumentos el diafragma debe estar ms abierto
que con los bajos aumentos.

3) Sistema de iluminacin:
Los microscopios ms antiguos presentan como sistema de iluminacin un espejo con una cara
plana y la otra cncava. Este espejo recibe los rayos luminosos de una fuente natural o artificial y
los enva hacia la parte ptica.
Siempre que se use el condensador, el espejo debe enfocarse en su cara plana ya que la cara
cncava acenta demasiado la convergencia de los rayos, cosa que ya cumple el condensador.
Actualmente los microscopios presentan un sistema de iluminacin incorporada con una bombilla
de bajo voltaje y de intensidad regulable con un transformador.
Tipos de observacin:
Segn la forma de iluminacin una observacin con un sistema ptico de aumento puede ser:
a. Por reflexin: se realiza cuando la iluminacin se hace desde arriba del objeto.
Se utilizan pocos aumentos y el microscopio con el que se efecta se denomina estereoscpico o

lupa.
b. Por refraccin o transparencia: se realizan con luz transmitida desde abajo. Para ello los objetos
a ver deben ser lo suficientemente transparentes. Este es el caso del microscopio ptico.
Por otro lado, una observacin tambin puede ser seca o por inmersin:
Observacin seca: se realiza sin colocar lquido alguno entre el cubreobjetos del preparado y el
objetivo.
Observacin por inmersin: en ella se coloca entre el cubreobjetos y el objetivo una gota de aceite
de inmersin (con ndice de refraccin de 1.5, que es el del vidrio) que mejora la imagen por
aumento de la abertura numrica. De este modo, todos los medios atravesados por la luz tienen un
mismo ndice de refraccin. La imagen obtenida es ms luminosa y ms clara. Para hacer inmersin
se utiliza el objetivo de mayor aumento (95X o 100X).
Tcnica de la inmersin:
Consiste en colocar una gota de aceite de inmersin entre el cubreobjetos y la lente frontal del
objetivo de mximo aumento. Para ello, teniendo ya enfocado el objeto en un aumento menor, se
gira levemente el revlver, se coloca una pequea gota de aceite sobre el cubreobjetos, luego se
sigue girando hasta enfocar el objetivo de mayor aumento y se procede al ajuste con tornillo
micromtrico.
Terminada la observacin se eleva el tubo o se baja la platina y se limpia el objetivo con papel de
seda o gnero suave que puede estar humedecido en un detergente especial para lentes.

Nunca debe utilizarse para limpiar la lente alcohol ni xilol, ya que stos deterioran el cemento que
aglutina las lentes.
Dada la reducida distancia de trabajo que existe cuando se utilizan objetivos de 40X a 100X (que
llega a ser tan slo 0.12 mm) puede suceder que la lente frontal tome contacto con el cubreobjetos
con lo cual dicha lente puede rayarse o desplazarse hacia atrs. Por ello es necesario evitar todo
contacto entre el objetivo y el cubreobjetos. Para evitar estos peligros en la actualidad estos
objetivos cuentan con un muelle protector situado en el interior del tubo del objetivo. Sin embargo
se debe tener precaucin pues los microscopios antiguos no presentan este mecanismo de
seguridad.
MANEJO DEL MICROSCOPIO
Procedimiento
1. Levantar el tubo o bajar la platina.
2. Colocar la preparacin microscpica en la platina.
3. Colocar el objetivo de rastreo (menor aumento).
4. Bajar el tubo (o subir la platina), observando por el costado, (no por el ocular), hasta hacer tope
o bien hasta que la lente frontal del objetivo se encuentre ms o menos a 1 mm del cubreobjeto.
5. Regular la iluminacin:
a. Colocar la lmpara a unos 25 cm.

b. Usar el espejo plano y centrarlo mirando por el tubo hasta que el campo quede
uniformemente iluminado.
c. Abrir completamente el diafragma.
d. Subir del todo el condensador.
6. Centrar el objeto debajo del objetivo mirando por el costado.
7. Levantar el tubo con el tornillo macromtrico hasta lograr una observacin lo ms ntida posible,
posteriormente ajustar la misma con el tornillo micromtrico.
8. Ajustar la iluminacin:
a. bajando levemente el condensador.
b. cerrando el diafragma lo necesario.
9. Buscar el mejor lugar para observar (bordes).
10. Cambiar de objetivo, sin levantar el tubo, hasta obtener el aumento deseado.

