ESTUDIO MICROSCÓPICO DE LAS BACTERIAS Y SISTEMAS DE

COLORACIÓN.

Estudiantes de Microbiologia general, Ingeneria de Alimentos, Facultad de Ingenierìa, Universidad de

Córdoba, sede Berasategui

RESUMEN

La observación de bacterianas con el microscopio óptico. Puede realizarse por diferentes

procedimientos como son las observaciones directas de microorganismos o el tratamiento con
colorantes mediante tinción posita y negativa, procesos dirigidos a incrementar el contraste por
consiguiente a optimizar el resultado, la principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el
medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.
Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, capsula, pared celular, etc.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad especifica por los
materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados
negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Un ejemplo de coloración
catiónicos sería el azul de metileno, cristal violeta y safranina. Otros colorantes son moléculas
cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente, tales como proteínas. Algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula
haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se
denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se combina con un
constituyente celular y lo altera de tal modo que el colorante si lo pueda atacar.

Palabras claves: colorantes, celulas.

ABSTRACT

Bacterial observation with the optical microscope. It can be carried out by different procedures such
as direct observations of microorganisms or treatment with dyes by positive and negative staining,
processes aimed at increasing the contrast therefore to optimize the result, the main difficulty is the
lack of contrast between the cell and the medium surrounding it, and the simplest means of increasing
contrast is the use of dyes. These can be used to distinguish between different types of cells or to
reveal the presence of certain cellular constituents, such as flagella, spores, capsule, cell wall, etc.

Most dyes are organic compounds that have some specific affinity for cellular materials. Many
frequently used dyes are positively charged molecules (cations) and are intensively combined with
negatively charged cell constituents, such as nucleic acids and acidic polysaccharides. An example of
cationic coloration would be methylene blue, violet crystal and safranine. Other dyes are negatively
charged molecules (anions) and combine with positively charged cell constituents, such as proteins.
Some dyes will dye better only after the cell has been treated with another chemical, which is not a

1
dye by itself. This substance is called mordant; A common mordant is tannic acid. The mordant is
combined with a cellular constituent and alters it in such a way that the dye can attack it.
Keywords: colorants, cellules.
1.INTRODUCCIÓN
La práctica de laboratorio del estudio de
las bacterias y sistemas de coloración nos
enseña a que podemos observar
directamente al microscopio de campo
claro.
La tinción es un método sencillo para
incrementar el contraste entre la célula y
su entorno y por lo tanto contribuye a
mejorar la imagen observada. Las técnicas
de tinción con diversos colorantes facilitan
la observación al aumentar notablemente
el contraste.
Los métodos de tinción se realizan a partir
de suspensiones de microorganismos
extendidas en un portaobjetos (frotis),
secadas y fijadas.
La fijación, procedimiento que permite
preservar estructuras celulares, podemos
clasificarlas en dos tipos: fijación por calor
o fijación química.
Fijación por calor: consiste en pasar el
portaobjetos, con la suspensión bacteriana
extendida y seca, a través de una llama de
un mechero.
Fijación química: se utiliza para preservar
las estructuras celulares, se pude hacer con
agentes como etanol, formaldehido y ácido
acético etc.
Se pueden usar dos tipos de
procedimientos: tinción positiva en la cual
un colorante se une a ciertas estructuras
microbianas.
Entre los colorantes que se unen por
enlaces covalentes destaca el reactivo de
Schif, utilizado para la tinción de DNA,
donde el colorante se une a la desoxi-
ribosa.
Tinción negativa: se utilizan compuestos
que no penetran en las células, sino que
impregnan el medio circundante. Los
microorganismos aparecen refringentes
sobre un fondo negro.
a) Examen en fresco: se utiliza para
observar las características de
movilidad, presencia de capsulas,
etc. En estos montajes muchas
veces no se aprecian muy bien las
células debido a la falta de
contraste por eso es necesario
realizar las tinciones.
b) Frotis teñido: el estudio de frotis
fijado y teñido es de gran utilidad,
ya que permite determinar la
forma, tamaño, disposición,
formación de esporas, ubicación y
número de flagelos y la
composición de la pared celular por
su comportamiento frente a las
coloraciones de Gram o Zielh-
Neelsen. La célula bacteriana se
tiñe fácilmente con colorantes
básicos como el cristal violeta, azul
de metileno y fucsina, pero
2
 pobremente con colorantes ácidos
como la eosina, esto se debe al
carácter ácido del protoplasma de
esta célula.
● Preparar frotis a partir de cultivos
bacterianos en medios sólidos y
líquidos.
● Realizar frotis a partir de secreción
faríngea.
● Teñir los diferentes frotis con las
correspondientes tinciones.

