CAPITULO

Aminoácidos y proteínas
2 Ryoji Nagai y Naoyuki Taniguchi

OBJETIVOS DE APREN DIZAJE AMINOÁCIDOS

as leer este capítulo, el lector debe ser capaz de: Los aminoácidos son los bloques de construcción
de las proteínas
Clasificar los aminoácidos a partir de su estructura química
y su carga. Estereoquímica: configuración
Explicar el significado de los términos pKa y pl tal como se
en el carbono a, isómeros d - y l-
aplican a aminoácidos y proteínas.
Describir los elementos de la estructura primaria, secundaria,
Cada aminoácido tiene un carbono central, denominado carbo­
terciaria y cuaternaria de las proteínas.
no a, al cual se unen cuatro grupos diferentes (fig. 2 .1 ):
Describir los principios del intercambio iónico
y la cromatografía de filtración en gel, así como de la ■ Un grupo amino básico (-NH2).
electroforesis y del isoelectroenfoque, además de describir ■ Un grupo carboxilo ácido (-COOH).
su aplicación en la caracterización y aislamiento
■ Un átomo de hidrógeno (-H).
de las proteínas.
■ Una cadena lateral característica (-R).

Uno de los 20 aminoácidos, la prolina, no es un a-aminoácido sino

INTRODUCCIÓN
Las proteínas son los principales polím eros estructurales
y funcionales en los seres vivos
Las proteínas desempeñan una amplia gama de funciones, como
la catálisis de reacciones metabólicas y el transporte de vitaminas,
minerales, oxígeno y combustibles. Algunas proteínas constituyen
la estructura de los tejidos, mientras que otras actúan en la trans­
misión nerviosa, la contracción muscular y la motilidad celular,
otras lo hacen en la coagulación de la sangre y las defensas in-
munitarias, y otras como hormonas y moléculas reguladoras. Las
proteínas son sintetizadas como una secuencia de aminoácidos
unidos formando una estructura poliamida (polipéptido) lineal,
pero adoptan estructuras tridimensionales complejas al realizar
sus funciones. Hay alrededor de 300 aminoácidos en los sistemas
animales, vegetales y microbianos, pero solamente 2 0 am inoá­
cidos están codificados por el ADN p ara ap arecer en las
proteínas. Muchas proteínas también contienen aminoácidos
modificados y componentes accesorios, denominados grupos
prostéticos. Se utilizan diversas técnicas químicas para aislar y
caracterizar proteínas en función de diferentes criterios, como
masa, carga y estructura tridimensional. La proteómica es un
campo emergente que estudia la expresión de las proteínas en
una célula u organismo y los cambios en la expresión de una
proteína en respuesta al crecimiento, a las hormonas, al estrés y
al envejecimiento.
un a-iminoácido (v. más adelante). Exceptuando la glicina, todos
los aminoácidos contienen al menos un átomo de carbono asimé­
trico (el átomo de carbono a), dando lugar a dos isómeros que
son ópticam ente activos, es decir, que pueden desviar el plano
de la luz polarizada. Se dice que estos isómeros, denominados es-
tereoisómeros o enantiómeros, son quirales, una palabra derivada
del término griego para mano. Dichos isómeros son imágenes es­
peculares no superponibles, de forma análoga a lo que ocurre con
la mano derecha y la izquierda, como se muestra en la figura 2 .2 .
Las dos configuraciones de los aminoácidos se denominan D (para
la dextro o derecha) y l (para la levo o izquierda). Todos los ami­
noácidos en las proteínas son de configuración L, ya que las
proteínas son biosintetizadas por enzimas que insertan solamente
L-aminoácidos en las cadenas peptídicas.
Átomo de hidrógeno
T
H
GT T ° h2n - c - c o o h
R
t
Cadena lateral
Fig. 2.1 Estructura de un aminoácido. Excepto para la glicina, cuatro
grupos diferentes se unen al carbono a de un aminoácido. En la tabla 2.1
se enumeran las estructuras de los grupos R.

20 1 5 . Elsevier España, S.L.U. Reservados todos los derechos

 CAPÍTULO 2 Am inoácidos y proteínas

Clasificación de los aminoácidos según Tabla 2.1 Los 20 aminoácidos encontrados en proteínas*
la estructura química de sus cadenas laterales
Aminoácidos Estructura de la porción R
Las propiedades de cada aminoácido dependen de su cadena lateral Aminoácidos alifáticos
(-R); las cadenas laterales son los grupos funcionales que determi­ Glicina (Gly, G) —H
nan la estructura y la función de las proteínas, así como la carga Alanina (Ala, A) —ch3
eléctrica de la molécula. Para comprender los métodos de análisis, Valina (Val, V) /CH3
purificación e identificación de las proteínas es importante conocer — ch
\
las propiedades de estas cadenas laterales. Los aminoácidos con ch3

cadenas laterales cargadas, polares o hidrofilicas normalmente Leucina (Leu, L) /CH3

se encuentran expuestos en la superficie de las proteínas. Los
residuos hidrofóbicos apolares normalmente se encuentran ente­
rrados en el interior hidrofóbico o núcleo de una proteína y no Isoleucina (lie, I) ch3

están en contacto con el agua. Los 20 aminoácidos que forman I

-C H — CH2— CH3
parte de las proteínas y están codificados en el ADN se enumeran
en la tabla 2 .1 y se clasifican según los grupos funcionales de su Aminoácidos que contienen azufre
Cisterna (Cys, C) - ch 2— SH
cadena lateral.
Metionina (Met, M) ■CH?— CH,— S— CH,

Aminoácidos aromáticos
Aminoácidos alifáticos Fenilalanina (Phe, F)
Los aminoácidos alifáticos (alanina, valina, leucina e isoleucina)
tienen hidrocarbonos saturados como cadenas laterales. La gli­ Tirosina (Tyr, Y)
cina, que solamente tiene un hidrógeno como cadena lateral, se
incluye también en este grupo. La alanina tiene una estructura
Triptófano (Trp, W)
relativamente simple, un grupo metilo como cadena lateral, mien­
tras que la leucina y la isoleucina tienen grupos see- e iso-butilo.
Todos estos aminoácidos son hidrofóbicos.
Iminoácido
Prolina (Pro, P)
Aminoácidos aromáticos
La fen ila lan in a, la tirosina y el triptófano tienen cadenas
laterales aromáticas
Los aminoácidos apolares alifáticos y aromáticos suelen encon­ Aminoácidos neutros
trarse enterrados en el interior de la proteína y están involucrados Serina (Ser, S)
en interacciones hidrofóbicas entre ellos. La tirosina tiene un gru­ Treonina (Thr, T)
po hidroxilo débilmente ácido y puede localizarse en la superficie

Asparagina (Asn, N)

Glutamina (Gin, Q)
- c h 2- c h 2- c

Aminoácidos ácidos
Ácido aspártico (Asp, D)
Ácido glutámico (Glu, E) — CH2-C H j— c o o h

Aminoácidos básicos
Histidina (His, H)

K
nV nh
Lisina (Lys, K) —CHj—CHj—CH2—CHj—NHj
D-serina L-serina
Arginina (Arg, R) — CHj— CH2— CH2— NH— c — NH2

Fig. 2.2 Enantiómeros. Par de imágenes especulares de los ami­ NH

noácidos. Cada aminoácido representa una imagen especular no

superponible. Las imágenes especulares de los estereoisómeros se *Entre paréntesis se muestran las abreviaturas de tres letras
denominan enantiómeros. En las proteínas solamente se encuentran y de una letra de uso corriente.
los L-enantiómeros.
 CAPÍTULO 2 Am inoácidos y proteínas 7