Tincin o coloracin de bacterias
Los microorganismos excepto las algas, son por lo general incoloros y muy ligeramente refractantes
por lo tanto son difciles de estudiar tal como se les encuentra en la naturaleza. Para poder hacerlos
visibles es necesario colorarlos o teirlas previamente antes de observarlos al microscopio. La
coloracin hace resaltar tambin algunas caractersticas morfolgicas que de otra manera no son
visibles por que las distintas partes de una clula tienen afinidad por diferentes colorantes. Los
colorantes ms comunes son aquellos derivados de la anilina como la fucsina, violeta de gencia, azul
de metileno y otros.
La coloracin se usa tambin para diferenciar a los organismos y parte de ellos que de otra manera
no son muy semejantes; el proceso se conoce entonces con el nombre de diferenciacin por
coloracin. La diferenciacin por coloracin se puede hacer empleando un tinte policromado en
cuyo caso algunos organismos o partes de un mismo organismo retienen un color mientras que otro
retiene otro color. Sin embargo la diferenciacin de bacterias por coloracin generalmente depende
de la habilidad de un organismo o parte de el de retener un colorante especifico despus de que ha
sido tratado con un agente decolorante. Los pasos fundamentales para hacer una diferenciacin de
bacterias por coloracin son:
a. Coloracin.
b. Decoloracin.
c. Contracoloracin.
Tipos de Tincin
Tincin Simple: Utiliza un solo colorante.
Tincin acidorresistente: Las bacterias acidorresistentes son las que retiene la carbolficsina, aun
cuando intente descolorarlas con una mezcla de alcohol y cido clorhdrico. Las bacterias
acidorresistentes se tien de color rojo; el resto adquiere el color del colorante de contraste en este
caso el verde o azul.
Tincin negativa: Este procedimiento consiste en la tincin de fondo con un colorante cido para
dejar las clulas incoloras en contraste. Comnmente se utiliza el colorante negro llamado nigrusna.
El mtodo sirve para observar bacterias o estructuras que difcilmente se tien con las tcnicas
directas.
Tincin de los flagelos: Los flagelos son estructuras demasiado finas para poder ser visibles en el
microscopio de luz. Sin embargo si se tratan con una suspensin coloidal inestable de sales de cidos
tnico para formar un precipitado denso en la pared celular y en los flagelos, se pueden poner de
manifiesto su presencia y disposicin en las clulas. De esta manera el dimetro aparenta que la
estructura aumento de tamao con fuscina bsica los hace visibles en el microscopio ptico.

Tincin de la cpsula: La cpsula se pone de manifiesto mediante una coloracin negativa o una
modificacin de esta. Uno de los mtodos de tincin de la cpsula incluye el tratamiento de las
bacterias con un solucin caliente de cristal violeta seguido por un lavado con una solucin de
sulfato de cobre. El sulfato de cobre tambin imparte color al fondo y esto resulta en que la clula
y el fondo aparezcan teido en color azul oscuro mientras la cpsula aparece de color azul plido.
Tincin del ncleo: Los ncleos se pueden teir por la tincin de Feulgen la cual es especfica para
el ADN.
Tincin de las esporas: Las esporas se observan de la manera ms simple como cuerpos refringentes
intracelulares en suspensiones de bacterias sin teir, la parte de las esporas relativamente
impermeable, las esporas comnmente se tien con verde de malaquita y carbolfucsina o
carbolfucsina
Tincin de Giensa: El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de

protozoos en la sangre para observar materias ncleos de las clulas.
Tincin Gram
Tipo de coloracin de las bacterias que constituyen un carcter sistemtico; segn tomen o no color,
aplicando este mtodo, se distinguen los grupos Gram positivos y Gram negativos.
La tincin de Gram o coloracin Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa

para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo
dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la
diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan
de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa.
La base de la reaccin diferencial de Gram es la estructura de la pared celular. Esta tcnica

diferencial es una de las de uso ms comn en microbiologa. El frote bacteriano teido se somete
a las soluciones siguientes en el orden en que se indica: cristal violeta, alcohol y safranina o alguna
otra solucin de contraste conveniente.

DIFERENCIAS MOLECULARES ENTRE UNA BACTERIA GRAN POSITIVA Y OTRA GRAN NEGATIVA.
BACTERIAS GRAM POSITIVAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Poseen una pared celular interna y una pared de Poseen una pared celular ms compleja:
peptidoglucano. -pared celular interna
*Peptidoglucano: es un exoesqueleto que da -pared de peptidoglucano
consistencia y forma esencial para replicacin y - bicapa lipdica externa
supervivencia de la bacteria.
No tiene membrana externa Membrana externa: forma un saco rgido
alrededor de la bacteria, mantiene estructura y es
barrera impermeable a macromolculas, ofrece
proteccin en condiciones adversas
Espacio periplasmtico: espacio entre la superficie