3. MATERIALES

● Portaobjeto
● Cubreobjetos
Bacilos negativos.
● Baja lenguas
Se conocen varios tipos de sistema ● Asas bacteriológicas
decoloración tales como: ● Mecheros
● Cultivos en medios sólidos y
1. coloración simple: utiliza un solo líquidos.
colorante, las células se observan todas ● Trípodes
de un mismo color. ● Mallas de asbesto
● Colorantes de las diferentes
Ejemplo: coloración de azul de metileno. tinciones.

2. coloración diferencial: utiliza dos 4. PROCEDIMIENTO

colorantes, primero actúa un colorante
sobre las células bacterianas luego, 4.2.3. frotis de secreción faríngea
viene un proceso de decoloración con
alcohol, y por ultimo actúa otro 1. visualizar con el bajalengua el área
colorante como contraste. Las células de las amígdalas.
dependiendo de la composición
2. Tomar una muestra con el
química de la pared celular van a tomar
escobillón, frotando y haciendo presión
el color del primer colorante o del
sobre la zona.
colorante de contraste.
3.Extender uniformemente con el
Coloración de estructuras: se usa para
escobillón la secreción sobre el
identificar la presencia de ciertas
portaobjetos.
estructuras en las células bacterianas tales
como esporas o cápsulas. 4.Dejar secar al aire.

Ejemplo: schaeffer-fulton y Hiss. 5.Fijar con calor.

2. OBJETIVOS 6.Colorear de acuerdo con lo que se

investiga.
● Realizar un montaje en fresco a
partir de agua sucia estancada.

3
4.3 coloraciones o tinciones
4.3.1. coloración con azul de metileno.
1. realizar un frotis de secreción faríngea y
fijarlo con calor.
2.Cubrir la lámina con azul de metileno
por dos minutos.
3. lavar con agua destilada.
4. dejar secar al aire.
5.observar al microscopio con objetivo de
inmersión.
6. reportar la morfología y disposición de
las bacterias.
4.3.2. coloración de Gram
1. realizar un frotis a partir de un cultivo
en medio líquido.
2. dejar secar al aire y fijar con calor.
3. cubrir el portaobjetos con CRISTAL
VIOLETA por 1 minuto.
4. lavar con agua destilada.
5. adicionar lugol por 1 minuto.
6. lavar con agua destilada.
7. decolorar con alcohol acetona por 14
segundos.
8. lavar con agua destilada.
9. cubrir la lámina con safranina de Gram
por 30 segundos.
10. lavar con agua destilada.
11.dejar secar y observar al microscopio
con objetivo de inmersión.
12. reportar la morfología y disposición de
las bacterias.
4.3.3 coloración de Zielh-Neelsen (ácido
alcohol resistentes)
1. realizar un frotis a partir de una muestra
de tierra.
2. dejar secar al aire y fijar con calor.
3.cubrir el portaobjeto con fucsina básica y
calentar con el mechero hasta la emisión
de vapores sin dejar hervir durante 10
minutos.
4. dejar enfriar.
5. lavar con agua destilada.
6. decolorar con alcohol acido
7. lavar con agua destilada.
8. adicionar azul de metileno por 2
minutos.
9. lavar con agua destilada.
10.dejar secar y observar al microscopio
con objetivo de inmersión.
11. reportar lo observado.
4.3.4. coloración de schaeffer-fulton
(esporas).
1. realizar un frotis a partir de un cultivo
de Bacillus sp de 18 a 24 horas.
2. dejar secar al aire y fijar con calor.
3. cubrir el portaobjeto con verde de
malaquita y calentar con el mechero
durante 30 segundos.
4
4. dejar enfriar.
5. lavar con agua destilada.
6. adicionar safranina al 0,5% por 1
minuto.
7. lavar con agua destilada.
8. dejar secar y observar al microscopio
con objetivo de inmersión.
9. reportar lo observado.
4.3.5. coloración de Hiss (capsula).
1. realizar un frotis a partir d un cultivo de
klebsiella pneumonie de 36 a 48 horas.
2. dejar secar al aire y no fijar con calor.
3. cubrir el portaobjeto con colorante de
Hiss o solución acuosa al 1% de cristal
violeta.
4. lavar con solución acuosa al 20% de
sulfato de cobre.
5. dejar secar y observar al microscopio
con objetivo de inmersión.
6. repostar lo observado.
5. RESULTADOS
1. SCHAEDDER-FULTON
(ESPORAS).
figura 1
Las esporas Son estructuras refrigerantes
resistentes a condiciones abversas, a partir
de la figuras 1 y 2 que gran parte de las
bacterias que se encuentran en su forma es
vegetativa (fucsia) que escasamente se
encuentran en forma de esporas verdes.
Esto se debe a la envuelta de la
endoesporas son más complejas e
impredecible que la envuelta en la célula
vegetales en las que su forma se puede
teñir el contenido de esporas alterando su
en vuelta, la impermeabilidad de las
cubiertas dificulta que las endosporas de
colores una vez teñidas el verde de
malaquita es un colorante debilitante
básico y por lo tanto se une débilmente a la
bacteria, por tal razón se calienta la
preparación mientras esto ocurre el verde
malaquita penetran en las células
vegetativas y también penetra en las
endosporas, aun así después de calentado
El verde de malaquita es eliminado
posteriormente al enjuagar con agua sólo
quedando teñido de verde las esporas, Con
la cefradina puesto que es un colorante de
contraste que sólo tiñe a las células
vegetativas después del lavado con agua.
(5).
2. COLORACIÓN DE AZUL DE
METILENO
figura 2. (objetivo de imersion)
5