de las proteínas. La fosforilación reversible del grupo hidroxilo de
la tirosina en algunas enzimas es importante en la regulación
de las vías metabólicas. Los am inoácidos arom áticos son res­
ponsables de la absorción ultravioleta de la m ayoría de
las proteínas, que p resen tan un m áxim o de absorción a
unos 2 8 0 nm. El triptófano tiene una absorción mayor en esta
región que los otros dos aminoácidos aromáticos. El coeficiente de
absorción molar de una proteína es útil para determinar la concen­
tración de una proteína en disolución mediante espectrometría.
En la figura 2.3 se muestra el espectro de absorción típico de los
aminoácidos aromáticos y de una proteína.
CONCEPTOS AVANZADOS
AMINOÁCIDOS QUE NO FORMAN
PARTE DE PROTEÍNAS
Algunos aminoácidos aparecen en estado libre o combinado, pero
no en proteínas. La cuantificación de aminoácidos anormales en
orina (aminoaciduria) es útil para el diagnóstico clínico (v. cap. 19).
En el plasma, los aminoácidos libres normalmente se encuentran
a concentraciones de 10-100 mmol/l, incluidos muchos que no se
encuentran en proteínas. La citrulina, por ejemplo, es un metabolito
importante de la L-arginina y un producto de la óxido nítrico sintasa,
una enzima que produce óxido nítrico, una importante molécula de
señalización vasoactiva. La concentración urinaria de un aminoácido
se expresa normalmente en p,mol/g de creatinina. La creatinina es un
aminoácido que proviene del músculo y que se excreta en cantidades
relativamente constantes por unidad de masa corporal por día. De
este modo, la concentración de creatinina en orina, que normalmente
es de alrededor de 1 mg/ml, puede utilizarse para corregir la dilución
de la orina. El aminoácido más abundante en la orina es la glicina,
que está presente en cantidades de 400-2.000 mg/g de creatinina.
Aminoácidos polares neutros
Los aminoácidos polares neutros contienen grupos hidroxilo o
amida en su cadena lateral. La serina y la treonina contienen
grupos hidroxilo. Estos aminoácidos se encuentran a veces en
los centros activos de proteínas catalíticas, las enzimas (cap. 6).
La fosforilación reversible de los residuos de serina y treonina
periféricos en la molécula enzimática también está involucrada en
la regulación del metabolismo energético y del almacenamiento
de combustible en el organismo (cap. 13). La asparagina y la
glutam ina tien en cad en as la te ra le s co n grupos am ida.
Éstas son polares, pero en condiciones fisiológicas carecen
de carga. La serina, la treonina y la asparagina son los principales
lugares de unión de azúcares a proteínas, formando las gluco-
proteínas (cap. 26).
Aminoácidos ácidos
Los ácidos aspártico y glutámico contienen ácidos carboxílicos
en sus cadenas laterales y están ionizados a un pH de 7,0 y, como
resultado, transportan cargas negativas en sus grupos carboxi-
lo (3 y 7 , respectivamente. En el estado ionizado, estos aminoácidos
se denominan aspartato y glutamato, respectivamente.
Aminoácidos básicos
Las cadenas laterales de la lisina y la arginina están completa­
mente protonadas a pH neutro y, por tanto, están cargadas positi­
vamente. La lisina contiene un grupo amino primario (NH2) uni­
do al carbono terminal e de la cadena lateral. El grupo e-amino
de la lisina tiene un pKa de aproximadamente 11. La arginina

1,0 1
Triptófano

0,8 -

.2 0,6 -

1
I 0,4 -
© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.

0,2 -

0,0
260 280
Longitud de onda (nm) Longitud de onda (nm)

Fig. 2.3 Espectros de absorción ultravioleta de los aminoácidos aromáticos y de la albúmina sérica bovina. (A) Aminoácidos aromá­
ticos como el triptófano, la tirosina y la fenilalanina tienen un máximo de absorbancia a aproximadamente 280 nm. Cada proteína purificada
tiene un coeficiente de absorción distinto de alrededor de 280 nm dependiendo de su contenido en aminoácidos aromáticos. (B) Una disolución de
albúmina sérica bovina (1 mg disuelto en 1ml de agua) tiene una absorbancia de 0,67 a 280 nm utilizando una cubeta de 1cm. El coeficiente
de absorción de las proteínas se expresa con frecuencia como E,% (10 mg/ml de solución). Para la albúmina, E1%280nm = 6,7. Aunque las
proteínas varían en su contenido de Trp, Tyr y Phe, las mediciones de absorbancia a 280 nm son útiles para la estimación de la concentración
de proteínas en las disoluciones.
 CAPÍTULO 2 Am inoácidos y proteínas

es el aminoácido más básico (píCa de aproximadamente 13) y

su grupo guanidina existe como ion guanidinio protonado a un
pH de 7,0.
La histidina (pKa de aproximadamente 6) tiene un anillo imida-
zólico como cadena lateral y actúa como catalizador ácido-básico
general en numerosas enzimas. La forma protonada del imidazol
se denomina ion imidazolio.
Aminoácidos que contienen azufre
La cisteína y su forma oxidada, la cistina, son aminoácidos que
contienen azufre y que se caracterizan por su baja polaridad.
La cisteína desempeña un papel importante en la estabilización
de la estructura de las proteínas, dado que puede participar en
la formación de puentes disulfuro con otros residuos de cis­
teína para formar residuos de cistina, con lo que las cadenas de
proteínas quedan entrelazadas y así se estabiliza la estructura
de la proteína. Dos regiones de una sola cadena polipeptídica,
alejadas una de otra en la secuencia, pueden estar unidas co-
valentemente a través de un puente disulfuro (puente disulfu­
ro intracatenario). Los p u en tes disulfuro también pueden
formarse entre dos cadenas polipeptídicas (puente disulfuro
intercatenario), formando dímeros proteicos covalentes. Estos
puentes pueden reducirse mediante enzimas o mediante agentes
reductores como el 2 -mercaptoetanol o el ditiotreitol para for­
mar residuos de cisteína. La metionina es el tercer aminoácido
que contiene azufre y tiene un grupo metil tioéter apolar en su
cadena lateral.
Clasificación de los aminoácidos
según la polaridad de las cadenas
laterales del aminoácido
La tabla 2.2 muestra los grupos funcionales de los aminoácidos
y su polaridad (hidrofilia). Las cadenas laterales polares pueden
intervenir en la unión del hidrógeno al agua y a otros grupos po­
lares y normalmente se encuentran en la superficie de la proteína.
Las cadenas laterales hidrofóbicas contribuyen al plegamiento de
la proteína mediante interacciones hidrofóbicas y se encuentran
principalmente en el interior de la proteína o en superficies que
intervienen en interacciones con otras proteínas.
Estado de ionización de un aminoácido
Los aminoácidos son m oléculas anfóteras, es decir, tienen
tanto grupos básicos como ácidos
Los ácidos monoamino y monocarboxílico en disolución presentan
varias formas de ionización según el pH de la solución. A un pH
de 7, el «zwitterion» +H3N-CH2-COCT es la especie predominante
de la glicina en disolución, y la molécula global es, por tanto, eléc­
tricamente neutra. En la titulación a pH ácido, el grupo a-amino
resulta protonado y cargado positivamente, lo que da lugar al
catión +H3N-CH2-COOH, mientras que la titulación con álcalis
da lugar a la especie amónica H2N-CH2-COCT.
+h 3n c h 2 c o o h f J ^ t I j N c h , c o c r < oh~ >h 2n c h 2 c o c r

En la tabla 2 .3 se m uestran los valores de pKa para los gru­

Prolina, un iminoácido cíclico
La prolina se diferencia del resto de aminoácidos en que el anillo
de pirrolidina de su cadena lateral incluye el grupo a-amino y
el carbono a. Este iminoácido fuerza un «ángulo» en la cadena
polipeptídica, lo que causa algunas veces cambios abruptos en la
dirección de la cadena.
pos a-amino y a-carboxilo y de las cadenas laterales de aminoáci­
dos ácidos y básicos. La carga neta global de una proteína depende
de la contribución de los aminoácidos básicos (carga positiva) y
ácidos (carga negativa), pero la carga real en la proteína varía con
el pH de la disolución. Para entender cómo influyen las cadenas
laterales en la carga de las proteínas, es imprescindible recordar
la ecuación de Henderson-Hasselbalch.

Tabla 2.2 Resumen de los grupos funcionales de aminoácidos y su polaridad

Aminoácidos Grupo funcional Hidrofílico (polar) o hidrofóbico (apolar) Ejemplos

Ácido Carboxilo, -C00H Polar Asp, Glu

Básico Amino, -NH2 Polar Lys

Imidazol Polar His
Guanidina Polar Arg

Neutro Glicina, -H Apolar Gly

Amidas, -C0NH 2 Polar Asn, Gln
Hidroxilo, -OH Polar Ser, Thr,
Sulfhidrilo-SH Apolar Cys

Alifático Hidrocarburo Apolar Ala, Val, Leu, lie, Met, Pro

Aromático Anillos C Apolar Phe, Trp, Tyr

 CAPÍTULO 2 Am inoácidos y proteínas 9

Tabla 2.3 Valores de p Ka de los grupos ionizables en las proteínas

Ácido (forma protonada) H++ base (forma no protonada)

Grupo (ácido conjugado) (base conjugada) pKa
Residuo carboxilo terminal (a-carboxilo) -COOH (ácido carboxílico) -C 00 " + H+(carboxilato) 3,0-5,5

Ácido aspártico ((3-carboxilo) -COOH -C 00 " + H+ 3,9

Ácido glutámico (-y-carboxilo) -COOH -C00- + H+ 4,3

Histidina (imidazol) 6,0

V \
N^/NH + H+
(imidazolio) (imidazol)

Amino terminal (a-amino) -NH3+(amonio) -NH2 + H+(amina) 8,0

Cisterna (sulfhidrilo) -SH (tiol) -S" + H+(tiolato) 8,3

Tirosina (hidroxilo fenólico) 10,1

—^ ^ — OH —^ CT + H+

(fenol) (fenolato)

Lisina (e-amino) - nh3+ -NH2 + H+ 10,5

Arginina (guanidina) ,.n h 2 12,5

—NH—C ' ffi —NH—C ( + H
v nh 2 x NH2

(guanidino) (guanidino)

Los valores reales de pKapueden variar hasta tres unidades de pH en función de la temperatura, el amortiguador (o tampón), la fijación de ligando
y especialmente los grupos funcionales próximos en la proteína.

