Técnicas Histológicas

Técnica para observar células vivas

La observación de células vivas se puede realizarse:
 De manera directa: Sin el agregado de ninguna sustancia colorante, mediante la utilización
de microscopios ópticos (usualmente de campo oscuro o de contraste de fase).
 Con colorantes: Los colorantes deben ser vitales, que puedan atravesar la membrana
plasmática y que puedan teñir estructuras celulares sin afectar a los procesos celulares. El
procedimiento puede llevarse a cabo de dos maneras:
↳ In vivo o Invital: Mediante la administración del colorante a animales de
experimentación vivos, por distintos medios (ingestión, inyección o inmersión).
↳ In vitro o Supravital: Mediante la administración del colorante a células en cultivo o a
células vivas suspendidas en el portaobjeto. Por ejemplo:
⤷ Azul de Metileno: Tiñe a los núcleos de color azul y al citoplasma de color
celeste.
⤷ Verde Jano: Tiñe a las mitocondrias de color verde.
Estas técnicas no brindan información o detalle sobre las estructuras celulares y que además
presentan la desventaja de no preservar la muestra en el tiempo.

Técnica para observar células muertas

Técnica Histológica Convencional: THC
La THC nos permite obtener a partir de un órgano, cortes finos (de aproximadamente 5-15μm)
que se colorean y se colocan sobre un portaobjetos, para posteriormente poder visualizar la
imagen en el MOCC. La THC comprende cuatro pasos básicos, en forma ordenada y secuencial:
1) Fijación: Cuando un órgano es extirpado deja de estar irrigado, lo que lleva a la
descomposición del mismo por la falta de la llegada de los nutrientes esenciales. Para evitar
este proceso, y la posterior perdida de la morfología histológica normal, se utilizan fijadores
como por ejemplo el formaldehido (formol), que tienen el objetivo de evitar la
desorganización estructural del órgano a través de la formación de enlaces covalentes con
las macromoléculas presentes en el mismo, específicamente, deteniendo los procesos
enzimáticos.

2) Inclusión: Este segundo paso tiene el objetivo de cortar al órgano en finas cortes (5-15μm),
pero antes es necesario realizar una serie de pasos que le den soporte y firmeza al mismo:
↳ En primer lugar, para que el órgano adopte mayor firmeza, se embebe en parafina o
en una resina sintética tipo paraplast. La parafina tiene dos ventajas importantes:
⤷ Es económica.
⤷ Es sólida a temperatura ambiente y liquida a 55oC (temperatura relativamente
baja)
↳ Como la parafina es hidrofóbica, se debe realizar una deshidratación para que la
misma pueda penetrar dentro del órgano. La deshidratación se lleva a cabo utilizando
pasajes de alcoholes de concentración creciente.
 ↳ Luego de los pasajes en alcohol, se hace un proceso de aclaración utilizando Xilol o
Xileno, el cual desplaza el alcohol. Además, se utiliza este compuesto porque la
parafina es soluble en él.
↳ El órgano fijado y deshidratado se coloca en un molde, y se le añade parafina líquida.
Cuando la misma enfría, quedará conformado el bloque que será pegado a un soporte
de madera conformando el taco.
↳ El bloque se encuentra listo para ser cortado por el micrótomo.

Alcohol 70oC  Alcohol 95oC  Alcohol 100oC  Xilol

3) Tinción: Los cortes finos de la muestra se colocan sobre un portaobjeto y se lo introduce 10

minutos a la estufa a 55oC para que la parafina se funda y así el corte se quede pegado al
portaobjetos.
Los colorantes utilizados tienen la característica de ser hidrosolubles, es por ello que se
debe realizar una rehidratación de la muestra:
↳ Primero se debe realizar un pasaje de los cortes por Xilol para así remover la parafina.
↳ Luego se deberá sumergir el portaobjetos en alcoholes de concentraciones
decrecientes y finalmente en agua.
Por último, los cortes incoloros hidratados pueden ser coloreados. En esta técnica, los
colorantes más utilizados son:
↳ Hematoxilina: Actúa como un colorante básico (acidófilo)
↳ Eosina: Actúa como un colorante ácido (basófilo).