Figura 3. (objetivo de 40X)
Observamos en el microscopio primero
con el objetivo de x40 en este pudimos
observar un núcleo azul consecuente al
tinte azul de metileno. Pudimos ver q las
células muertas del interior de la faringe y
observamos que confirma la teoría que nos
dice que es un tinte de tinción simple que
se usa para observar las bacterias, cabe
resaltar que la tinción al ser simple colorea
todo del mismo color azul y no se usa para
diferenciar los tipos de bacteria.
En el objetivo de inmersión se observaron
pequeñas partículas teñidas de azul de
metileno, este tiñe las estructuras del
citoplasma de las bacterias. Esta tinción
nos sirve para observar las características
fisiológicas de las bacterias como su
forma, disposición y tamaño, tal es el caso
de la imagen que observamos donde
podemos determinar la morfología, la
forma y la disposición de cocos de ciertas
bacterias en el cual observamos parejas de
cocos llamados diplococos y en cadenas
filamentosas redondas. (2)
3. COLORACIÓN DE GRAM
(COLORACIÓN DIFERENCIAL).
Al observar de forma analítica la muestra
teniendo en cuenta que fue implementada
con varios colorantes de manera
combinada, sabiendo que la estructura
celular de la muestra es diferente por
función de los diferentes colorantes fijados
de acuerdo con su propiedad química las
celular que encontramos fueron
staphylococus aureus (cocos gram
positivos) con características generales
como:
 forma esferica
 color violeta
 catalasa postiva
 ausencia de endosporas
figura 4.
Tinciones diferenciales
Se utilizan para distinguir entre tipos de
microorganismos. La técnica de tinción
diferencial consta de dos etapas: una
tinción simple seguida de una tinción de
contraste. En la tinción de contraste se
utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto,
revela) las células no teñidas por el primer
- colorante. Estas tinciones son muy
utilizadas en microbiología.(3)
Características generales.
Staphylococcus aureus, (Gram positiva).
● Color Violeta.
● Forma esférica.
6
 ● Ausencia de endosporas.
● Se diferencia en varios grupos por
la enzima catalasa.
● Catalasa positiva.
Escherichia coli, (gram negativo).
● Color rosadas.
● No forman esporas.
● Móviles en flagelos peritricos.
● Catalasa positiva.
● Oxidasa negativa.
· Reducen nitratos a nitritos
¿Cómo se ven las bacterias tras realizar
una tinción de Gram?
A través de la tinción de Gram pueden
valorarse la afinidad tintorial, forma y
agrupaciones de las bacterias.
-Afinidad tintorial. Permite dividir a las
bacterias en Gram positivas (violetas) que
retienen el colorante principal tras la
decoloración con alcohol o alcohol-
acetona y gramnegativos (rojas) que
pierden el colorante principal tras la
decoloración por lo que es necesario
aplicar un colorante de contraste para
visualizarlas. Esta diferencia de coloración
está basada en la diferencia estructural de
la pared. En las Gram positivas el
colorante se fija fuertemente al
peptidoglicano que lo "retiene" e impide
que "salga" con el decolorante. En los
gramnegativos el colorante es retenido con
menos fuerza al ser más delgada la capa de
peptidoglicano. Además, la mayor
cantidad de lípidos presentes hace que el
colorante se elimine al solubilizar los
lípidos en el alcohol. (3)
4. COLORACIÓN DE ZIELH-
NEELSEN (MUESTRA DE TIERRA)
Figura 5.
Tincion de zielh-Neelsen es una técnica de
coloración para el identificar
microorganismos acido alcohol resistente.
es una técnica que está en la pared celular
de la batería. La pared está formada por
una clase de ácido grasos llamados ácidos
micolicas (presentan cadenas muy largas
por eso se caracterizan) cuando los
colorantes tiñen estructuras muy largas,
estos pueden retener los colorantes con
mayor facilidad está tinción de utiliza con
7
un compuesto fenólico carbono fucsina o
fucsia basica( roja púrpura). Un colorante
básico este tiene la capacidad de
interactuar con los ácidos grasos de la
pared celular.