La ecuación (3) puede expresarse en términos de un logaritmo

Ecuación de Henderson-Hasselbalch y pKa
negativo:

La ecuación de Henderson-Hasselbach describe la

titulación de un aminoácido y puede usarse para predecir
la carga neta y el punto isoeléctrico de una proteína
La disociación general de un ácido débil, como el ácido carboxílico,
viene dada por la ecuación:
(1 ) HAí=tH++A"
donde HA es la forma protonada (ácido conjugado o forma asociada)
© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.
(4) - l o g [ H * ] = - l o g K ,- lo g í^
[A ]
Dado que el pH es el logaritmo negativo de [H+], es decir, -log[H+],
y el pKa es igual al logaritmo negativo de la constante de di­
sociación para un ácido débil, es decir, -log 2Ca, la ecuación de
Henderson-Hasselbalch (5) puede desarrollarse y utilizarse para
el análisis de los sistemas de equilibrio ácido-base:

y A- es la forma no protonada (base conjugada o forma disociada). [A ']

La constante de disociación (Ka) de un ácido débil se define como (5) pH=pKa +log
[HA]
la constante de equilibrio de la reacción de disociación (1 ) del ácido:

Para una base débil, como una amina, la reacción de disociación

_ [H*][A-]
(2 ) puede escribirse como sigue:
[HA]

(6) RNH3+^ H ++RNH2

La concentración de iones hidrógeno [H+] de una disolución de un
ácido débil puede calcularse como sigue. La ecuación (2) puede
reordenarse para dar: Y la ecuación de Henderson-Hasselbalch se convierte en:

[HA] [ r n h 2;
(3) [H+] = Kax pH=pKa+log
(7) [r n h ;
[ A ']
10 CAPÍTULO 2 Am inoácidos y proteínas

A partir de las ecuaciones (5) y (7) está claro que el grado de

pH < 2,4 2,4 < pH < 9,8 pH>9,8
protonación de los grupos funcionales ácidos y básicos y, por tanto,
+OH- r 5 +OH- ^ la carga neta variarán con el pKa del grupo funcional y el pH de la
H C -O H . , * H C -C H 3 , * H C -C H , disolución. Para la alanina, que tiene dos grupos funcionales con
+ H* I + H* pKa = 2 ,4 y 9 ,8 , respectivamente (fig. 2.4), la carga neta varía
COOH 000- 000-
con el pH, de +1 a -1 . En un punto intermedio entre p2Cal y pJCa2, la
alanina tiene una carga neta de cero. Este pH se denomina su
PH Catión Zwitterion Anión punto isoeléctrico, pl (fig. 2.4).

12 -

10 - AMORTIGUADORES O TAMPONES
íC = 9 ,8
Los aminoácidos y las proteínas son am ortiguadores
8-
excelentes en condiciones fisiológicas
Los amortiguadores son soluciones que minimizan un cambio
6- 0 pl = 6,1
en la [H+], es decir, en el pH, al añadir un ácido o una base. Una
disolución amortiguadora que contenga un ácido débil o una
4-
base débil y un ion de carga contraria tiene una capacidad de
amortiguación máxima a su pKa, es decir, cuando las formas ácidas
2-
y básicas están presentes a la misma concentración. La forma
ácida protonada reacciona con la base añadida y la forma básica
------------ 1------------ 1------------ no protonada neutraliza el ácido añadido, como se muestra a
continuación para un compuesto amino:
Equivalentes de OH"

Fig. 2.4 Titulación de un aminoácido. La curva muestra el número RNH3++OH" r n h 2 + h 2o

de equivalentes de NaOH consumidos por la alanina cuando se titula la r n h 2 + h + ^ r n h 3+
solución desde pH 0 a pH 12. La alanina contiene dos grupos ionizables:
un grupo a-carboxilo y un grupo a-amino. A medida que se añade
Una disolución de alanina (fig. 2.4) tiene una capacidad de amor­
NaOH, se titulan estos dos grupos. El pKa del grupo a-COOH es 2,4,
mientras que el del grupo a-NH3+es 9,8. A un pH muy bajo, la especie
tiguación máxima a pH 2 ,4 y 9,8, es decir, al pKa de los grupos
iónica predominante de la alanina es la forma catiónica completamente carboxilo y amino, respectivamente. Cuando se disuelve en agua,
protonada: la alanina existe como un ion dipolar, o zwitterion, en el que el
Í H3 grupo carboxilo no está protonado (-COO“) y el grupo amino está
protonado (-NH3+). El pH de la solución es 6,1 y el punto isoeléctrico,
+H3N — C H — COOH]
pl, el valor medio entre el pKa de los grupos amino y carboxilo. La
En el punto medio del primer estadio de la titulación (pH 2,4), hay curva de titulación de la alanina por NaOH (fig. 2.4) ilustra que la
concentraciones equimolares de las especies donadora y aceptora de
alanina tiene una capacidad de amortiguación mínima a su pl y una
protones, lo que proporciona un buen poder de tamponamiento.
[ ch3 | í CH3
capacidad de amortiguación máxima a un pH igual al pKax o al pKa2.

|+ h 3n — ch— cooh| |h 2n — C H — C00"

En el punto medio de la titulación global (pH 6,1), el zwitterion es la
forma predominante del aminoácido en disolución. El aminoácido tiene PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS
una carga neta de cero a este pH, ya que la carga negativa del ion car-
boxilado está siendo neutralizada por la carga positiva del grupo amonio.
Estructura primaria de las proteínas
í H’
+ H ;N — CH— C00"
La estructura prim a ria de las proteínas es la secuencia
Zwitterion lineal de sus aminoácidos
El segundo estadio de la titulación corresponde a la pérdida de un
En las proteínas, el grupo carboxilo de un aminoácido se une
protón por el grupo -NH3+de la alanina. El pH en el punto medio de este
estadio es 9,8, igual al pKadel grupo -NH3+. La titulación es completa a al grupo amino del aminoácido siguiente, formando un enlace
un pH de alrededor de 12, punto en el que la forma predominante de amida (péptido): durante la reacción se elimina agua (fig. 2.5).
la alanina es la forma aniónica no protonada:
Í H3 I
Ri R2 Ri 0 ^2
H2N— CH— COO'j i i 1 ii i
El pH en el que una molécula no tiene carga neta se conoce como punto H2N- CH - COOH + H2N- CH - COOH H2N- CH - C - NH - CH - COOH
isoeléctrico. Para la alanina, se calcula así: H20
Aminoácidos Dipéptido
pKa1+pK a2 _ (2,4 + 9, 8 ) _ 6 1
2 2 Fig. 2.5 Estructura de un enlace peptídico.

