Escuela de Biología-Microbiología Prácticas de Biología Celular

COLORANTES Y TECNICAS DE COLORACIÓN. PREPARADOS DE MUESTRAS

OBJETIVOS
1. Conocer la importancia de los colorantes en las observaciones microscópicas.
2. Que el estudiante aprenda a realizar los preparados en fresco y en seco.
3. Que el alumno conozca las principales técnicas de coloración empleadas.

INTRODUCCIÓN
Muchas células u organismos como las bacterias resultan difíciles verlas al microscopio por ser
incoloras o transparentes, por lo que es necesario realizar preparados microscópicos, fijarlas y
teñirlas aplicando alguna técnica de coloración para distinguir los detalles de sus estructuras
externas e internas que sirven de base para su identificación y clasificación.

COLORANTE
➢ Compuesto químico que tiene color y que lo transmite a tejidos, células, fibras, etc.
coloreándose de acuerdo a la naturaleza física química tanto del mismo objeto como del
colorante.
➢ Permiten hacer visibles los preparados microscópicos y transparentes, conocer su forma y
tamaño, así como sus estructuras internas y externas.
➢ En cuanto a su estructura química los colorantes están constituidos por un grupo funcional
cromóforo y un auxocromo.
➢ La porción del colorante que le da su color es el cromóforo. Un colorante puede tener
múltiples cromóforos, y cada cromóforo asume la intensidad del color. El auxocromo es la
porción cargada de un colorante y le permite actuar como tal a través de enlaces iónicos o
covalentes entre éste y la célula a teñir.
➢ Teñir es una reacción de intercambio de iones de colorante a lugares activos de la superficie
o interior de las estructuras de la célula,

CLASIFICACION DE LOS COLORANTES

➢ POR SU ORIGEN

Colorantes naturales: Son aquellos que se obtienen directamente de animales o

vegetales, tales como: el carmín, azafrán, hematoxilina, etc.
Colorantes artifíciales: Son productos de derivados químicos, obtenidos en su mayor
parte de alquitrán de hulla, son colorantes de anilina y se distinguen los colorantes que
conocemos comúnmente; los colorantes ácidos y básicos, que pueden estar formando
sales, así como colorantes neutros.

➢ POR SU COMPORTAMIENTO QUÍMICO

Colorantes ácidos: También son llamados aniónicos. Poseen grupos cargados

negativamente como carboxilos (-COOH) e hidroxilos fenólicos (-OH). Los colorantes
ácidos, debido a su carga negativa, se unen a estructuras de la célula cargadas
positivamente. y tienen afinidad especial por colorear el citoplasma (colorantes
citoplasmáticos). Los más usados son: la eosina, safranina, la fucsina ácida, ácido pícrico,
etc.
Colorantes básicos: También son llamados catiónicos. Se trata de aquellos donde la
carga del cromóforo es positiva. Tienen grupos cargados positivamente y se
comercializan normalmente como sales de cloruro. Los colorantes básicos se unen a
moléculas cargadas negativamente como ácidos nucleicos, muchas proteínas y la

Docente: MSc. Anacelly Valera López

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superficie de células procariotas. Los más usados son: fucsina básica, cristal violeta o
violeta de genciana, azul de toluidina, azul de metileno, etc.
.
Colorantes neutros: Un colorante neutro se trata de una sal compuesta de un colorante
ácido y un colorante básico la primera colorea el citoplasma y la otra el núcleo, los más
usados son: Giemsa, Wright, Leishman.

PREPARADOS DE LA MUESTRA

➢ Los preparados en fresco o en seco son métodos de análisis que nos van a permitir,
gracias al microscopio y otras herramientas de laboratorio, la visualización de una
muestra que a simple vista no son captados por el ojo humano

➢ Los preparados para las observaciones microscópicas pueden ser de dos clases:

• Preparados en fresco. - Son aquellos en los cuales la muestra a examinar no se

encuentra fija a la lámina portaobjeto, está sumergida en una sustancia líquida y
generalmente se utiliza una laminilla cubre objeto para la observación.
Comúnmente se observan con objetivos a seco y el microscopio en posición normal.