No tiene espacio periplasmtico externa de la membrana citoplasmtica y la
interna de la membrana externa.
La red de murena est muy desarrollada y llega a La red de murena presenta una sola capa
tener hasta 40 capas
La penicilina mata a las gram positivas, ya que La penicilina no mata a las Gram negativas, a
bloquea la formacin de enlaces peptdicos entre las causa de la capa de lipopolisacridos situada en la
diferentes cadenas del peptidoglucano parte externa de la pared celular.
Contiene LPS: estimulador de respuestas inmunes:
No contiene LPS activa clulas B, liberacin de IL, FNT, IL 6 por
macrfagos.
En la tincin de Gram, retienen la tincin azul Quedan decoloradas.
Conservan el complejo yodocolorante Pierden el complejo yodocolorante
Pueden ser anaerobios o aerobios

Son esporulantes y no esporulantes, como
Streptococcus, Cisteria, Frankia.
Poseen otros componentes: cidos teicoicos y Poseen protenas con concentraciones elevadas.
lipoteicoicos, y polisacridos complejos.

Causas que alteran la tincin de Gram
Edad de la bacteria.
Errores del operador.
Uso de antibiticos.
Bacterias resistentes a la tincin Gram
Las siguientes bacterias de naturaleza gram positiva, tien como gram negativas:
Mycobacterias (estn encapsuladas).

Mycoplasmas (no tienen pared).
Formas L (prdida ocasional de la pared).
Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared, respectivamente).
Caractersticas de la clula bacteriana
COCO
Proviene del griego kkkos, lo que se traduce

como grano, es de forma esfrica. Estas se
clasifican en:
-Diplococo: Cocos en grupos de dos.
-Tetracoco: Cocos en grupos de cuatro.
-Estreptococo: Cocos en cadenas.
-Estafilococo: Cocos en agrupaciones irregulares o

en racimo.
BACILO
Proviene del latn baculus, lo que significa varilla,

tienen forma de bastoncillo.

FORMAS HELICOIDALES
-Vibrio: ligeramente curvados y en forma de

coma, juda o cacahuete.
-Espirilo: en forma helicoidal rgida o en forma de

tirabuzn.
-Espiroqueta: en forma de tirabuzn (helicoidal

flexible)
3. METODOLOGA
3.1 . Procedimientos utilizados en el microscopio
Debes colocar tus microscopios en una mesa fija, de modo tal que puedas sentarte con
comodidad para ver el ocular sin estirarte o apoyarte. trata que la mesa sea lo
suficientemente grande como para colocar sobre ella todo el material que necesites para
trabajar. El objeto que se desea examinar debe colocarse en un portaobjetos, que se una
lamina de vidrio de 1mm d espesor y a continuacin se cubre con un cubreobjetos, un
cuadrado de 2cm de lado o un circulo con esa medida de dimetro.
La distancia del microscopio al filo de la mesa no debe ser menor a 15 cm. Adems de limpiar
los oculares, objetivos, condensador y espejo para una mejor visualizacin en el
microscopio.
Practica hasta que tengas la certeza de saber para qu lado debes mover el macrmetro,
para hacer subir o bajar las lentes. Para comenzar, seleccione siempre la lente de menor
aumento que te permite ver mejor el objeto y encontrar fcilmente la parte que ms te
interesa observar.
Coloca el portaobjetos sobre la platina de manera tal que la parte que quieres observar se
encuentre bajo la lente. Utiliza los broches para fijar el portaobjetos en su sitio. Observa
desde un costado la platina y mueve la perilla de enfoque para acercar la lente .Luego mira
a travs del microscopio y sube las lentes girando el micrmetro hasta que el objeto entre
en foco y su imagen se vuelva ntida y clara.

3.2 . Procedimientos utilizados en la coloracin de bacterias.
Usar portaobjetos limpios y pasarla varias veces cortando la llama del mechero.
Dejar enfriar el portaobjetos y colocar una gotita de agua destilada con el inoculador
esterilizado.
Con el inoculador estril, tocar ligeramente el cultivo que ha de ser examinado (cultivos de
18-42 h) y transferir un poco de l sobre la gotita de agua en el portaobjetos.
Frotar el cultivo con el inoculador hasta extenderlo hasta la parte central del portaobjetos,
cuidado que se forme una pelcula muy delgada.
Fijar el extendido sobre el portaobjeto pasndola sobre la llama del mechero 3 veces. Dejar
enfriar.
Cubrir la pelcula con el colorante cristal violeta (gram #1) y dejar cubierto por espacio de 1-
2 minutos
Lavar con agua hasta retirar el exceso.
Se aade solucin Lugol (gram #2) u se deja reposar durante 1 minuto.
Decolorarla con alcohol-acetona (gram #3) durante 5 a 15 segundos.
Lavar la lmina con agua.
Se tie con safranina (gran #4) por un espacio de 20-30 segundos.
Lavar la lmina con agua durante 2 segundos
Dejar secar o secar con papel
Aadir una gota de aceite a la lmina para poder examinar con el microscopio utilizando el
objetivo de 97x de inmersin.
4. RESULTADOS Y/O OBSERVACIONES:
Uso del microscopio compuesto:
ALGAS: Aumento ---- 10x10x Aumento ----10x43x