NH2 H o
HOOC C N COOH
n ' i ca (Lys, His, Arg) conferirán carga y capacidad de amortiguación a
0 |2 H
SH
Fig. 2.6 Estructura del glutatión.
CONCEPTOS AVANZADOS
GLUTATIÓN
El glutatión (GSH) es un tripéptido con la secuencia 7 -glutamil-cisteinil-
gliclna (fig. 2.6). Si el grupo tiol de la cisteína está oxidado, se forma el
disulfuro GSSG. El GSH es el principal péptido presente en la célula. En
el hígado, la concentración de GSH es de aproximadamente 5 mmol/l.
El GSH desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de
los residuos de cisteína de las proteínas en su forma reducida (sulfhi-
drilo) y en las defensas antioxidantes (cap. 37). La enzima 7 -glutamü
transpeptidasa participa en el metabolismo del glutatión y es un
biomarcador plasmático de algunas enfermedades del hígado, como
el carcinoma hepatocelular y la hepatopatía alcohólica.
Las unidades de aminoácidos de una cadena peptídica se deno­
minan residuos aminoácidos. Una cadena peptídica formada por
tres residuos aminoácidos se denomina tripéptido; un ejemplo es el
glutatión (fig. 2.6). Por convención, el amino terminal (N-terminal)
se considera el primer residuo y la secuencia de aminoácidos se
escribe de izquierda a derecha. Cuando se escribe la secuencia
peptídica se utilizan las abreviaciones de los aminoácidos con tres
letras o con una, como Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu o
D-R-V-Y-I-H-P-F-H-L (v. tabla 2.1). Este péptido es la angiotensina,
una hormona peptídica que influye sobre la presión arterial. El
residuo aminoácido que tiene un grupo amino libre en uno de los
extremos del péptido (Asp) se denomina aminoácido N-terminal
(amino terminal), mientras que el residuo que tiene un grupo
carboxilo libre en el otro extremo (Leu) se denomina aminoácido
C-terminal (carboxilo terminal). Las proteínas contienen entre 50
y 2 .0 0 0 residuos aminoácidos. La masa molecular media de un
residuo aminoácido es de alrededor de 110 unidades dalton (Da).
Por tanto, la masa molecular de la mayoría de las proteínas oscila
entre 5 .500 y 2 2 0.000 Da. La anhidrasa carbónica humanal, una
© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.
enzima que desempeña un cometido fundamental en el equilibrio
acidobásico en la sangre (v. cap. 24), es una proteína con una masa
molecular de 2 9 .0 0 0 Da (29 kDa).
Las cadenas laterales de los aminoácidos contribuyen
tanto a la carga como a la hidrofobicidad de las proteínas
La composición de aminoácidos de una cadena peptídica tiene un
efecto notorio en sus propiedades físicas y químicas. Las proteínas
ricas en grupos amino alifáticos o aromáticos son relativamente
insolubles en agua y se encuentran frecuentemente en las mem­
branas celulares. Las proteínas ricas en aminoácidos polares son
más hidrosolubles. Las amidas son componentes neutros, de
manera que el esqueleto amida de una proteína, que incluye los
grupos a-amino y a-carboxilo que lo forman, no contribuye a la
CAPÍTULO 2 Am inoácidos y proteínas 11
carga de la proteína. Más bien, la carga de la proteína depende de
los grupos funcionales de la cadena lateral de los aminoácidos. Los
grupos de aminoácidos con cadena lateral ácida (Glu, Asp) o bási­
la proteína. El balance entre cadenas laterales ácidas y básicas en
una proteína determina su punto isoeléctrico (pl) y la carga neta
en disolución. Las proteínas ricas en lisina y arginina son básicas en
disolución y tienen carga positiva a pH neutro, mientras que las
proteínas ácidas, ricas en aspartato y glutamato, son ácidas y tie­
nen carga negativa. Debido a los grupos funcionales de su cadena
lateral, todas las proteínas están más cargadas positivamente a pH
ácido y más cargadas negativamente a pH básico. Las proteínas
son una parte importante de la capacidad de tamponamiento de
las células y de los líquidos biológicos, incluida la sangre.
Estructura secundaria de las proteínas
La estructura secundaria de las proteínas está
determinada p or las interacciones m ediante puentes
de hidrógeno entre los grupos funcionales de las cadenas
laterales de los aminoácidos
La estructura secundaria de una proteína hace referencia a la
estructura local de la cadena polipeptídica. Esta estructura está
determinada por las interacciones mediante puentes de hidrógeno
entre el oxígeno del grupo carbonilo de una cadena peptídica y
el hidrógeno de amida de otro puente peptídico cercano. Existen
dos tipos de estructura secundaria: la hélice a y la hoja plegada (3.
Hélice a
La hélice a es una estructura en forma de varilla con la cadena
peptídica fuertemente enrollada y con las cadenas laterales de
los residuos aminoácidos extendiéndose hacia fuera del eje de la
espiral. Cada grupo carbonilo amídico está unido mediante un
puente de hidrógeno al hidrógeno del grupo amida de un enlace
peptídico que está a una distancia de cuatro residuos a lo largo de
la misma cadena. Hay un promedio de 3,6 residuos aminoácidos
por cada vuelta de la hélice y, en la mayoría de las proteínas na­
turales, la hélice gira hacia la derecha (en el sentido de las agujas
del reloj) (fig. 2.7A).
Hoja plegada f$
Si los enlaces de hidrógeno se forman lateralmente entre enlaces
peptídicos, las secuencias polipeptídicas se ordenan de forma pa­
ralela o antiparalela entre sí en una disposición que se denomina
hoja plegada (3. La hoja plegada (3 es una estructura extendida, a
diferencia de la hélice a, que está enrollada. Está plegada porque
los enlaces carbono-carbono (C-C) son tetraédricos y no pueden
existir en una configuración plana. Si la cadena polipeptídica dis­
curre en la misma dirección, forma una hoja p paralela (fig. 2 .7B),
pero, si sigue la dirección opuesta, forma una estructura antipa­
ralela. El giro o ángulo (3 hace referencia al segmento en el que el
polipéptido gira y cambia abruptamente de dirección. Los residuos
de glicina (Gly) y de prolina (Pro) aparecen con frecuencia en
giros (3 en la superficie de las proteínas globulares.
Fig. 2.7 Motivos de la estructura secundaria de las proteínas. (A) Una estructura secundaria a helicoidal. Los puentes de hidrógeno entre el «esqueleto»
de los grupos amida NH y C = O estabilizan la hélice a. Los átomos de hidrógeno de los grupos OH, NH o SH (donadores de hidrógeno) interaccionan con los
electrones libres de los átomos aceptares como el O, N o S. Aunque la energía de los enlaces es menor que la de las uniones covalentes, los enlaces o puentes
de hidrógeno desempeñan un cometido fundamental en la estabilización de las moléculas proteicas. La cadena lateral R de los aminoácidos se extiende hacia
fuera de la hélice. Se muestran también el modelo de bolas y varillas y el modelo compacto. (B) La estructura secundaria de hoja plegada (3 paralela. En la
configuración de hoja plegada 0, el esqueleto de la cadena polipeptídica se extiende en una estructura en zigzag. Cuando las cadenas polipeptídicas en zigzag
están dispuestas lado a lado forman una estructura que se parece a una serie de pliegues. Se muestran también el modelo de bolas y varillas y el modelo compacto.

Estructura terciaria de las proteínas

CONCEPTOS AVANZADOS
COLÁGENO
Los defectos genéticos que afectan al colágeno ilustran la estrecha
relación entre la secuencia de aminoácidos y la estructura tridimen­
sional. Los colágenos son la familia de proteínas más abundante
en los mamíferos, llegando a representar cerca de un tercio de las
proteínas corporales. Son un componente fundamental del tejido
conjuntivo, como el cartílago, los tendones, la matriz orgánica de
los huesos y la córnea del ojo.
Comentario. El colágeno contiene un 35% de Gly, un 11 % de Ala
y un 21 % de Pro e Hyp (hidroxiprolina). La secuencia de aminoáci­
dos en el colágeno generalmente es una unidad tripeptídica repe­
tida (Gly-Xaa-Pro o Gly-Xaa-Hyp), donde Xaa puede ser cualquier
aminoácido e Hyp = hidroxiprolina. Esta secuencia repetida adopta
una estructura helicoidal levógira con tres residuos por vuelta. Tres
de estas hélices se enrollan una alrededor de la otra formando una
triple hélice dextrógira. La molécula de tres filamentos resultante
se denomina tropocolágeno. Las moléculas de tropocolágeno se
autoagrupan formando fibrillas de colágeno y se empaquetan para
formar fibras de colágeno. Existen trastornos metabólicos y genéti­
cos que son resultado de anomalías del colágeno. El escorbuto, la
osteogénesis imperfecta (cap. 28) y el síndrome de Ehlers-Danlos
son resultado de defectos en la síntesis y/o el entrecruzamiento
del colágeno.
La estructura terciaria de una proteína está determ inada
por las interacciones entre los grupos funcionales
de la cadena lateral, incluyendo además a los puentes
disulfuro, los puentes de hidrógeno, los puentes salinos
y las interacciones hidrofóbicas
Se denomina estructura terciaria de una proteína a su conformación
tridimensional, plegada y biológicamente activa. Esta estructura refleja
la forma global de la molécula y por lo general consta de varias unidades
pequeñas de menor tamaño también plegadas denominadas domi­
nios. La estructura terciaria de las proteínas se determina mediante
cristalografía de rayos X y espectroscopia de resonancia magnética.
La estructura terciaria tridimensional de una proteína está es­
tabilizada por interacciones entre grupos funcionales de las cade­
nas laterales: puentes disulfuro covalentes, enlaces de hidrógeno,
puentes salinos e interacciones hidrofóbicas (fig. 2.8). Las cadenas
laterales de triptófano y arginina sirven como donadores de hi­
drógeno, mientras que la asparagina, la glutamina, la serina y la
treonina pueden servir tanto de donadores como de aceptares de hi­
drógeno. La lisina, el ácido aspártico, el ácido glutámico, la tirosina
y la histidina también pueden servir de donadores y de aceptares en
la formación de pares iónicos (puentes salinos). Dos aminoácidos
de carga opuesta, como el glutamato con un grupo carboxilo 7 y
la lisina con un grupo amino e, pueden formar un puente salino,
principalmente en la superficie de las proteínas (v. fig. 2 .8).