Técnica del Montaje Húmedo:

Las preparaciones húmedas se efectúan colocando una gota del líquido que
contiene los microorganismos en estudio sobre una lámina portaobjeto y
cubriéndolo con una laminilla, evitando la formación de burbujas.
Si el material es sólido o muy rico en gérmenes, se coloca sobre la lámina
portaobjeto una gota de solución salina y en ella se emulsiona la muestra en
estudio y se cubre con una laminilla.
Técnica de la gota pendiente:
Persigue el mismo propósito que el montaje húmedo, con la ventaja que hay
menor distorsión por el peso de la lámina cubreobjeto. Se utiliza lámina
portaobjeto con excavación central. La técnica consiste en colocar en el centro
de una lámina cubreobjeto una gota de la suspensión en estudio. El borde de la
excavación de la lámina portaobjeto se cubre con una delgada capa de vaselina
y luego se invierte sobre la laminilla presionando suavemente, guiando la gota
de suspensión hacia el
centro de la concavidad; luego se procede a colocar en posición normal la
lámina portaobjeto para el examen de microscopio.

• Preparados en seco. - Son aquellos en los cuales la muestra a examinar se

encuentra fija a la lámina portaobjeto, pudiendo llevar laminilla o no. Generalmente
se observan con el objetivo de inmersión, debiendo colocarse previamente una gota
de aceite de cedro. Los preparados en seco se obtienen por extensión o por frotis.

Extensión: Consiste en extender la sustancia examen en un portaobjeto del

modo más uniforme y fino posible; esta extensión se puede hacer con otra
lámina portaobjeto, con una torunda, asa bacteriológica (de Koll),
dependiendo del tipo de análisis y de muestra. La lámina que va a contener
la muestra debe estar completamente limpia y libre de grasa.

El frotis: Es una forma particular de extensión; se practica cuando se trabaja

con sangre completa. Consiste en colocar una gota de la muestra (sangre)
sobre uno de los extremos de la lámina portaobjetos y luego con otra lámina
realizar un movimiento de desplazamiento en un solo sentido una sola vez.

➢ FIJACIÓN

Docente: MSc. Anacelly Valera López

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La fijación es un proceso que provoca la muerte de las células manteniendo las

características morfológicas y químicas que tuvieron durante su vida. Estos fijadores
actúan transformando el coloide protoplasmático en geles insolubles e irreversibles,
solidificando el protoplasma por medio de la coagulación o precipitación.

CLASES DE FIJADORES

FISICOS: Por desecación, calor (húmedo o seco) y frío (congelación).

QUÍMICOS: alcohol etílico 95%, alcohol metálico, formol 10%, bicromato de

potasio, Carnoy, Líquido de fleming, líquido de Zenker, etc.

COLORACIÓN

La Coloración es un proceso físico químico mediante el cual un cuerpo toma color bajo
la acción de otra sustancia llamada colorante. La penetración del colorante se debe a un
fenómeno osmótico-absorción (teoría física) y a la unión entre moléculas del colorante
con los elementos constituyentes de la muestra (teoría química).
CLASES DE COLORACIÓN
VITALES: Cuando el colorante no provoca la muerte celular, se utiliza para teñir material
vivo. P.e azul de metileno, rojo neutro, verde janus, etc.

SUPRAVITALES: Cuando los colorantes se aplican después que la muestra ha sido

fijada. Tenemos:

Directas: Cuando el colorante se aplica directamente al tejido o preparado que se

desea colorear.
Indirectas: Cuando antes de aplicar el colorante, se requiere de la intervención de
intermediarios o mordientes para que la coloración tenga a lugar.
Progresivas: Cuando se aplican varios colorantes en tiempos diferentes cada uno.
Regresivas: Cuando primero se realiza una sobre coloración y después, poco a
poco, se decolora con alcohol o agua acidulada, hasta obtener el color deseado.
Simple: Cuando se emplea un solo colorante que colorea algunos elementos del
preparado. Se emplean colorantes ácidos o básicos.
Combinada: Emplea colorantes ácidos y básico a la vez para teñir elementos
nucleares y citoplasma.
Panoptica: Es una coloración combinada realizada sucesivamente por colorantes
neutros.
Pancrómica o Neutra: Cuando en un solo colorante se obtienen diferentes tonos
en los componentes tisulares o celulares. Usa colorantes neutros.
Diferencial: Utiliza varios colorantes, incluso de contraste como la coloración gram.

Los factores que intervienen en la coloración son: pureza de los colorantes,

concentración de los colorantes, pH de la solución del colorante, temperatura del medio
ambiente, sustancias adicionales y tiempo de coloración.

CUESTIONARIO

1. Mencione 5 colorantes ácidos y básicos

2. ¿Qué es un mordiente?
3. Mencionar 3 tipos de coloraciones diferenciales.

Docente: MSc. Anacelly Valera López