HILOS: Aumento -----10X10X Aumento ------- 10X43X
CEBOLLA: Aumento ------ 10X10X Aumento -------- 10X43X
ESPORAS DE HONGOS:
OBSERVACION:
AUMENTO:
10X10X: plomos, circulares y alargadas
10X43X: plomas, circulares
10X97X: Nada
LETRA E: Aumento -------10x10x

Coloracin de bacterias:
CARACTERISTICAS DE
Grupo N1 AGRUPACION GRAM OBSERVACION
CRECIMIENTO
Lobulado, plana,
PLACA N 4 ____ ____ No se pudieron
crema y opaco
visualizar en el
Entero, plana, microscopio
HUELLA DIGITAL ____ ____
crema y opaco
CARACTERISTICAS DE
CRECIMIENTO
Entero, plana, No se pudo visualizar
HUELLA DIGITAL ____ ____
crema y opaco en el microscopio
Gram Entero, plana,
FOTOCOPIADORA Estafilococos se realiz la medicin
Negativo crema y opaco
con aumento
Gram de 97x10x
TUBO N 3 Diplobacilos Pelcula
Negativo
CARACTERISTICAS DE
CRECIMIENTO
Entero, plana, No se pudo visualizar
FOTOCOPIADORA ____ ____
crema y opaco en el microscopio
Se realiz con el
Gram Entero, plana, microscopio del
HUELLA DIGITAL Estafilococos
Negativo crema y opaco grupo N 2
CARACTERISTICAS DE
CRECIMIENTO
LAB. Gram Entero, plana,

Estreptobacilos Se visualiz con el
MICROBIOLOGIA Negativo crema y opaco
microscopio del
Gram Lobulado, plana, grupo N 2
PLACA N 4 Estafilococos
Negativo crema y opaco

CARACTERISTICAS DE
Grupo N 5 AGRUPACION GRAM OBSERVACION
CRECIMIENTO
Se realiz con el
Gram Entero, plana,
HUELLA DIGITAL Estreptobacilos microscopio del
Positiva crema y opaco
grupo N 2
No se pudo visualizar
TUBO N 3 ____ ____ Pelcula
en el microscopio
5. DISCUSIONES:
La letra e se visualiz invertida a travs del microscopio.
Se pudo observar la pared celular de la cebolla.
En la muestra de las algas de pudieron observar los filamentos.
En el grupo N 1 no se pudo observar las bacterias con la coloracin de gram debido
a una mala manipulacin del microscopio.
En el grupo N 2 si se pudo observar las bacterias y fueron gram negativas en
agrupaciones de Estafilococos y Diplobacilos hallados en las muestras de
fotocopiadora y tubo N3 respectivamente.
En los dems grupos no se pudo observar el los microscopios propios de estos y se
pidi la ayuda del grupo N 2 para la visualizacin.
En el grupo N3 se hall estafilococos gram negativo en la muestra de la huella
digital.
En el grupo N4 se observ Estreptobacilos y estafilococos gram negativos en las
muestras del lab. microbiologa y placa N 4 respectivamente.
En el grupo N5 se visualiz bacterias gram positivas agrupadas en Estreptobacilos

hallada en la muestra de la huella digital.

6. CONCLUSIONES
Si bien la manipulacin del microscopio es sencilla necesita del debido cuidado y la

prctica necesaria para lograr un verdadero adiestramiento.
La muestra de la letra e se vio invertida debido a una de las caracterstica del microscopio
compuesto.
No siempre ser posible visualizar la muestra con todos los objetivos debido a la
potencia de aumento.
La diferencia entre los colores obtenidos de las bacterias Gram. Se basa en las diferencias
que existen entre sus paredes celulares y su resistencia a la decoloracin, la membrana
externa Gram negativa es soluble al alcohol /acetona, la delgada capa de peptidoglicano
es incapaz de retener el cristal violeta y la clula se decolora. Al contrario de la Gram
positivas que posee una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de
peptidoglicano , los cuales no son permeables al alcohol/cetona, sino que este acta
deshidratando los poros cerrndolo, atrapando el cristal violeta y la clula se decolora.
Al contrario de la Gram positivas que posee una pared celular ms resistente y con
mayor proporcin de peptidoglicano, los cuales no son permeables al alcohol/cetona,
sino que este acta deshidratando los poros cerrndolo, atrapando el cristal violeta y
manteniendo la coloracin azul.
La mayor parte de las colonias analizadas resultaron agrupaciones de los cocos, los
cuales pueden causar afecciones respiratorias y algunos procesos severos como la
meningitis.
Comparando los resultados concluimos que la mayora de las bacterias estudiadas eran
Gram negativo.
Luego de conocer la morfologa de las bacterias podemos reconocerlas.
7. RECOMENDACIONES :
Se debe tener cuidado al momento de pasar el portaobjetos en el mechero y evitar

quemaduras o rupturas del material, adems de la conservacin de las colonias.
Se debe tener en cuenta la edad de las bacterias as como la debida esterilizacin de los
instrumentos.
Hacer un adecuado uso del microscopio al observar los colores de las bacterias.

