CITOLOGÍA, HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA

Unidad 1: Instrumentos de Estudio de la Histología

1.4. TÉCNICA HISTOLÓGICA

Los objetivos de esta cartilla son:

● Comprender los pasos de la técnica histológica.
● Entender los conceptos de histoquímica.
● Conocer las diferentes nciones especiales.

¿Qué es una preparación histológica y cómo se obtiene?

Se denomina preparación a la sección o corte del espécimen biológico que se ha
procesado para su estudio. Sin embargo, por analogía, también se denomina así al
conjunto que forman la muestra y el soporte donde está colocada. La muestra
histológica normalmente consiste en una sección de unas 5 μm de grosor que se dispone
alojada entre dos cristales rectangulares: uno de cierto grosor y consistencia, el
portaobjetos y otro muy fino, el cubreobjetos. La muestra debe ser cortada muy fina ya
que tiene ser atravesada por la luz en el MO. La muestra preparada (deshidratada y
coloreada) está lista para su observación.

Procesamiento de muestras para microscopía óptica: Técnica histológica

El objetivo de la preparación histológica es preservar la histoarquitectura del
tejido tal cual como se encuentra en el organismo. Para poder observar la muestra a
través del microscopio óptico, ésta debe de ser "preparada" mediante un proceso que
incluye una serie de pasos y se denomina Técnica Histológica. La muestra puede
provenir de una autopsia, biopsia o animales experimentales (ratón, conejo, etc).
Siempre debe ser representativa del órgano que se desea estudiar y pequeña para
conseguir que todos los solventes impregnen completamente el tejido.

El protocolo de la técnica histológica es el siguiente:

1) Fijación: Empleo de sustancias químicas para preservar la estructura del tejido. Las
muestras se sumergen en el fijador inmediatamente luego de extraerse del organismo.
Su función es para:
-Abolir el metabolismo celular.
-Impedir la degradación enzimática por autolisis.
-Destruir microorganismos.
-Endurecer el tejido (desnaturalización de proteínas).
Entre las soluciones fijadores más comunes para tejidos se encuentra el Formaldehido
4% y 10% ya que presenta rápida penetración, fácil de adquirir, preparar y además es
económico. Otras de sus propiedades es que conserva muy bien el tejido al reaccionar
con las proteínas y preservando su estructura tridimensional.
Cuando la muestra no es un sólido sino que proviene de la sangre o suspensiones
celulares de líquidos de punción abdominal o torácica, es común desecar la muestra

Dra. María Guadalupe del Valle Barrionuevo 1

 CITOLOGÍA, HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA
Unidad 1: Instrumentos de Estudio de la Histología

sobre el portaobjeto y flamearlo 3 a 4 veces sobre la llama; de este modo se coagulan

las proteínas y luego se procede a la coloración de la muestra. También se pueden
desecar a temperatura ambiente y fijar las muestras por inmersión en alcohol etílico al
96°.
2) Deshidratación: Se realiza para sustituir el agua de los tejidos y reemplazarla por
alcohol: Etanol, para ello se utilizan soluciones alcohólicas de graduación creciente
(solución de etanol 70%, solución de etanol 80%, solución de etanol 96% y solución de
etanol 100%).
3) Aclaración: es la sustitución del agente deshidratante por otro, denominado de
transición (normalmente se utiliza el Xilol: solvente orgánico) que a su vez es miscible
en el medio de inclusión. El medio de inclusión proporcionará a la muestra la dureza
necesaria para poder ser seccionada.
4) Inclusión de la muestra: se embebe en el medio que le proporcione dureza.
Normalmente se utiliza la parafina, que es una cera y por lo tanto no miscible en agua.
Así, esta sustancia ha sustituido al agua que inicialmente estaba en las células y tejidos.
Una vez solidificada la parafina se obtiene lo que se conoce como taco (Fig. 17).
5) Corte: A partir del taco se obtienen los cortes histológicos de unas 5 μm de grosor,
que se depositan sobre los portaobjetos, donde se dejan hasta que se adhieran al cristal.
Estos cortes se realizan con un equipo llamado Micrótomo. Las secciones se levantan
con un pincel y se sumergen en un baño termostático con agua a 40 °C para que se
estiren. Luego se sumerge en el baño un portaobjeto y con la ayuda del pincel, se ubica
el corte en sobre la superficie del portaobjeto.
Existen otros equipos para realizar cortes para microscopia óptica como El
crióstato y el micrótomo de congelación permiten obtener cortes o secciones de 16 a 20
mm de espesor de un órgano o bloque de tejido, que ha sido congelado o que ha sido
fijado y luego congelado. Estos cortes, al provenir de tejidos que no han experimentado
los procesos de inclusión ni deshidrataciones, son de elección para estudios utilizando
técnicas inmunohistoquímicas.
6) Eliminación de la parafina existente en las secciones: se realiza mediante su
inmersión en el líquido de transición (xilol).
7) Sustitución del xilol por alcohol del 100%.
8) Deshidratación: Sustitución del alcohol por agua utilizando concentraciones
decrecientes de soluciones de etanol (Fig. 16).
9) Tinción: Los colorantes más utilizados (hematoxilina y eosina) son acuosos, por lo que
es necesario "deshacer" los pasos.
10) Deshidratación de las secciones ya teñidas (concentraciones crecientes de
soluciones de etanol).
11) Sustitución del alcohol por el xilol.
12) Montaje: en este momento se añade sobre la sección histológica un líquido viscoso
para que la cubra, es el medio de montaje y se utiliza Bálsamo de Cánada y, a

