UNIVERSIDAD NACIONAL HERMILIO VALDIZÁN

E.P. INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

Curso: Química orgánica

Guía de práctica 3:
CROMATOGRAFÍA DE PAPEL Y CAPA FINA

Fundamento
La cromatografía es una técnica para separar e identificar mezclas de compuestos y se
define como la separación de los componentes de una mezcla por distribución entre dos fases,
una móvil y la otra estacionaria. Debe su nombre al hecho de que se empleó por primera vez en
la separación de materiales colorantes. Desde 1906 el catedrático en botánica de la universidad
de Varsovia Michael Tswett, logró separar los pigmentos de hojas vegetales obtenidos por
extracción con éter de petróleo, utilizando una columna de carbonato de calcio pulverizado. Los
pigmentos separados aparecían como bandas coloreadas en la columna, lo que justifica el
nombre que eligió para el método (del griego kromatos que significa <color>, y graphos que
significa <escrito>).

La cromatografía en capa fina se lleva acabo empleando como fase estacionaria un

sólido (adsorbente) finamente dividido colocado en forma de una capa fina sobre una placa de
vidrio, denominada cromatoplaca.

Para llevar a cabo la separación, se coloca en el origen de la cromatoplaca una pequeña

cantidad de la mezcla por separar y se deja que ascienda por medio de capilaridad con la ayuda
de un disolvente adecuado (eluyente). Los componentes de la mezcla se separan dependiendo de
la afinidad que tengan con el adsorbente y el eluyente.

Un componente es atraído por el adsorbente de acuerdo a su polaridad, por ejemplo, los

alcoholes, ácidos carboxílicos y aminas son compuestos polares y por lo tanto, son atraídos con
mayor fuerza por adsorbentes polares como la alúmina y el óxido de magnesio. La diferencia de
polaridad causará que los componentes de la mezcla asciendan a diferentes velocidades y se
separen. Por ello es importante realizar una buena elección del adsorbente, considerando las
propiedades físicas (polaridad) del componente a separar. Los adsorbentes más empleados son
la sílica gel y la alúmina mientras que la elección del eluyente dependerá de la polaridad de los
componentes de la mezcla a separar.

El Factor de retención (Rf) es la relación que se establece entre la altura del componente
separado y la altura alcanzada por el eluyente y nos sirve para identificar el tipo de sustancia
separada.

Altura alcanzada por el compuesto

Rf =
altura alcanzada por el eluyente

El Rf también se usa para seleccionar el disolvente o mezcla de disolventes ideales para

la separación: si es menor de 0.5 el eluyente es de muy baja polaridad para la separación y si es
mayor de 0.5 es de muy alta polaridad. La tabla 1 nombra adsorbentes y disolventes ordenados
de menor a mayor polaridad, lo cual facilita la elección del sistema a utilizar para la separación
de un determinado componente.

La cromatografía en capa fina posee la ventaja de ser rápida, sencilla y versátil. Para
realizar las separaciones no es necesario utilizar equipo especial o costoso y el analista puede
modificar las condiciones experimentales de manera fácil y rápida. Así la técnica resulta útil
para diversos propósitos, tales como corridas de prueba, para probar fases móviles y

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estacionarias de la cromatografía, en el control del progreso de reacciones sintéticas, para hacer
diagnósticos clínicos etc.

Tabla 1. Absorbentes y disolventes empleados en cromatografía de capa fina

Adsorbentes Disolventes
Azúcar, almidón Hexano, éter de petróleo
Inulina Heptano
Talco Ciclohexano
Carbonato de sódio Tetracloruro de carbono
Carbonato de potasio Benceno
Carbonato de cálcio Tolueno
Magnesia Cloroformo
Gel de sílice activada Éter dietílico
Alúmina activada Acetato de etilo
Piridina
Acetona
Propanol
Etanol
Metanol
Agua
Mezclas de ácidos, bases con agua y
alcoholes

La práctica tiene como propósito que el alumno reconozca los principios de la

cromatografía de papel/capa fina y aplique la técnica para separar los pigmentos presentes en un
extracto.

MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos:
 Acetona
 Etanol absoluto
 Hexano Metodología
 Silica gel para cromatografía en
capa fina (60 GF234) Preparación de placas para
 Carbonato de calcio en polvo cromatografía de placa fina (técnica de
vaciado)
 Sulfato de sodio anhidro
Lavar y desengrasar con acetona los
 Muestras problema
portaobjetos y dejar que sequen
perfectamente.
Materiales:
Preparar en un vaso de precipitados de 150
 Portaobjetos mL una suspensión de 30 g sílica gel en 70
 Tubos capilares mL de acetona:etanol (3:7).
 Vaso de precipitados de 150 mL Agitar la suspensión y sumergir dos
 Probeta de 50 mL portaobjetos juntos tomándolos por los
 Mortero con pilón lados.
 Tubos de ensayo Sacar con cuidado los dos portaobjetos del
 Gradilla vaso de precipitados, permitiendo que se
 Pipeta graduada de 5 mL elimine el exceso de suspensión.
 Frascos de vidrio Con sumo cuidado separar los portaobjetos,
evitando hacer contacto con la superficie
que tiene la sílica.

