MICROBIOLOGIA APLICADA

Manual de Laboratorio
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PRACTICA Nm. 3
PREPARACIONES DE EXTENSIONES O FROTIS Y TINCION SIMPLE

I. OBJETIVO

Conocer el procedimiento para preparar extensiones frotis y los diferentes
mtodos de tincin, as como su utilidad en el estudio microscpico de los
microorganismos.


II. INTRODUCCION

Un procedimiento til para el examen de muestras es el estudio microscpico de
preparaciones fijas - extensiones o frotis - preparados a partir de ellas y
coloreadas por el mtodo adecuado. Esto permite eliminar el movimiento que
presentan los microorganismos en las preparaciones en fresco. La retencin de
colorantes de alquitrn de hulla por las bacterias permite su fcil observacin bajo
el microscopio.

La forma ms comn de preparar un frotis es extender un poco de muestra sobre
un portaobjetos desengrasado, con el asa bacteriolgica, pero tambin se puede
hacer con un hisopo presionando el portaobjetos sobre la muestra impronta.

Dependiendo del tipo de microorganismo o estructura del mismo que se desee
observar es el tipo de tincin que se emplea. P. ej. Tincin Simple, Diferencial de
Gram, Negativa, para cpsulas (Mtodo de Anthony), para flagelos, para
endosporas, para ncleo, para bacterias cido alcohol resistentes (Tincin de Ziehl
Neelsen), entre otras.

Los colorantes son productos qumicos sintticos del tipo de la anilina capaces de
combinarse con una gran variedad de sustancias impartindoles color. El color es
impartido por su estructura qumica.

Los colorantes de alquitrn de hulla usan bases de anillos aromticos tales como
benceno, naftaleno o antraceno. Varios grupos qumicos son ligados a los anillos
aromticos para impartir los diferentes colores. Los grupos productores del color
son llamados cromforos, siendo los ms comunes p-quinona y diazo.

Ciertos grupos qumicos llamados auxocromos, tales como los grupos amino e
hidroxilo ayudan a fortalecer a los cromforos.
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Las propiedades cidas o bsicas de los colorantes permiten su fcil clasificacin
en:

Acidos.

Estos ionizan en soluciones acuosas para producir un ncleo colorante con
carga (-), es decir el grupo inico que imparte el color tiene carga negativa, o
sea, es un anin. Estos colorantes tien material citoplasmtico, no son muy
usados en Microbiologa. Por ejemplo: eosina, rojo congo, fucsina cida

Bsicos.

En los que el ion que lleva el color tiene carga (+). Estos colorantes tienen
afinidad por el material nuclear y otros componentes. Estos son los ms
usados en microbiologa, ya que debido a la gran cantidad de ribosomas que
contienen cido ribonucleico en todo el protoplasma de la clula bacteriana,
stas se tien fcilmente. Ej. Azul de metileno, fucsina bsica, cristal violeta.

Neutros.

Se obtienen cuando se mezclan colorantes cidos y bsicos, donde la carga
elctrica de stos es cero. P ej. Giemsa, derivado de sal de amonio y eosina.


Tincin Simple.

Se denomina as, porque solo se utiliza un colorante, generalmente bsico.

Con este tipo de coloracin no se pretende diferenciar microorganismos o
estructuras celulares.

Las tcnicas de coloracin simple pueden ser positivas cuando el colorante es
fijado por las clulas apareciendo los microorganismos de color oscuro o
coloreado sobre un fondo luminoso o claro, y son negativas cuando los
microorganismos no fijan el colorante, en cuyo caso el fondo es el que se tie y los
microorganismos aparecen brillantes sobre fondo oscuro.


III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS

4 portaobjetos.
Gradilla.
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Asa bacteriolgica.
Mechero Bunsen.
Cerillos encendedor.
Lpiz graso.
Papel absorbente.
Hisopos.
Microscopio.
Aceite de inmersin.
Cristal violeta.
Azul de metileno.
Verde de malaquita.
Safranina.
Cultivo en medio slido.
Cultivo en medio lquido.


IV. TECNICA

A. Preparacin de Extensiones o Frotis.

Se debern emplear portaobjetos perfectamente limpios y sin raspaduras para
evitar interferencias en la observacin.

1. Flamear el portaobjetos para desengrasarlo.

2. Si el cultivo es slido, colocar una gota de agua en el centro del portaobjetos, y
con el asa bacteriolgica estril, tomar una pequea cantidad de material,
emulsionar y extender uniformemente en una superficie aproximada de 1 cm
2
.

3. Si la muestra es lquida, tomar directamente el material con el asa estril y
extenderlo uniformemente sobre la superficie indicada anteriormente.

4. Dejar secar la extensin al aire.

5. Una vez seca la extensin, fijarla al calor suave, pasando rpidamente el
portaobjetos sobre la flama del mechero, sin calentar demasiado, unas 10
veces.

Las extensiones debern ser finas y uniformes para permitir el paso de la luz a
travs de ellas y facilitar su observacin. (Fig. 3.1)

Preparar 2 extensiones a partir de cada cultivo.
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B. Tincin.

1. Cubrir la extensin debidamente preparada con la solucin colorante.

2. Dejar actuar el colorante por 1 minuto.

3. Lavar con agua corriente hasta eliminar exceso de colorante.

4. Dejar secar al aire o presionando el portaobjetos entre 2 capas de papel
absorbente como papel filtro papel sanitario.

5. Una vez seca la extensin, colocar sobre ella una gota de aceite de inmersin y
observar al microscopio con el objetivo de inmersin.

6. Dibujar lo observado:












Cultivo en medio slido. Cultivo en medio lquido.


V. CUESTIONARIO

1. Consultar las estructuras de 2 colorantes cidos y 2 bsicos.

2. Qu significa fijar la extensin y qu sucede durante este proceso?
Mencionar otros 2 mtodos de fijacin.

3. Qu caracterstica presenta el aceite de inmersin?

4. Por qu es necesario teir las extensiones?

5. Consultar otras 2 tcnicas para la preparacin de extensiones.
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