Tener en cuenta la limpieza para disminuir el crecimiento de las bacterias y as evitar
algunas enfermedades que causan estas.
Siempre debemos trasladar el microscopio, agarrndolo con las dos manos una de ellas en
el brazo, y la otra con la palma hacia arriba sosteniendo la base o pie.
Los tornillos (macromtrico y micromtrico) y el revlver deben moverse siempre con

cuidado y sin apresuramiento, para evitar que los lentes se rompan o rayen.
Al acercar la lente del objetivo a la preparacin, debemos mirar directamente y no a travs del
ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar
alguno de ellos o ambos.
Debemos utilizar una gota de aceite para realizar la observacin con el objetivo de inmersin 97X.
Para limpiar la lente debe usarse solo papel lente. Puesto que otro material puede rayarlo.
Ningn lquido debe mojar pieza alguna del microscopio. Las lminas que se colocan en la
platina debern estar siempre secas.
8. BIBLIOGRAFA
Pelczar Michael J. Microbiologa, editorial McGraw Hill cuarta edicin, Mxico 1982.
(Microscopio Tincin de Gram)
Biologa de los microorganismos Brock- Michael T. Madigan (Estructura y funcin celular-

Microscopio)
http://www.maristasourense.com/extras/materias/bioloxia/Microscopio.PDF
http://www.agro.unlpam.edu.ar/catedras-
pdf/biologia2010/Apuntes%20Te%F3ricos%202010/Microscop%EDa%202010.pdf
http://biologiamedica.blogspot.com/2010/09/bacterias-gram-positivas-y-gram.html
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo4_4.htm

9. CUESTIONARIO:
1. Explique las funciones de las siguientes partes del microscopio:
a) Diagrama: Est formado por un conjunto de laminillas que dejan un orificio en
su centro. El dimetro del orificio puede ser variado mediante una palanca, con lo
que se regula la cantidad de luz que llega a la preparacin.
b) Condensador: Es un sistema de lentes situado debajo de la platina que
concentra la luz sobre la preparacin, consiguindose as una iluminacin ms
intensa.
c) Objetivos: Representan el componente ptico ms importante del microscopio.
Su principal funcin consiste en colectar la luz proveniente del espcimen y
proyectar una imagen ntida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del
microscopio (Lente situada cerca de la preparacin). Si se utiliza el aumento 100x
es necesario agregar a la preparacin aceite de inmersin, cuya funcin es evitar la
dispersin de los rayos luminosos.
2. Explique el fundamento de las siguientes clases de microscopio.

a) Microscopio de campo oscuro: El efecto producido por la tcnica del campo
oscuro cosiste en un fondo negro sobre el cual se ven los objetos intensamente
iluminados. La nica luz que es capaz de entrar en el objetivo es la que es dispersada
por la muestra, por lo tanto, los microorganismos se observan brillantes sobre un
fondo oscuro. La resolucin de los microscopios de campo oscuro es bastante alta y
pueden observarse en ellos objetos difcilmente percibidos por microscopia de
campo claro o de contraste de fases. La microscopia de campo oscuro tambin es
un mtodo excelente para observar la movilidad en los microorganismos, ya que
permite resolver los penachos de flagelos mediante esta tcnica y tambin en el
examen de microorganismos sin teir suspensos en lquido.
b) Microscopio de fluorescencia: Se utiliza para visualizar muestras capaces de
emitir fluorescencia; es decir, capaces de emitir una determinada longitud de onda
cuando previamente ha incidido sobre ellas una luz de menor longitud de onda (luz
ultravioleta). La fluorescencia puede ser debida a que determinadas clulas posean
sustancias fluorescentes naturales como la clorofila u otros componentes
fluorescentes o por hacer sido previamente tratas con un colorante fluorescente. La
microscopia de fluorescencia se usa habitualmente en diagnsticos microbiolgicos
as como en ecologa microbiana y tambin en la tcnica de anticuerpos
fluorescentes o inmunofluorescencia, que se utiliza para identificar las clulas
individuales que reaccionan con el anticuerpo.
c) Microscopio de contraste de fase: La microscopia de contraste de fase es de