1. Puentes disulfuro C ysí-S -S -)C ys
Fig. 2.8 Elementos de la estructura terciaria de las proteínas. Ejem­
plos de las interacciones de las cadenas laterales de los aminoácidos que
contribuyen a la estructura terciaria.
CON CEPTOS A V AN ZAD O S
LUXACIÓN DEL CRISTALINO
EN LA HOM OCISTINURIA
(INCIDENCIA: 1:200.000)
La manifestación ocular más frecuente de la homocistinuria (cap. 19),
un defecto en el metabolismo de los aminoácidos que contienen azufre,
es la luxación del cristalino, que tiene lugar alrededor de los 10 años.
La fibrilina, que se encuentra en las fibras que sustentan el cristalino, es
rica en residuos de cisteína. Se necesitan puentes disulfuro entre estos
residuos para el entrecruzamiento y estabilización de la proteína y de la
estructura del cristalino. La homocisteína, un intermediario metabólico
homólogo de la cisteína, puede alterar estos puentes mediante un
intercambio de disulfuro que depende de la homocisteína.
Otra alteración igualmente infrecuente causada por alteraciones de
aminoácidos que contienen azufre es el déficit de sulfito oxidasa, que
también se asocia a luxación del cristalino por un mecanismo similar
(normalmente se presenta al nacer, con convulsiones precoces resistentes
al tratamiento). El síndrome de Marfan, asociado también a luxación del
cristalino, guarda relación con mutaciones en el gen de la fibrilina (cap. 29).
© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.
Compuestos como la urea y el clorhidrato de guanidina provo­
can con frecuencia la desnaturalización o pérdida de la estructura
secundaria y terciaria cuando se encuentran a concentraciones
elevadas como, por ejemplo, 8 mol/1 de urea. Estos reactivos se
denominan desnaturalizantes o agentes caotrópicos.
La estructura cuaternaria de las proteínas
está formada por interacciones
entre cadenas peptídicas
La estructura cuaternaria de proteínas con múltiples
subunidades está determinada p or interacciones covalentes
y no covalentes entre las superficies de las subunidades
La estructura cuaternaria hace referencia a un complejo o un en­
samblaje de dos o más cadenas peptídicas que se mantienen unidas
CAPÍTULO 2 Am inoácidos y proteínas 13
Fig. 2.9 Estructura tridimensional de una proteína dimérica. Es­
tructura cuaternaria de la Cu,Zn-superóxido dismutasa de espinaca.
La Cu,Zn-superóxido dismutasa tiene una estructura dimérica, con un
monómero con una masa molecular de 16.000 Da. Cada subunidad
consta de ocho hojas p antiparalelas denominadas estructura en barril 0 ,
por su similitud con motivos geométricos encontrados en tejidos y alfa­
rería griega y de los indígenas americanos. El arco rojo indica un puente
disulfuro. Cortesía del Dr. Y. Kitagawa.
por interacciones no covalentes o, en algunos casos, covalentes. En
general, la mayoría de las proteínas mayores de 50 kDa constan
de más de una cadena y se conocen como proteínas diméricas,
triméricas o multiméricas. Muchas proteínas que contienen varias
subunidades están compuestas por diferentes tipos de subunida­
des funcionales, com o las subunidades reguladoras y las
catalíticas. La hemoglobina es una proteína tetramérica (cap. 5)
y la ATPasa mitocondrial del corazón de vaca tiene 10 protómeros
(cap. 9). La unidad más pequeña se denomina monómero o sub­
unidad. La figura 2.9 ilustra la estructura de la proteína dimérica
cobre-zinc superóxido dismutasa. La figura 2 .1 0 muestra una
visión general de las estructuras primaria, secundaria, terciaria
y cuaternaria de una proteína tetramérica.
PURIFICACION Y CARACTERIZACION
DE LAS PROTEÍNAS
La purificación proteica es un proceso de múltiples
pasos basado en el tamaño, la carga, la solubilidad
y la capacidad de unión de ligandos
Los procedimientos de purificación proteica permiten la separación
de las proteínas basándose en la carga, el tamaño, las propieda­
des de unión y la solubilidad. La caracterización completa de la
proteína requiere conocer su composición de aminoácidos y sus
estructuras primaria, secundaria y terciaria completas, y, en las
proteínas multiméricas, su estructura cuaternaria.
Para caracterizar una proteína, primero es necesario purificar la
proteína separándola de otros componentes en mezclas biológicas
complejas. La fuente de las proteínas normalmente es la sangre
o los tejidos, o células microbianas como bacterias y levaduras.
Primero, las células o tejidos se rompen mediante troceado u homo-
geneización en disoluciones isotónicas tamponadas, normalmente
a pH fisiológico y a 4 °C para minimizar la desnaturalización de la
proteína durante la purificación. El «extracto crudo» que contiene
orgánulos, como el núcleo, mitocondrias, lisosomas, microsomas y
fracciones citosólicas, puede fraccionarse posteriormente mediante
centrifugación a alta velocidad o mediante ultracentrifugación.
14 CAPÍTULO 2 Am inoácidos y proteínas
H H 0 H H 0 H
I I II I I II I duos aminoácidos de proteínas. (B) La estructura
— N -C -C -N -C -C N-
I I
R R
CONCEPTOS AVANZADOS
M ODIFICACIONES
POSTRADUCCION ALES
DE LAS PROTEÍNAS
La mayoría de las proteínas sufren alguna forma de modificación enzi-
mática después de la síntesis de la cadena peptídica. Las modificaciones
«postraduccionales» se realizan mediante enzimas procesadoras en el
retículo endoplasmático, el aparato de Golgi, los gránulos secretores y
el espacio extracelular. Las modificaciones consisten en fragmentación
proteolítica, glucosilación, lipidación y fosforilación. La espectrometría
de masas es una herramienta potente para detectar dichas modifica­
ciones y se basa en las diferencias en la masa molecular (v. cap. 35).
Las proteínas fuertemente unidas a otras biomoléculas o membranas
pueden solubilizarse utilizando disolventes orgánicos o detergentes.
Precipitación mediante desalinización
(«salting out» o fraccionamiento mediante
sulfato de amonio) y ajuste del pH
La solubilidad de una proteína depende de la concentración
de sales disueltas
La solubilidad de una proteína puede incrementarse añadiendo sal
a baja concentración (salinización, «salting in») o disminuirse aña­
diendo una concentración elevada de sal (precipitación mediante
desalinización, «salting out»). Cuando se añade sulfato de amonio, una
de las sales más solubles, a una disolución de una proteína, algunas
proteínas precipitan a una concentración concreta de sal, mientras que
otras no precipitan. Las inmunoglobulinas séricas humanas pueden
Fig. 2.10 Estructuras primaria, secundaria, ter­
ciaria y cuaternaria. (A) La estructura primaria
está compuesta por una secuencia lineal de resi­
secundaria indica la disposición espacial local del es­
queleto polipeptídico dando una hélice a extendida
o la estructura de hoja plegada p como representa
la cinta. Los puentes de hidrógeno entre los grupos
amida NH y C = O del esqueleto estabilizan la hélice.
(C) La estructura terciaria ilustra la conformación
tridimensional de una subunidad de la proteína,
mientras que la estructura cuaternaria (D) indica el
ensamblaje de múltiples cadenas de polipéptidos en
una proteína tetramérica intacta.
precipitar al añadir (NH^SC^ saturado al 33-40%, mientras que la
albúmina permanece soluble. La concentración saturante de sulfato de
amonio es de aproximadamente 4,1 mol/1. La mayoría de las proteínas
precipitarán en una disolución de (NH4)2S0 4saturado al 80%.
Las proteínas también pueden precipitar en una disolución
ajustando el pH. Por lo general, las proteínas son menos solubles
en su punto isoeléctrico (pl). A este valor de pH, la proteína carece
de carga neta o de repulsión de cargas entre las subunidades. Las
interacciones hidrofóbicas entre las superficies proteicas pueden
conllevar agregación y precipitación de la proteína.
Separación basada en el tamaño
Diálisis y ultrafiltración
Las moléculas pequeñas, como las sales, pueden separarse
de las disoluciones de proteínas m ediante diálisis
o ultrafiltración
La diálisis se realiza añadiendo la disolución de proteína y sal a un
tubo de membrana semipermeable (normalmente una membrana
de nitrocelulosa o colodión). Cuando el tubo se sumerge en una
disolución tamponada diluida, las moléculas pequeñas pasarán a
través de la membrana y las moléculas proteicas quedarán reteni­
das en el tubo, dependiendo del tamaño del poro de la membrana
de diálisis. Este procedimiento es particularmente útil para separar
el (NH4)2S 0 4 u otras sales durante la purificación de la proteína,
dado que las sales interferirán en la purificación de las proteínas
mediante cromatografía de intercambio iónico (v. más adelante).
La figura 2.11 ilustra la diálisis de proteínas.
La ultrafiltración ha reemplazado en gran medida a la diálisis para
la purificación de proteínas. Esta técnica utiliza presión para forzar el
paso de una disolución a través de una membrana semipermeable