Xilol  Alcohol 100oC  Alcohol 95oC  Alcohol 70oC  Agua

4) Montaje: El objetivo del montaje es de asegurar que los cortes teñidos, perduren en el
tiempo. En este último paso, se añade el cubreobjetos sobre el preparado con un medio de
montaje interpuesto, el bálsamo de Canadá. Éste es hidrofóbico, por lo que se debe volver a
realizar una deshidratación:
↳ Se realizan pasajes del preparado por alcohol de concentraciones crecientes y luego
se realiza una aclaración con Xilol

Alcohol 70oC  Alcohol 95oC  Alcohol 100oC  Xilol

Se aplica el bálsamo, luego el cubreobjetos y se deja secar. Cuando el montaje se solidifica,

el preparado está listo para ser observado
Colorantes
Podemos diferenciar en dos grandes grupos, dos tipos de colorantes:
↳ Colorantes Ácidos: Aquellos que poseen cargas netas negativas (Pensa que un ácido
pierde un protón y queda cargado de manera negativa). Por ejemplo:
⤷ Eosina.
⤷ Floxina.
⤷ Naranja G.
 ↳ Colorantes Básicos: Aquellos que poseen cargas netas positivas (Pensa que una base
acepta protones y queda cargado de manera positiva). Por ejemplo:
⤷ Hematoxilina.
⤷ Alcian Blue.
⤷ Azul de metileno.
⤷ Azul de Toluidina.
⤷ Verde de Metilo.
⤷ Azures.
Luego, se puede diferencia dos tipos de estructuras celulares o extracelulares en cuanto a la
interacción que tiene con los colorantes:
↳ Acidófilas: Son estructuras que tienen carga neta positiva y tienen afinidad para
unirse a colorantes ácidos.
⤷ Acidofilia: Capacidad de ciertos componentes celulares/extracelulares básicos
(catiónicos) de formar uniones salinas o electrostáticas con colorantes ácidos
(aniónicos)
↳ Basófilas: Son estructuras que tienen carga neta negativa y tienen afinidad para
unirse a colorantes básicos.
⤷ Basofilia: Capacidad de ciertos componentes celulares/extracelulares ácidos
(aniónicos) de formar uniones salinas o electrostáticas con colorantes básicos
(catiónicos).

Según la capacidad de un colorante de mantener o de variar su espectro de absorción

electromagnético, se pueden definir dos conceptos:
↳ Ortocromasia: Es la capacidad que tienen los colorantes básicos o ácidos de
mantener invariable su espectro de absorción electromagnético al formar uniones
salinas con los componentes celulares/extracelulares que tiñen. Se ven del color que
son.
↳ Metacromasia: Es la capacidad que tienen algunos colorantes básicos de variar su
espectro de absorción electromagnético al formar uniones salinas con algunos
componentes celulares/extracelulares, caracterizados por ser polímero polianionicos.
Este fenómeno se debe a la polimerización espontanea de las moléculas del
colorante debido a la unión a grupos celulares con carga negativas muy próximos
entre sí.
⤷ Colorantes metacromáticos: Azul de Bromotimol, Tioninta, Violeta de Metilo,
entre otros.
 ⤷ Estructuras metacromáticas: Sustancia intercelular del cartílago (por poseer
GAGs y ácidos sulfatados); Los gránulos de los Mastocitos (células presentes en
el tejido conectivo laxo de las mucosas).