un valor incalculable para el estudio de las clulas vivas y de amplio uso en estudios

biolgicos aplicados y especulativos. La muestra se ilumina de manera controlada
por medio de objetivos especiales de contraste de fase y un condensador
ensamblado a un microscopio de luz ordinaria.
El sistema ptico especial de que est provisto el microscopio de contraste de fase
hace posible distinguir estructuras que solo difieren ligeramente en cuanto a sus
ndices de refraccin. Por ejemplo, las estructuras o unidades dentro de una clula,
son ndices de refraccin similares y, por lo tanto, no discernibles por el microscopio
de luz, se distinguen con el microscopio de contraste de fase.
La luz que atraviesa un material y pasa a otro de una densidad ligeramente diferente
sufre una desviacin, o es refractada. El microscopio de campo luminoso no hace
visible estas ligeras variaciones en la densidad o ndice de refraccin, si bien se
producen irregularidades mnimas e las ondas frontales que atraviesan el material.
El dispositivo de contraste de fase transforma las irregularidades en las variaciones
correspondientes en la brillantez. Este sistema de iluminacin controlada hace
posible distinguir detalles estructurales que varan muy ligeramente en su densidad
o ndice de refraccin. Pone de manifiesto diferencias en las clulas y en sus
estructuras no discernibles por otros mtodos.
d) Microscopio electrnico: La microscopia electrnica difiere en muchos

aspectos de las tcnicas descritas en relacin con la microscopia ptica. El
microscopio electrnico tiene la ventaja de su extraordinaria amplificacin, con un
poder de resolucin 100 veces mayor que el del microscopio ptico por la gran
cortedad de longitud de onda del haz electrnico usado para ampliar el espcimen
(es posible distinguir objetos tan pequeos como de 10 A). El microscopio
electrnico se vale de ondas de electrones y campos magnticos para producir la
imagen, mientras que el microscopio de luz hace uso de ondas luminosas y lentes
de vidrio. En microscopia electrnica, el espcimen que se va a examinar se prepara
como una pelcula muy fina y seca sobre pantallas pequeas y se introduce en el
instrumento en un punto situado entre el condensador magntico y el objetivo
magntico, comparable a la platina del microscopio de luz. La imagen ampliada se
ve en una pantalla fluorescente por una ventana a prueba de aire o se registra en
una placa fotogrfica por una cmara introducida en el instrumento.
3. Defina las siguientes propiedades de los lentes:
3.1. Apertura Numrica (AN): El ngulo determinado por el eje ptico y los rayos
ms externos que aun capta el objetivo es una medida de la apertura del objetivo; es
la mitad del ngulo de apertura. La magnitud de este ngulo se expresa como un valor
seno. El valor seno de la mitad del ngulo de apertura se multiplica por el ndice de
refraccin n del medio que llena el espacio entre el cubreobjetos y el objetivo, da
la apertura numrica: AN =n*sen. Capacidad de captacin de la luz por la lente.
3.2. Poder de resolucin: Es una funcin de la longitud de onda de la luz utilizada y

de una caracterstica propia de las lentes denominada apertura numrica. En
general, hay una correlacin entre la capacidad de aumento de una lente y su

apertura numrica: las lentes de mayor aumento poseen generalmente mayores
aperturas numricas. Es la capacidad que posee un microscopio para separar dos
puntos muy prximos entre s.
( )
=
+
3.3. Ejemplo:
Supongamos que se utiliza un filtro verde con una longitud de onda luminosa
=0.55m, un objetivo de inmersin con un AN de 1.25 y el condensador con un AN
de 0.9. Hallando el poder de resolucin:
0.55
= = 0.255m
1.25 + 0.9
Un poder de resolucin de 0.255 m significa que si dos puntos estn separados

menos de 0.255 m aparecern como un solo punto. Deben de estar separados ms
de 0.255 m para aparecer como dos objetos distintos.
4. Explique el fundamento de la coloracin de Gram.

Las diferencias estructurales entre las paredes celulares de la bacteria Gram positivas y
Gram negativas son las responsables del diferente comportamiento de las clulas a la
tincin de Gram. En dicha tincin, se forma dentro de las clulas un complejo cristal
insoluble violeta-yodo que en el caso de las Gram negativas puede extraerse con alcohol,
pero no en las Gram positivas, que poseen paredes celulares muy gruesas con varias capas
de peptidoglicano. Esto provoca el cierre de los poros de las paredes impidiendo la salida
del complejo cristal violeta-yodo. En las bacterias Gram negativas, el alcohol penetra
rpidamente en la capa externa que es rica en lpidos y la fina capa de peptidoglicano no
impide el paso del solvente, por lo que el complejo se extrae fcilmente.
Gram positivas Gram negativas
5. Mencione enfermedades producidas por bacilos Gram negativos,

bacilos Gram positivos, cocos Gram negativos y cocos Gram positivos.