con un tamaño de poros definido y homogéneo. Seleccionando
el valor adecuado de discriminación del peso molecular (tamaño
del poro del filtro), las membranas permitirán que el disolvente y
los solutos de peso molecular más bajo atraviesen la membrana,
formando el filtrado, mientras que las proteínas de mayor peso mole­
cular quedarán retenidas en la solución que no puede pasar el filtro.
La ultrafiltración puede utilizarse para concentrar disoluciones de
proteínas o para llevar a cabo la diálisis mediante un continuo reem­
plazo del tampón en el compartimento de retención.
Fig. 2.11 Diálisis de proteínas. Las proteínas y los compuestos de masa
molecular baja son separados por diálisis según su tamaño. (A) Una disolu­
ción de proteínas con sales se coloca en un tubo de diálisis en un recipiente
y se dializa agitándola en un tampón apropiado. (B) La proteína queda
retenida en el tubo de diálisis, mientras que las sales se intercambiarán a
través de la membrana. Si se utiliza un gran volumen de tampón externo
y se va reemplazando ocasionalmente el tampón, la proteína también será
intercambiada hacia la solución amortiguadora externa.
© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.
Número de fracción
CAPÍTULO 2 Am inoácidos y proteínas 15
Filtración en gel (tamizado molecular)
La crom atografía de filtración en gel separa las proteínas
según el tamaño
La cromatografía de filtración en gel usa una columna de polímeros
insolubles pero altamente hidratados, como los dextranos, la agaro-
sa o la poliacrilamida. La cromatografía de filtración en gel depende
de la diferente migración de solutos disueltos a través de geles
que tienen poros de tamaños definidos. Esta técnica se utiliza con
frecuencia para la purificación de proteínas y para la desalinización
de disoluciones de proteínas. La figura 2.12 describe el principio de
la filtración en gel. Existen en el mercado geles elaborados con
perlas de polímeros de carbohidratos como dextranos, (series
de Sephadex), poliacrilamida (series de BioGel P) y agarosa (series de
Sepharose), respectivamente. Los geles varían en el tamaño del poro
y se pueden escoger los materiales de filtración en gel de acuerdo
con el intervalo de peso molecular deseado en el fraccionamiento.
Cromatografía de intercambio iónico
Las proteínas se unen a m atrices de intercam bio iónico
en fu nción de las interacciones entre cargas
Cuando un ion o una molécula cargada con una o más cargas
positivas se intercambia con otro compuesto cargado positiva­
mente unido a una fase inmovilizada cargada negativamente, el
proceso se denomina intercambio catiónico. El proceso inverso se
denomina intercambio amónico. El intercambiador de cationes car-
boximetilcelulosa (-0-CH 2-C 0 0 “) y el intercambiador de aniones
Fig. 2.12 Fraccionamiento de las proteí­
nas por el tamaño: cromatografía de las
proteínas mediante filtración en gel.
Las proteínas con diferentes tamaños mole­
culares son separadas mediante filtración en
gel según su tamaño relativo. La proteína más
pequeña entra más fácilmente en las bolas de
polímeros, mientras que las proteínas más
grandes pueden ser completamente ex­
cluidas. Las moléculas más grandes fluyen
más rápidamente a través de esta columna,
consiguiéndose un fraccionamiento según
el tamaño molecular. El cromatograma de la
derecha muestra un fraccionamiento teórico
de tres proteínas, Pr,-Pr3, de peso molecular
decreciente.
 CAPÍTULO 2 Am inoácidos y proteínas
Mezcla de proteínas
©®%®
© © 0
© © ©
© (+) © ®
Las proteínas cargadas
positivamente fluyen a través — © © (j>
de la columna
Fig. 2.13 Fraccionamiento de proteínas por la carga: cromatografía
de intercambio iónico. Las mezclas de proteínas pueden separarse
mediante cromatografía de intercambio iónico según sus cargas netas.
Las bolas que tienen enlazados grupos con carga positiva se denominan
intercambiadores de aniones, mientras que las que tienen grupos con
carga negativa son intercambiadores de cationes. Esta figura muestra
una columna de intercambio de aniones. Las proteínas cargadas nega­
tivamente se unen a las bolas cargadas positivamente y las proteínas
cargadas positivamente fluyen a través de la columna.
dietilaminoetil (DEAE) celulosa [- O ^ H ^ N E P ^ H ^ ] se utilizan
con frecuencia para la purificación de proteínas. Considérese la
purificación de una mezcla de proteínas que contiene albúmina e
inmunoglobulina. A un pH de 7,5, la albúmina (con un pl de 4,8)
está cargada negativamente; la inmunoglobulina con un pl de
aproximadamente 8 está cargada positivamente. Si la mezcla se
aplica a una columna de DEAE a un pH de 7, la albúmina se une
a la columna de DEAE cargada positivamente, mientras que la
inmunoglobulina pasa a través de la columna. La figura 2.13 ilus­
tra el principio de la cromatografía de intercambio iónico. Al igual
que en la cromatografía de filtración en gel, las proteínas pueden
separarse según las pequeñas diferencias en su pl. Normalmente
las proteínas adsorbidas son eluidas con un gradiente for­
mado a partir de dos o más disoluciones con distinto pH y/o
distintas concentraciones de sal. De esta forma, las proteínas
son eluidas gradualmente de la columna y se resuelven según su pl.
Cromatografía de afinidad
La crom atografía de afinidad purifica las proteínas
basándose en las interacciones con ligandos
La cromatografía de afinidad es un método conveniente y específico
para la purificación de proteínas. Una columna de cromatografía
con una matriz porosa es derivatizada con un ligando que se une a
una proteína específica que se encuentra en una mezcla compleja.
La proteína de interés se unirá de forma selectiva y específica al
ligando, y las otras pasarán a través de la columna. La proteína
unida se puede eluir posteriormente mediante alta concentración
de sal, mediante desnaturalización suave o mediante una forma
soluble del ligando o de análogos del ligando (v. cap. 6).
Determinación de la pureza y del peso
molecular de las proteínas
La electroforesis en gel de poliacrilam ida en dodecil sulfato
sódico puede usarse para separar proteínas basándose
en la carga
La electroforesis puede utilizarse para separar una amplia variedad
de moléculas cargadas, como aminoácidos, polipéptidos, proteínas
y ADN. Cuando se aplica una corriente a moléculas disueltas en
amortiguadores diluidos, las moléculas con una carga neta nega­
tiva al pH seleccionado migran hacia el ánodo y las que tienen una
carga neta positiva, hacia el cátodo. Para minimizar la difusión y
convección se utiliza normalmente un soporte poroso, como papel,
acetato de celulosa o un gel polimérico.
Al igual que la cromatografía, la electroforesis puede utilizarse para
el fraccionamiento preparativo de proteínas a pH fisiológico. Las distin­
tas proteínas de la disolución se moverán a diferentes velocidades en el
campo eléctrico, dependiendo del valor del cociente carga/masa para
cada molécula. El dodecil sulfato de sodio (SDS), un detergente des­
naturalizante, se suele utilizar en un sistema de electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE) para separar y resolver subunidades proteicas
según su peso molecular. El preparado proteico suele tratarse con SDS
y un reactivo tiol, como el P-mercaptoetanol, para reducir los puentes
disulfuro. Debido a que la unión del SDS es proporcional a la longitud
de la cadena peptídica, cada molécula proteica tiene el mismo cociente
masa/carga y la movilidad relativa de la proteína es proporcional a
la masa molecular de la cadena polipeptídica. La variación del estado
de entrecruzamiento del gel de poliacrilamida proporciona selectividad
para proteínas de pesos moleculares diferentes. Un preparado proteico
purificado puede analizarse fácilmente para determinar su homoge­
neidad en SDS-PAGE mediante tinción con colorantes sensibles y es­
pecíficos, como el azul de Coomassie, o mediante la técnica de tinción
con plata, como se muestra en la figura 2.14.
Isoelectroenfoque (IEF)
El isoelectroenfoque se utiliza para separar proteínas
según su punto isoeléctrico
El isoelectroenfoque (IEF) se realiza en un microcanal o un gel que
contiene un gradiente de pH estabilizado. Una proteína aplicada al
CONCEPTOS AVANZADOS
CRO M ATO G RAFÍA LÍQUIDA
DE ALTO RENDIM IENTO (HPLC)
La HPLC (del inglés high-performance liquid chromatography) es
una técnica cromatográfica útil para la separación de alta resolución
de proteínas, péptidos y aminoácidos. El principio de separación
puede estar basado en la carga, el tamaño o la hidrofobicidad de las
proteínas. Las columnas son muy estrechas y son empaquetadas con
una matriz no comprimible de bolitas de sílice rodeada por una fina
capa de una fase estacionaria. Se aplica una mezcla de proteínas a
la columna y a continuación los componentes son eluidos mediante
cromatografía ¡socrática o de gradiente. Los eluidos se monitorizan
mediante absorción ultravioleta, índice de refracción o fluorescencia.
Esta técnica proporciona una separación de alta resolución.
 CAPÍTULO 2 Am inoácidos y proteínas 17