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Colocar la cromatoplaca sobre una
superficie plana y dejar que se evapore el
disolvente.
Activar las cromatoplacas en una estufa a
100 °C durante 30 minutos
Preparación de la muestra
Pesar aproximadamente 2 g de hojas de
espinaca. Lavar las hojas con agua,
quitarles las venas, cortarlas con unas
tijeras y poner las piezas en un mortero
junto con 22 ml de acetona, 3 ml de hexano
y una pequeña cantidad de carbonato de
calcio CaCO3 con una espátula (para evitar
la degradación de pigmentos
fotosintéticos). Muele la mezcla hasta que
las hojas se decoloren y el solvente
adquiera un color verde intenso. Transferir
solo el líquido resultante a un embudo de
separación (evitar la transferencia de
sólidos), y agregar 20 ml de hexano y 20 ml
de solución acuosa de NaCl al 10%.
Remueve la mezcla y decanta. Deseche la
capa acuosa (abajo) y la capa orgánica
(arriba) y lave con 5 ml de agua
desionizada. Decantar nuevamente (con 20
ml adicionales de solución de NaCl) y
transferir la capa orgánica a un matraz
Erlenmeyer de 50 ml. Seque la solución con
Na2SO4 anhidro y retire el desecante por
filtración por gravedad. Divida la muestra
en dos partes. Tome 1 ml de solución y
reserve en un tubo de ensayo para el
análisis por TLC, y use la muestra restante
para la separación CC.
Análisis TLC de pigmentos de espinacas
Prepare un trozo cuadrado de papel de filtro
ligeramente más pequeño en altura y
anchura que el tanque de cromatografía y
colóquelo contra la parte interior de la
pared, asegurando una visión completa de
la lámina de TLC durante todo el
experimento.
Prepare una solución de hexano/acetona
(7:3).
Coloque el eluyente dentro de la bandeja (a
unos 5 mm de altura) y séllela; esto permite
que los vapores del solvente saturen toda la
bandeja para impregnar el papel filtro.
Con un lápiz (utilice únicamente lápices de
grafito) y una regla, dibuje una línea
horizontal a unos 5 mm de la base de una
lámina de TLC.
Con la ayuda de un capilar de vidrio,
agregue una gota en la línea de la lámina de
TLC.
La lámina TLC entrará rápidamente en la
bandeja; manténgalo en posición vertical y
ligeramente inclinado para que desde el
exterior se pueda ver en todo momento el
nivel de disolvente en la lámina de TLC.
Cuando el nivel de solvente esté colocado a
unos pocos milímetros de la parte superior
de la lámina de TLC, retire la lámina de
TLC de la bandeja y deje que se seque al
aire.
(Aparecen manchas de color a lo largo de la
lámina de TLC).
Tapar rápidamente la cubeta para mantener
su atmósfera saturada de disolvente.
Marcar con un lápiz de grafito el nivel
alcanzado por el disolvente.
Aparecen manchas coloreadas a lo largo de
las manchas de TLC, los carotenoides se
mueven más rápido que la clorofila.
Determinar el valor de Rf.
Separación cromatográfica de pigmentos
por CC
Coloque algodón o lana de vidrio en la
parte inferior de la columna.
Vierta 10 ml de eluyente (hexano/acetona,
7:3) en la columna.
Pesar 20 g de gel de sílice en un matraz
Erlenmeyer de 40 ml y agregar
aproximadamente 50 ml de eluyente,
revolviendo con una varilla de vidrio o una
espátula, para formar una suspensión.
Llenar la columna con la suspensión,
abriendo la llave de paso de la columna
hasta que el líquido esté en el borde
derecho de la fase estacionaria (es muy
importante que la columna nunca se vacíe,
total o parcialmente, y que no se formen
burbujas de aire), recogiendo el disolvente
en un recipiente para su reutilización.
Se puede añadir arena al gel de sílice para
formar una capa de 1 o 2 cm de espesor en
el borde de la fase estacionaria.
Pipetear 10 ml de la muestra preparada a
partir de hojas de espinaca, y añadirlas a la
columna.
Agregue eluyente abriendo la llave de la
columna y recogiéndolo en un Erlenmeyer.
Cuando aparezca una banda de
decoloración amarilla (β-caroteno),
recolecte el líquido en tubos de ensayo.
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Cambiar el tubo de ensayo cuando el tubo
comience a llenarse o cuando el contenido
cambie de color.

REFERENCIAS

Ávila,J et al. (2001). Química Orgánica.

Experimentos con un enfoque ecológico.
UNAM, México.
Isac-García, J., Dobado, J. A., Calvo-
Flores, F. G., & Martínez-García, H.
(2015). Experimental organic chemistry:
laboratory manual. Academic Press. (pag
139-148)