Cocos Gram positivos. Enfermedad
Staphylococcus aureus Abscesos, endocarditis, gastroenteritis, dermatitis
exfoliativa estafiloccica.
Streptococcus Pyogenes Faringitis, celulitis, fiebre reumtica, mionecrosis
Streptococcus Agalactiae Meningitis Neonatal, Sepsis, Endometritis,
Neumonia.
Streptococcus Faecalis Infecciones de vias urinarias y biliares,
Bacteriemia, Endocarditis.
Streptococcus Pneumoniae Neumonia, Meningitis, Peritonitis, Otitis media,
Sinusitis
Cocos Gram negativos. Enfermedad

Neisseria meningitides Meningitis y meningococemia
(Diplococo)
Neisseria gonorrhoeae Gonorrea
(Diplococo)
Bacilos Gram positivos. Enfermedad
Bacillus antracis ntrax pulmonar y cutneo.
Clostridium tetani Ttanos
Clostridium botullinum Botulismo clsico-Botulismo infantil
Clostridium perfringens Gangrena gaseosa, Enteritis necrosarte
Corynebacterium Difteria
Bacilos Gram negativos. Enfermedad
Escherichia coli Diarrea
Salmonella Typhi Fiebre tifoidea
Salmonella enteritidis Enterocolitis
Vibrio cholerae Clera
klebsiella pneumoniae Enfermedad pulmonar crnica Neumona
Pseudomonas aeruginosa Infeccin de heridas en especial de quemadura
Haemophilus influenzae Bronconeumona
Bordetella pertussis Tosferina
Brucella. Brucelosis
B. Abortus.
B. Suis
B. Melitensis
Francisella tularensis Tularemia
6. Defina las siguientes estructuras bacterianas:

A. Pared Celular: Se encuentran dentro de la capsula y fuera de la membrana que
est en contacto con el citoplasma. La pared celular tiene una gran rigidez que se
demuestra fcilmente sometiendo a bacterias de formas diferentes a condiciones

fsicas extremas como presiones osmticas muy altas o muy bajas, o temperaturas
inferiores a la de congelacin seguidas de descongelacin; las bacterias conservan
su forma original. Son necesarias tcnicas muy fuertes para romper las paredes
celulares de muchas bacterias. La pared celular constituye una porcin apreciable
del peso seco total de la clula; dependiendo de la especie. Las paredes celulares
bacterianas parecen ser esenciales para el desarrollo y divisin de bacterias, porque
a las bacterias a las que se le ha despojado selectivamente de la pared, es decir, los
protoplastos son incapaces de un desarrollo y divisin normales.
B. Membrana citoplasmtica: Inmediatamente por dentro de la pared celular

se encuentra una membrana fina llamada membrana citoplsmica. Este dato fue
obtenido debido a tcnicas especiales como coloraciones selectivas y microscopia
electrnica. La membrana citoplsmica es una estructura de extrema importancia
funcional. Es una membrana semipermeable selectiva que regula el paso de
nutrientes y productos de desecho dentro y fuera de la clula, logro notable si se
considera que la clula microscpica flota en un medio qumico heterogneo y en
extremo complejo, donde es capaz de tomar y retener lo necesario para la vida y
descargar el exceso o los productos de desecho. Tambin se localizan varias enzimas
que sintetizan lquidos complejos, as como componentes de la pared celular y
enzimas que intervienen en el transporte de electrones y en la fosforilacion
oxidativa.
C. Ribosomas: El ribosoma es un orgnulo pequeo formado por ARN y protenas

cuya funcin es colaborar en la traduccin, una etapa de la sntesis de protenas.
7. Cmo afecta la edad de cultivo a la coloracin Gram?

Si bien los organismos gram negativos son constantes en cuanto a su reaccin al gram, en
ciertas circunstancias los organismos gram positivos muestran variacin en la respuesta.
Cultivos viejos de algunas bacterias gram positivas pierden la facultad de retener el cristal
violeta y se tie con la safranina. Un efecto similar es a veces debido a cambios en el medio
o a pequeas modificaciones en la tcnica de tincin. As, es necesario apegarse a los
procedimientos establecidos.
10. ANEXO:
PARED CELULAR DE LOS PROCARIOTAS:
Las bacterias se dividen en dos grandes grupos: las gram positivas y las gram negativas. La
distincin inicial entre estos dos tipos se llev a cabo mediante una tincin diferencial