A B C D E

kDa

94 —

67 —

m m
43 —

30----

_ _
Fig. 2.14 SDS-PAGE. La electroforesis en gel de poliacrilamida en
presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) se usa para separar
proteínas según sus pesos moleculares. Las moléculas más grandes se
retrasan en la matriz del gel, mientras que las más pequeñas se mueven
más rápidamente. El carril A contiene proteínas estándar con masas
moleculares conocidas (indicadas en kDa a la izquierda). Los carriles B, C,
D y E muestran los resultados del análisis por SDS-PAGE de una proteína
pH=4 pH=7
en varios estadios de purificación: B, proteína total aislada; C, precipitado
de sulfato de amonio; D, fracción de la cromatografía de filtración en < -------------------------- IEF ------------------------ ►
gel; E, proteína purificada de una cromatografía de intercambio iónico.

sistema se cargará positiva o negativamente, según su composición

de aminoácidos y el pH del ambiente. Al aplicar una corriente, la
proteína se moverá hacia el ánodo o hacia el cátodo hasta encon­
trar la parte del sistema que corresponde a su pl, donde la proteína
no tiene carga y dejará de migrar. El IEF se usa junto con el SDS-
PAGE p ara la electroforesis en gel bidimensional (fig. 2.15).
Esta técnica es particularmente útil para el fraccionamiento de
mezclas complejas de proteínas para el análisis proteómico.

ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA
PROTEICA
En la figura 2.1 6 se resumen los pasos característicos en la purifi­
cación de una proteína. Una vez purificada, para la determinación
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Fig. 2.15 Electroforesis en gel bidimensional. (parte superior) Paso 1:
a la muestra que contiene las proteínas se le aplica un gel de isoelec-
troenfoque dentro del gradiente de pH. Paso 2: cada proteína migra
hacia la posición en el gel correspondiente a su punto isoeléctrico (pl).
Paso 3: el gel de IEF se coloca horizontalmente en lo alto de una capa

de su composición de aminoácidos, la proteína es sometida a hi­
drólisis, normalmente en HC16 mol/1 a 110 °C en un tubo sellado
y al vacío durante 24-48 horas. En estas condiciones, el triptófano,
la cisterna y la mayor parte de la cistina son destruidos, y la glu­
tamina y la asparagina son desaminadas cuantitativamente para
dar glutamato y aspartato, respectivamente. La recuperación de la
serina y la treonina es incompleta y disminuye con el incremento
del tiempo de hidrólisis.
Para la determinación del triptófano, pueden utilizarse pro­
cedimientos de hidrólisis alternativos, mientras que la cisterna y
la cistina pueden convertirse en ácido cisteico estable antes de la
hidrólisis. Tras la hidrólisis, los aminoácidos libres se separan en
un analizador automático de aminoácidos utilizando una columna
de intercambio iónico o, después de la derivatización previa a la
de gel. Paso 4: las proteínas se separan mediante SDS-PAGE según su
peso molecular (PM). (parte inferior) Ejemplo típico de 2D-PAGE. Un
homogenado de hígado de rata se fraccionó mediante 2D-PAGE y las
proteínas se detectaron mediante tinción con plata.
columna con reactivos coloreados o fluorescentes, mediante HPLC
de fase reversa. Los aminoácidos libres fraccionados mediante la
cromatografía de intercambio iónico son detectados por la reac­
ción con un reactivo cromógeno o fluorógeno, como la ninhidrina
o el cloruro de dansilo, el reactivo de Edman (v. más adelante) o
el o-ftalaldehído. Estas técnicas permiten medir cada aminoácido
en cantidades tan pequeñas como 1 pmol. En la figura 2 .1 7 se
muestra un patrón de elución típico de los aminoácidos en una
proteína purificada.
 CAPÍTULO 2 Am inoácidos y proteínas
Homogeneización/extracción
Desalinización/diálisis y concentración
Intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel
Degradación proteolítica
Purificación y secuenciación de péptidos
Fig. 2.16 Estrategia para la purificación de proteínas. La purificación
de una proteína supone una secuencia de pasos en los que las proteínas
contaminantes se eliminan a partir de la diferencia de tamaño, carga
e hidrofobicidad. La purificación se monitoriza mediante SDS-PAGE
(v. fig. 2.14). La secuencia primaria de la proteína puede determinarse me­
diante la degradación de péptidos de Edman automatizada (v. fig. 2.18).
La estructura tridimensional de la proteína puede determinarse mediante
cristalografía de rayos X.
CONCEPTOS AVANZADOS
EL PROTEOM A
El proteoma se define como el conjunto completo de proteínas
producidas por un genoma particular. Los cambios en los proteo-
mas hísticos y celulares se producen en respuesta a señales hormona­
les durante el desarrollo y al estrés ambiental. La proteómica se define
como la comparación cualitativa y cuantitativa de los proteomas bajo
diferentes condiciones. Para analizar el proteoma de una célula, las
proteínas son extraídas y se someten a electroforesis bidimensional en
gel de poliacrilamida (2D-PAGE). Las manchas proteicas individuales
se identifican mediante tinción, y posteriormente se extraen y se
digieren con proteasas. Los péptidos pequeños obtenidos en el gel
se secuencian mediante espectrometría de masas, lo que permite
la identificación de la proteína. En la figura 2.15 se muestra el análisis
característico de un extracto de hígado de rata. En la electrofo­
resis bidimensional diferencial en gel (DIGE) pueden compararse
dos proteomas marcando sus proteínas con diferentes tinciones
fluorescentes (p. ej., rojo y verde). Las proteínas marcadas se mezclan
y se fraccionan mediante 2D-PAGE. Las proteínas presentes en los
dos proteomas aparecerán como manchas amarillas, mientras que
las proteínas presentes en un solo proteoma serán rojas o verdes,
respectivamente (v. cap. 36).
Determinación de la estructura primaria
de las proteínas
Históricamente, el análisis de la secuencia de las proteínas
se llevaba a cabo mediante métodos químicos;
en la actualidad, tanto el análisis secuencia1
Tiempo de retención (min)
Fig. 2.17 Cromatograma característico a partir de un análisis de
aminoácidos mediante cromatografía de intercambio catióni-
co. Una proteína hidrolizada se aplica a la columna de intercambio de
cationes en un tampón diluido a un pH ácido (=3,0), al cual todos los
aminoácidos están cargados positivamente. Los aminoácidos son eluidos
mediante un gradiente de pH y de concentración de sales creciente.
Los aminoácidos aniónicos (ácidos) eluyen primero, seguidos por los ami­
noácidos neutros y básicos. Los aminoácidos son derivatizados mediante
una reacción posterior de la columna con un componente fluorógeno,
como el o-ftalaldehído.
como la identificación de las proteínas se realiza
m ediante espectrometría de masas
La información sobre la secuencia primaria de una proteína es esen­
cial para comprender sus propiedades funcionales, la identificación
de la familia a la que pertenece y la caracterización de las proteínas
imitantes que causan enfermedad. Una proteína puede escindirse
primero mediante digestión por endoproteasas específicas, como la
tripsina (cap. 6), la proteasa V8 o la lisil endopeptidasa, para obtener
fragmentos peptídicos. La tripsina escinde enlaces peptídicos en que el
C es aportado por arginina y lisina, y siempre que el próximo residuo
no sea prolina. La lisil endopeptidasa también se utiliza con frecuen­
cia para escindir el fragmento cuando el C es aportado por la lisina. La
escisión mediante reactivos químicos, como bromuro de cianógeno,
también resulta útil. El bromuro de cianógeno escinde cuando el C
es aportado por metionina. Antes de la escisión, las proteínas con
residuos de cisterna y cistina son reducidas con 2 -mercaptoetanol y
posteriormente se tratan con yodoacetato para formar residuos de
carboximetilcisteína. Esto evita la formación espontánea de enlaces
disulfuro intermoleculares o intramoleculares durante el análisis.
Posteriormente, los péptidos escindidos son sometidos a HPLC
de fase reversa para purificar los fragmentos peptídicos y después
son secuenciados en un secuenciador automático de proteínas,
utilizando la té cn ica de degradación de Edm an (fig. 2.18).
La secuencia de péptidos superpuestos se utiliza entonces
para obtener la estructura primaria de la proteína. La técnica
de degradación de Edman tiene un interés meramente histórico.
Actualmente se usa más la espectrometría de masas para obtener
simultáneamente la masa molecular y la secuencia de polipéptidos
(cap. 36). Estas técnicas pueden aplicarse directamente a proteínas
y péptidos recuperados de la electroforesis SDS-PAGE o de la elec­
troforesis bidimensional (IEF más SDS-PAGE).
La secuenciación e identificación de proteínas puede hacerse
también mediante espectrometría de masas combinada con cromato­
grafía líquida de ionización mediante electropulverización (HPLC-
ESI-MS/MS) (cap. 36). Esta técnica es suficientemente sensible
para que las proteínas aisladas por 2D-PAGE (v. fig. 2.15) puedan