Dra. María Guadalupe del Valle Barrionuevo 2

 CITOLOGÍA, HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA
Unidad 1: Instrumentos de Estudio de la Histología

continuación se coloca encima el cubreobjetos. El medio de montaje no es soluble en

agua y tiene como virtud el permitir que la luz lo atraviese sin producir distorsiones en
la imagen. Además, en medio de montaje se solidifica en unas 24 horas, lo que permite
almacenar durante muchísimos años las preparaciones histológicas. El preparado ya
está listo para colocarlo en la platina del microscopio.

Figura 16. Proceso de Desparafinación e hidratación en jarras de Coplin en el Laboratorio de

Microscopia FCM-UNSE.

Figura 17. Diferentes fases del proceso de inclusión en parafina de una pieza histológica. El
proceso va desde la obtención del material y tallado de la pieza, la deshidratación, la
diafanización hasta la realización del “taco” (De Juan 1999).

Dra. María Guadalupe del Valle Barrionuevo 3

 CITOLOGÍA, HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA
Unidad 1: Instrumentos de Estudio de la Histología

Técnicas Histoquímicas
La mayoría de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello
necesitamos teñirlos para observar sus características morfológicas. Las tinciones
generales están basadas en el uso de colorantes, sustancias mediante las cuales se
consigue colorear a los tejidos. Los colorantes son normalmente hidrosolubles y se
caracterizan por unirse a ciertas moléculas presentes en los tejidos gracias a afinidades
electro-químicas. Se utilizan normalmente para teñir a las células y componentes
tisulares que van a ser observados con el microscopio óptico y por ello se realizan
habitualmente sobre secciones de tejido, siendo las más utilizadas las secciones
obtenidas a partir de inclusiones en parafina u obtenidas en el criostato. Los colorantes
son los elementos principales de las tinciones generales. Son moléculas que poseen tres
componentes importantes: un esqueleto incoloro, que normalmente es un anillo
aromático de benceno, al cual se le unen dos tipos de radicales: uno que aporta el color,
denominado cromóforo, y otro que posibilita la unión a elementos del tejido
denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molécula
se denomina cromógeno.
Según la naturaleza química del radical auxocromo los colorantes se clasifican en:
Básicos: son sales en las que la base aporta el color, mientras que la parte ácida
es incolora. Tienen apetencia por sustancias ácidas del tejido como el ADN o ciertos
componentes de la matriz extracelular como los glicosaminoglicanos. Así, ponen de
manifiesto el núcleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los ribosomas por ser muy
abundante, así como ciertas matrices extracelulares ricas en componentes ácidos.
Ejemplos de colorantes básicos son la tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de
metileno o la hematoxilina.
Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora. Tienen apetencia por
sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular
y también por el colágeno de la matriz extracelular. Ejemplos de colorantes ácidos son
la fucsina ácida, verde rápido, naranja G o la eosina.
Neutros: poseen una porción ácida y otra básica, ambas con capacidad para
aportar color. Por tanto un mismo colorante puede teñir tanto las partes básicas como
las ácidas de los tejidos. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.
Indiferentes: realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad
química sino porque se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante sudán se disuelve
en los lípidos y por tanto teñirá a las gotas de lípidos, especialmente en los adipocitos.
Cuando un colorante se une al tejido y refleja un color diferente al que tiene en solución
se dice que ha ocurrido un fenómeno de metacromasia. Esto se debe a que las
propiedades de absorción de la luz del colorante cambian al unirse a componentes
celulares. Por ejemplo, el azul de toluidina se vuelve púrpura cuando se une a ciertos
gránulos de los mastocitos. Cuando el colorante unido al tejido tiene el mismo color que
en solución se denomina ortocromasia.