cultivo de klebsiella pheumonie estás

El alcohol-acido lo utilizamos
decolorar las células que no se tiñeron
porque su pared no era lo bastante a fin al
colorante, por lo tanto la fuerza del
decolorante ácido es capaz de eliminar el
colorante. las células que si resistieron a la
coloración se llaman acido-resistente. De
esta manera observamos que en la muestra
de tierra (figura 5) no hubo ni una bacteria
alcohol ácido resistente puesto a qué lo
que observamos son bacilos y que adquirió
colorante secundario que es el azul de
metileno que este tiñe el material de fondo
y crea un contraste a las estructuras que
fueron teñidas de fuscia. (1)
5. Coloración de Hiss (Cápsula)
Figura 6.
Sabiendo que la cápsula es una envoltura
lexa, mucos, y viscosa qué encarga de la
adherencia y protección de la fagocintesis.
Esta es una tinción qué fue diseñada para
teñir estructuras concretas que poseen
ciertas bacterias como es el caso de la
cápsula. La tensión se realizó a partir de un
para
bacterias son gram negativas con forma de
bacilos bacteria es conocida hospitales,
esta es un microorganismo resistencia
antibióticos, lo que se le ha asignado
dentro del grupo de las "superbacterias" el
fin de observar la cápsula de la klebsiella
pheumonie. observamos una batería de
color violeta gracias a la adición del cristal
Violeta que penetra la pared celular,
retomando así el colorante, mientras
observamos que la cápsula quedan
levemente teñido pato de cobre, el cual el
de una diferencia osmótica que permite la
difusión del colorante desde el citoplasma
hasta la superficie externa a la bacterias
capsuladas de esta manera la bateria Se
observa de manera intensa por la
concentración del cristal Violeta más el
sulfato de cobre. De acuerdo a los
resultados obtenidos en la figura 6 solo se
distingue un poco el color violeta pálido
transparente esto es debido al
microorganismo que puede estar sucio o la
muestra contaminada. (4)

8
 6. CONCLUSIÓN

De este laboratorio se puede concluir que fosfórico. Prospect. 2017, 15 (2):

logramos identificar y reconocer los 60-73
distintos tipos de grupos de bacterias como
las Gram negativas, Gram positivas. 3. Bannerman TL, Hancock GA,

Alcohol resistente entre otras, por ende, Tenover FC. Miller JM. Pulsed-
también aprendimos a reconocer si eran Field gel electrophoresis as a
cocos o bacilos, esporas que fueron replacement for bacteriophage
algunas que observamos en el typing of Staphylococcus aureus. J
microscopio. Clin Microbiol 1995; 33:551-555.

También para la identificación de

4. Abbot S L. Klebsiella,
bacterias en el laboratorio utilizamos
Enterobacter, Citrobacter, Serratia,
diferentes tipos de colorantes ya sean en el
Plesiomonas, and other
medio líquido y solido
Enterobacteriaceae. En: Murray
7. BIBLIOGRAFÍA PR, editor. Manual of Clinical
Microbiology. 9 ed. Washington:
1. Mora-Ordóñez J, Sánchez-Llorente
ASM Press; 2007. p. 698-711.
F, Galeas-López J, Hernández
Sierra B, Prieto-Palomino M, Vera- 5. Pérez R, Juárez M, Rodríguez
Almazán A. Utilización de azul de (2011). Manual de Laboratorio de
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síndrome vasopléjico del Departamento de Ciencias Básicas
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Remoción de azul de metileno de
soluciones acuosas utilizando
cáscara de yuca (Manihot
esculenta) modificada con ácido

9
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