Fig. 2.18 Pasos de la degradación de Edman. El método de de­
gradación de Edman extrae secuencialmente un residuo cada vez desde
el extremo amino de un péptido. El fenilisotiocianato (PITC) convierte el
grupo amino AMerminal del péptido inmovilizado en un derivado del
feniltiocarbamil (aminoácido PTC) en disolución alcalina. El tratamiento
con ácido extrae el primer aminoácido en forma de derivado de la fenil-
tiohidantoína (PTH), que se identifica mediante HPLC.
recuperarse del gel para el análisis. La tripsina puede digerir in situ
menos de 1 |xg de proteína por mancha; a continuación puede ex­
traerse del gel e identificarse según su secuencia de aminoácidos. Esta
técnica, así como una técnica complementaria llamada MALDI-TOF
MS/MS (del inglés, Matrix-assisted Laser Desorption Ionization-time of
flight) (cap. 36), puede aplicarse para determinar el peso molecular
de las proteínas intactas, así como para el análisis de la secuencia de
péptidos, obteniendo una identificación inequívoca de una proteína.
Determinación de la estructura
tridimensional de las proteínas
La cristalografía de rayos X y la espectroscopia
de RM suelen usarse para determ inar la estructura
tridim ensional de las proteínas
La cristalografía de rayos X se basa en la difracción de los rayos
X por los electrones de los átomos que forman la molécula. Sin
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embargo, dado que la difracción de los rayos X causada por una
molécula individual es débil, la proteína debe encontrarse en forma
de cristal bien ordenado, en el que cada molécula tiene la misma
conformación en una posición y orientación específicas en una
matriz tridimensional. A partir de la difracción de un haz colimado
de electrones, puede calcularse la distribución de la densidad de
electrones y, por tanto, la localización de los átomos en el cristal
con el fin de determinar la estructura de la proteína. Para la cris­
talización de las proteínas, el método más usado es el de la gota
colgante, para el que se necesita un aparato simple que permite
a una pequeña porción de una disolución de proteína (general­
mente, una gota de 10|xl con un contenido de 0,5-1 mg/proteína)
evaporarse gradualmente para alcanzar el punto de satura­
ción en el que la proteína empieza a cristalizar. La espectroscopia
CAPÍTULO 2 Am inoácidos y proteínas 19
CONCEPTOS AVANZADOS
PLEG AM IEN TO DE PROTEÍNAS
Para que las proteínas funcionen correctamente deben plegarse
en la forma correcta. Las proteínas han evolucionado, de manera
que un plegado es más favorable que todos los demás, recibiendo
la denominación de estado nativo. Numerosas proteínas ayudan
a otras en el proceso de plegamiento. Estas proteínas, llamadas
chaperonas, incluyen las proteínas de «choque térmico», como
la HSP 60 y la HSP 70, y las proteínas disulfuro isomerasas. Una
enfermedad del plegamiento de las proteínas es una enfermedad
que se asocia con una conformación anómala de una proteína. Esto
ocurre en enfermedades crónicas asociadas con el envejecimiento,
como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica y
la enfermedad de Parkinson.
CONCEPTOS CLÍNICOS
ENFERMEDAD DE CREUTZFELDT-JAKOB
Un vaquero de 56 años presentó crisis epilépticas y demencia, y se le
diagnosticó enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, una enfermedad de los
seres humanos causada por priones. Las enfermedades producidas
por priones se conocen también con el nombre de encefalopatías
espongiformes transmisibles. Son enfermedades neurodegenerativas
que afectan tanto a seres humanos como a animales. En las ovejas y
las cabras recibe el nombre de encefalopatía espongiforme ovina y en
las vacas se denomina encefalopatía espongiforme bovina (enfermedad
de las vacas locas). Estas patologías se caracterizan por la acumulación
en el cerebro de una isoforma anormal de una proteína codificada por
el huésped, una forma celular de una proteína priónica (PrPC).
Comentario. Los priones parecen estar compuestos solamente
de moléculas de PrPSc (forma ovina), que son moléculas con una
conformación anormal de la proteína normal codificada por el
huésped. La PrPC tiene un alto contenido de hélice a y está desprovis­
ta de hojas plegadas 0, mientras que la PrPSc tiene un alto contenido
de hoja plegada (3. La conversión de PrPC en PrPSc representa un
profundo cambio conformacional. La progresión de las enfermedades
infecciosas por priones parece conllevar una interacción entre PrPC y
PrPSc, que induce un cambio conformacional de la PrPC rica en héli­
ce a a la forma PrPSc rica en hojas plegadas (3. La enfermedad
priónica derivada de PrPSc puede ser genética o infecciosa. Las
secuencias de aminoácidos de PrPC de diferentes mamíferos son
similares y la conformación de la proteína es virtualmente la misma
en todas las especies de mamíferos.
de RM se suele emplear para el análisis estructural de compuestos
orgánicos pequeños, pero la RM de alto campo también es útil para
determinar la estructura de una proteína en una disolución y com­
plementa la información obtenida por cristalografía de rayos X .
RESUMEN
■ Los elementos fundamentales de las proteínas son
20 alfa-aminoácidos. Sus cadenas laterales contribuyen
a la carga, la polaridad y la hidrofobicidad de cada proteína.
 Las proteínas son macromoléculas formadas
por la polimerización de L-a-aminoácidos mediante
enlaces peptídicos. La secuencia lineal de los aminoácidos
constituye la estructura primaria de la proteína.
■ Las proteínas son macromoléculas formadas por la
polimerización de L-a-aminoácidos. Hay 20 aminoácidos
diferentes en las proteínas, unidos mediante enlaces
peptídicos. La secuencia lineal de los aminoácidos
es la estructura primaria de la proteína.
La estructura de orden superior de una proteína
es el producto de sus estructuras secundaria, terciaria
y cuaternaria.
■ Estas estructuras de orden superior están formadas por
puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, puentes
salinos y enlaces covalentes entre las cadenas laterales
de los aminoácidos.
La purificación y la caracterización de las proteínas son
procesos cruciales para dilucidar su estructura y su función.
Las proteínas pueden purificarse hasta la homogeneidad
mediante diferentes técnicas cromatográficas y
electroforéticas, aprovechando las diferencias en su tamaño,
solubilidad, carga y capacidad de unión. La masa molecular
APRENDIZAJE ACTIVO
1. El análisis de sangre, orina y tejidos mediante espectrometría de
masas se aplica actualmente para el diagnóstico clínico. Comentar
las ventajas de esta técnica con respecto a la especificidad, sensi­
bilidad, rendimiento e intervalo de análisis, incluyendo el análisis
proteómico con fines diagnósticos.
2. Revisar la importancia del plegamiento defectuoso de las proteínas
y su depósito en los tejidos en las enfermedades crónicas relacio­
nadas con el envejecimiento.
y la pureza de una proteína, así como su composición de
subunidades, pueden determinarse mediante SDS-PAGE.
■ El descifrado de las estructuras primaria y tridimensional de
una proteína mediante métodos químicos, espectrometría
de masas, análisis de rayos X y espectroscopia de
resonancia magnética permite conocer la relación
estructura-función de las proteínas.
LECTURAS RECOMENDADAS
Aguzzi A, Falsig J: Prion propagation, toxicity and degradation, Nat Neurosci 15:
9 3 6 - 9 3 9 ,2 0 1 2 .
Dominguez DC, Lopes R, Torres ML: Proteomics: clinical applications, Clin Lab Sci
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Griffin MD, Gerrard JA: The relationship between oligomeric state and protein func­
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Kovacs GG, Budka H: Prion diseases: from protein to cell pathology, Am J Pathol
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Marouga R, David S, Hawkins E: The development of the DIGE system: 2D fluores­
cence difference gel analysis technology, Anal Bioanal Chem 3 8 2 :6 6 9 -6 7 8 ,2 0 0 5 .
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Walsh CT: Posttranslational modification o f proteins: expanding nature's inventory, ed 3,
Colorado, 2 0 0 7 , Roberts & Co.
PÁGINAS WEB
Banco de datos de proteínas: www.rcsb.org: utilizar el cuadro de búsqueda
y seleccionar a continuación una estructura y ver la proteína en Jmol.
www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure: National Center for Biotechnology Information,
National Library of Medicine. Varias bases de datos, incluyendo la estructura
de las proteínas.
http://us.expasy.org: portal de recursos bioinformáticos.