denominada Tincin de Gram; pero la diferente reaccin a la tincin de gram se basa en
las diferencias que existen en la estructura de las paredes celulares. La morfologa de las
paredes celulares es muy distinta en las clulas gram positivas y negativas. La pared celular
en las gram negativas est compuesta por varias capas y es bastante compleja, mientras
que en la pared en las gram positivas est formada fundamentalmente por un solo tipo de
molculas y suele ser ms ancha. Un examen detallado mediante microscopa electrnica
de barrido permite detectar diferencias claras en la textura de la superficie de los dos tipos
de paredes celulares.
Peptidoglicano:
En la pared celular de bacteria hay una capa rgida que es la responsable de la resistencia
de la pared celular. En bacteria gram negativas existen capas adicionales que se sitan en el
exterior de esta. Esta capa rgida tiene una composicin qumica muy similar tanto en
bacteria gram positivas como en gram negativas. Se denomina capa de peptidoglicano, esta
constituido por una lmina en la que las cadenas de derivados de azucares se conectan entre
s por puentes peptdicos a travs de los aminocidos.
En batera gram positivas, el peptidoglicano representa hasta el 90% de la pared, aunque
otra clase de componentes, los cidos teicoicos, tambin suelen estar presentes en
pequeas cantidades. Aunque algunas bacterias poseen solo una capa de peptidoglicano
rodeando a la clula, muchas otras, en especial las bacteria gram positivas, presentan varias
capas. En bacteria gram negativas, el peptidoglicano constituye solo alrededor del 10% de
pared, estando constituido el resto por una membrana externa. Sin embargo, tanto en gram
positivas como en gram negativas se cree que la forma de las bacterias viene determinada
por la longitud de las cadenas peptidoglicano y por el nmero y tipo de puentes establecidos
entre las cadenas.
Diagrama esquemtico de paredes celulares Gram positivas y Gram negativas.

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL 2014

Ao de la promocin de la industria responsable y del desarrollo sostenible

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA

INFORME DE LABORATORIO N 2 DE MICROBIOLOGA SANITARIA I

PROFESOR: JORGE TELLO

CANDIOTTI PORTILLO GIUSSEPPI

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 1

Para la coloracin de bacterias:

Interpretar el fundamento de las coloraciones en la prctica microbiolgica.

El microscopio, el instrumento ms peculiar del laboratorio de microbiologa, proporciona la

Microscopio de campo claro o luminoso.

Microscopio de campo oscuro o ultramicroscopio.

Microscopio de luz ultravioleta.

Microscopio de contraste de fases.

El microscopio electrnico, como su nombre lo indica, se basa en un haz de electrones en lugar de

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 2

MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO

Un microscopio ptico es un instrumento que consiste bsicamente en un tubo con lentes de

Un microscopio ptico tiene dos caractersticas fundamentales:

a. la calidad de las lentes

- clulas aplanadas sobre la superficie de un vidrio o, - finos cortes de tejidos suficientemente

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 3

El pie se encuentra en la base, suele tener forma

La columna o brazo, ubicada sobre el pie, sirve de

La platina, ubicada en la parte media, de forma

Consta de las lentes oculares, los objetivos y el condensador.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 4

1) Aumento primario: es el dado por el objetivo en s.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 5

Por lo tanto: a menor lmite de resolucin, mayor poder resolutivo

El lmite de resolucin se calcula del siguiente modo:

Antes de enfocar, el diafragma debe estar completamente abierto, gradundose a continuacin su

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 6

Se utilizan pocos aumentos y el microscopio con el que se efecta se denomina estereoscpico o

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 7

MANEJO DEL MICROSCOPIO

1. Levantar el tubo o bajar la platina.

2. Colocar la preparacin microscpica en la platina.

3. Colocar el objetivo de rastreo (menor aumento).

a. Colocar la lmpara a unos 25 cm.

6. Centrar el objeto debajo del objetivo mirando por el costado.

a. bajando levemente el condensador.

b. cerrando el diafragma lo necesario.

9. Buscar el mejor lugar para observar (bordes).

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 8

Tincin Simple: Utiliza un solo colorante.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 9

Tincin de Giensa: El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de

La tincin de Gram o coloracin Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa

La base de la reaccin diferencial de Gram es la estructura de la pared celular. Esta tcnica

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 10

Espacio periplasmtico: espacio entre la superficie

Conservan el complejo yodocolorante Pierden el complejo yodocolorante

Pueden ser anaerobios o aerobios

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 11

Causas que alteran la tincin de Gram

Bacterias resistentes a la tincin Gram

Mycobacterias (estn encapsuladas).

Caractersticas de la clula bacteriana

Proviene del griego kkkos, lo que se traduce

-Diplococo: Cocos en grupos de dos.

-Tetracoco: Cocos en grupos de cuatro.

-Estreptococo: Cocos en cadenas.