Técnicas Histoquímica
Estas técnicas son utilizadas para evidenciar la presencia de determinadas sustancias químicas en
células o tejidos, y se fundamentan en reacciones químicas entre la sustancia a evidenciar y la
sustancia colorante.
Los métodos histoquímicas pueden ser:
↳ Químicos
↳ Físicos
↳ Enzimáticos
↳ Inmunoenzimáticos

1) Técnica de PAS: Peryodic Acid Schiff

Esta técnica es utilizada para evidenciar la presencia de polisacáridos, glucoproteínas y
proteoglucanos. A las estructuras ricas en estas sustancias se las denomina como PAS+.
Se basa en la oxidación de grupos alcoholes presentes en azucares, a través de la utilización
de ácido peryódico, liberando grupos aldehídos de carácter reductor. Estos últimos, reducen el
reactivo de Schiff (Fucsina decolorada o Leuco fucsina).
Algunos ejemplos de estructuras PAS+ son:
⤷ Producto de secreción de las células Caliciformes, mucina.
⤷ Membranas basales que se encuentran debajo de epitelios y alrededor de algunas
células, como las de musculo liso.
⤷ Sustancia intercelular del cartílago.
⤷ La cubierta celular que se encuentra en la cara externa de la membrana plasmática de
algunos tipos celulares.
⤷ Gránulos de glucógeno.

2) Técnica de Feulgen:
Esta técnica es utilizada para evidenciar ADN. Su fundamento se basa en la hidrólisis
controlada del tejido con ácido clorhídrico suave, donde se produce la ruptura de las uniones
entre las bases puricas y los azucares liberando los grupos aldehídos. Estos producirán la
posterior reducción del reactivo de Schiff, haciendo que el mismo se torne fucsia.

3) Técnica de Sudán:
En esta técnica se utilizan sustancias coloreadas liposolubles, éstas se llaman Sudanes y
colorean distintos tipos de lípidos. Éstos colorantes son incorporados en los tejidos a través de
vehículos en los que son solubles, atraviesan las membranas celulares y son retenidos en los
lípidos.
En dicha técnica, el tejido debe ser fijado por congelación debido a que en la THC todos los
lípidos son desplazados por los solventes orgánicos utilizados.
4) Técnicas Enzimáticas:
Esta técnica es utilizada para detectar enzimas celulares, por lo cual, los cortes del tejido
deben ser incubados en condiciones específicas de manera que las enzimas que se desean
investigar sean preservadas.
En general, el producto de reacción enzimática no es visible por lo que se recurre a reacciones
adicionales añadiendo un reactivo que reaccione con el producto enzimático y que dé como
resultado un precipitado visible. Así se puede observar, como, por ejemplo:
⤷ Fosfatasa acida (presente en lisosomas).
⤷ Peroxidasa.
⤷ Deshidrogenasas.
⤷ Etc.

5) Técnicas Inmunoquímicas:
Técnicas histoquímicas que emplean anticuerpos específicos como reactivos para la
localización de determinados componentes celulares/extracelulares. Permite evidenciar
sustancias en pequeñas cantidades gracias a la alta sensibilidad de detección que poseen los
anticuerpos.

6) Radioautografía:
Se utiliza para localizar y reconocer cual es el proceso de producción de determinado
producto celular. Se utilizan moléculas marcadas con un isotopo radioactivo, la cual es
inyectada en el sujeto al que se quiere estudiar, o, pueden ser introducidas en la células y
tejidos. Luego de haber obtenido la muestra y que la misma haya sido montada en el
portaobjetos, se utiliza una emulsión fotográfica sensible a la radioactividad que formará una
delgada capa superficial. Los sitios en los que hay radioactividad se apreciaran como gránulos
sobre la emulsión fotográfica que pueden ser observados en el MOCC o en el MET (cumpliendo
otros requisitos).

7) Hibridación in situ:
Este proceso permite detectar secuencias específicas de ácido nucleicos a través de la unión
por complementariedad con sondas de ADN monocatenario, marcadas radioactivamente.
La hibridación in situ es el proceso mediante el que dos moléculas de ácido nucleico
monocatenario (ADN o ARN) con complementariedad de bases nucleotídicas, se unen entre sí
para formar una doble cadena.

¿QUÉ SE TIÑE CON QUE?

Componente Estructura Colorante Color
ADN
Proteinas
GAGs
Hidratos de Carbono