Dra. María Guadalupe del Valle Barrionuevo 4

 CITOLOGÍA, HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA
Unidad 1: Instrumentos de Estudio de la Histología

Tinción de rutina
Una de las tinciones más comúnmente usada en histología es la hematoxilina-
eosina o H&E sobre cortes de parafina. La Hematoxilina es un colorante básico, por lo
tanto posee carga positiva e interaccionará con componentes aniónicos de las células.
Aquellos componentes que presentan afinidad por la hematoxilina se dice que
presentan basofilia como los ácidos nucleicos, RER, matriz extracelular (GAG). Mientras
que la Eosina (del grigo eos: “amanecer”, por el color rosado) es un colorante ácido que
reaccionará con componentes celulares con acidofilia entre los que se encuentran
filamentos citoplasmáticos (miocitos), componentes membranosos intracelulares y
citoplasmáticos no especializados, y fibras extracelulares. De este modo, los preparados
de rutina que vamos a observar durante el cursado estarán coloreados violeta y rosa.

Coloreado con Hematoxilina

Coloreado con H&E

Coloreado con Eosina

Figura 18. Preparado de páncreas teñido sólo con Hematoxilina, sólo con Eosina y combinada
H&E. Nótese como se definen los límites celulares, la ubicación de los núcleos y la presencia de
dos poblaciones celulares diferentes.

Coloraciones especiales
1) Técnicas de Sudán: Sirven para poner en evidencia lípidos intracelulares.
Utilizan colorantes liposolubles como el Sudán III (rojo) o el Sudán IV (negro) que
colorean por afinidad física. Tienen como inconveniente que no se puede hacer inclusión
en parafina pues los lípidos se disuelven en los solventes utilizados para deshidratar y
aclarar. Se requiere entonces realizar cortes en el criostato.

Dra. María Guadalupe del Valle Barrionuevo 5

 CITOLOGÍA, HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA
Unidad 1: Instrumentos de Estudio de la Histología

2) Técnica de P.A.S (Periodic Acid Schiff): Sirve para identificar el glucógeno y

glucoproteínas (ejemplo moco). Mediante el tratamiento de los cortes desparafinados
con Acido Periódico se exponen los grupos aldehído (fuertemente oxidante) presentes
en las uniones 1-2 glicol de los polisacáridos mencionados. Luego del lavado, se adiciona
el reactivo de Schiff, que es Fucsina (colorante de color fucsia) que había sido
previamente decolorado por reducción con anhídrido sulfuroso. Los grupos aldehído
oxidan y de este modo recolorean la Fucsina. Las zonas donde hay glucógeno o
glucoproteínas se ven de color fucsia.
3) Técnica de Feulgen: Se utiliza para evidenciar ADN. Es similar a la técnica de
PAS salvo que los cortes se tratan con Ácido Clorhídrico y no con Ácido Periódico. Expone
grupos aldehído de la desoxirribosa del ADN. La cromatina nuclear se ve de color fucsia,
quedando el nucléolo sin teñir.
4) Tricrómico: Utilizan combinaciones de tres soluciones colorantes
contrastantes. Las más utilizadas son las de Mallory, Golden Masson y Van Gieson pero
existe una amplia variedad. Son de gran utilidad para discriminar entre tejidos que con
Hematoxilina-eosina resultan de apariencia y coloración similares como, por ejemplo, el
tejido conectivo y muscular.
5) Impregnaciones Argénticas (I/A): Son de gran utilidad para el estudio del tejido
nervioso y algunas fibras del tejido conectivo. Se basan en la propiedad de ciertos
elementos fibrilares presentes en estos tejidos, de promover el depósito de plata
metálica al ponerse en contacto con soluciones de sales de este metal. Esta técnica
puede realizarse indistintamente sobre cortes o bien sumergido trozos de tejido en la
solución metálica (impregnación en bloque) procediéndose luego a incluirlo en parafina
y cortarlo. Los resultados se evidencian por una coloración negra o marrón.
6) Técnica Inmunohistoquímica: Son métodos muy específicos y sensibles de
detección de compuestos químicos, de amplio uso en la actualidad en investigación y en
clínica. Permiten identificar con certeza absoluta la presencia de determinadas
proteínas en células y tejidos, basándose en reacciones antígeno-anticuerpo, de alta
especificidad. Un ejemplo podría ser determinar en qué células se sintetiza y almacena
la hormona insulina en el páncreas, para ello se exponen cortes fijados de tejido
pancreático a un anticuerpo anti-insulina, el cual lleva acoplado un sistema químico que
permite ponerlo en evidencia y que poder de dos tipos básicos:
1) un colorante fluorescente
2) una enzima (ejemplo peroxidasa) que al adicionarle su sustrato conduzca directa o
indirectamente a un producto coloreado evidenciable al microscopio.
Dado el carácter estable de la reacción antígeno-anticuerpo, luego de lavar la
preparación, la fluorescencia o la coloración sólo se verá en los sitios donde existe
insulina.

Dra. María Guadalupe del Valle Barrionuevo 6

 CITOLOGÍA, HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA
Unidad 1: Instrumentos de Estudio de la Histología

Colorante/Tinción Color Tiñe Estructuras

Hematoxilina Violeta/azul Material basofílico Núcleo
(cargado
negativamente)
Eosina Rosa Material acidofílico Citoplasma,
(cargado proteínas
positivamente)
Periodic acid- Fucsia Carbohidratos Moco,
Schiff (PAS) membrana
basal, Células
caliciformes
Tricrómica de Van Azul Núcleo Tejido
Gieson conectivo
ácido pícrico- Amarillo Citoplasma denso
fucsina ácida y
hematoxilina Rojo Colágeno
Tricrómica de Violeta Núcleo Tejido
Masson conectivo
Rojo Citoplasma denso,
cartílago (azul)
Azul/Verde Colágeno miocitos (rojo)
Tricrómica de Rojo Núcleo Tejido
Mallory conectivo
Fucsina ácida, Rojo pálido Citoplasma denso
Orange G, Azul de
anilina. Azul Colágeno

Orceína Negro Elastina Fibras elásticas

Impregnación Marrón/negro Fibras reticulares Tejido
Argéntica (Plata) conectivo
Wright Violeta Núcleos/gránulos Tejido
Eosina, azul de de Basófilos sanguíneo
metileno Rojo brillante Citoplasma de
eritrocitos/gránulos
de Eosinóflos
Azul de Toluidina Azul Gránulos de Mastocitos
Metacromasia: Mastocitos
Violeta

Dra. María Guadalupe del Valle Barrionuevo 7

 CITOLOGÍA, HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA
Unidad 1: Instrumentos de Estudio de la Histología

Artefactos
Al estudiar e interpretar secciones de tejido teñidas, es importante recordar que
las preparaciones microscópicas son el resultado final de una serie de procesos que
comenzaron con la recolección del tejido y terminaron con el montaje de un
cubreobjetos en el portaobjetos. Ciertos pasos en este procedimiento pueden
distorsionar ligeramente los tejidos, produciendo anormalidades estructurales menores
llamadas artefactos que no están presentes en el tejido vivo. Una de estas distorsiones
es la contracción menor de las células o regiones tisulares producidas por el fijador, por
el etanol o por el calor necesario para la inclusión en parafina. La contracción puede
crear espacios artificiales entre las células y otros componentes del tejido. Dichos
espacios también pueden ser el resultado de la pérdida de lípidos o sustancias de bajo
peso molecular que el fijador no conserva o se eliminan con los líquidos deshidratantes.
Las grietas leves en las secciones también pueden aparecer como grandes espacios en
el tejido. Otros artefactos pueden incluir pequeñas arrugas en la sección (que el
principiante puede confundir con estructuras lineales en el tejido) o manchas causadas
por precipitados de sustancias (que puede confundirse con estructuras celulares como
los gránulos citoplasmáticos). El estudiantado debe ser consciente de la existencia de
artefactos y poder reconocerlos.

Bibliografía
Brusco, H.A., López Costa, J.J. y Fabián Loidl, C. (2014) Histología médico-práctica.
Barcelona, España. Editorial Elsevier.
Mescher, A.L. and Uchôa Junqueira, L.C. (2018) Junqueira's basic histology : text and
atlas. New York (NY). Ed. McGraw-Hill Education.
Ross, M.H. y Pawlina, W. (2007) Histología. Texto y atlas color con Biología Celular y
Molecular. 5ª edición. Editorial Médica Panamericana.

Dra. María Guadalupe del Valle Barrionuevo 8