Resumen

La práctica de cromatografía ha sido una de las más complicadas en mi corta

instancia en la F.E.S Todo lo que esta conlleva desde la recaudación de frascos y
reactivos. La selección de espinaca y chile seco, preparación de la suspensión
entre otros que lleva esta práctica, La práctica debe llevar un estricto orden para
llevar un control sobre esto. Primero se inició con separar el pigmento del vegetal
elegido en mi caso Espinaca, a la cual vamos a extraer su pigmento por el método
de maceración. Este proceso será explicado de manera más detallada en la
metodología. Al obtener el extracto de manera “Pura” se procedió a realizar la
cromatografía en capa fina primero con una ronda de 10 disolventes de forma
pura.

Basado en los resultados se procedió a realizar el mismo proceso pero con una
mezcla especifica de Disolventes para obtener un resultado intermedio en este
caso Hexano y acetato de etilo a diferentes volúmenes para apreciar un mejor
resultado en la separación de clorofilas. Procedimos a realizar la cromatografía en
columna… Así podemos tener dos Tipos de sustancias orgánicas y procedemos a
comparar que tal efectivo fue la cromatografía en columna pasando a realizar capa
fina. Así pude realizar un Rx al momento de comparar dichos compuestos. Al
momento de realizar la segunda prueba de cromatografía podemos ver mejor los
resultados. Aquí anexados

Se obtendrá o se Querrá llegar a esta separación

 INTRODUCCION
Objetivo

1.- Extraerá el pigmento del producto natural asignado por el profesor haciendo
uso de la técnica más adecuada.

2.- Separar por medio de las técnicas de cromatografía en capa fina y en columna
los pigmentos vegetales

Comentarios

Es una práctica muy estricta y detallada, desde la preparación necesito de varias

cosas tales como frascos, reactivos y un amplio conocimiento teórico para las
distintas maneras de cromatografía y comprar material para las placas tanto
como porta objetos, Silica gel entre otros. Siguiendo la técnica adecuada podemos
llevar a cabo una separación exitosa teniendo en cuenta los factores que en ella
pudieran estar. Para efectos demostrativos es un experimento perfecto para
entender la separación por medio de la decantación que análogamente podemos
aprender a realizar más cosas a nivel industrial.

Fundamentos Teóricos (Fundamento de la Cromatografía)

Un rasgo característico de la cromatografía es la presencia de dos fases;

dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del
sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de él (fase móvil). La
clave de la separación en cromatografía es que la velocidad con la que se mueve
cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de
distribución). En el experimento de Tswett, la separación de los pigmentos
vegetales se logró gracias a que cada uno de ellos tenía una afinidad diferente por
las fases. En general, los componentes más afines a la fase estacionaria avanzan
lentamente (más retenidos) mientras que los más afines a la fase móvil (menos
retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio
cromatográfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la
velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando así su separación
y mediante el uso de un detector, su caracterización química. Aunque los
principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los métodos
cromatográfico según el estado físico de la fase móvil: Cromatografía líquida. La
fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un
sólido que interactúa con las sustancias que se desea separar (cromatografía
líquido-sólido), o bien un líquido inmiscible con la fase móvil, depositado en la
superficie de un sólido (cromatografía líquido-líquido). Esta forma de cromatografía
puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en columna, en capa
delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra
rellenando un tubo; en el segundo, se dispersa sobre una lámina de vidrio o
aluminio formando un lecho de espesor uniforme; en la cromatografía en papel, la
fase estacionaria es la solución acuosa contenida en el interior de las celdas
formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografía
líquido-líquido Cromatografía de gases. En este caso la fase móvil es un gas inerte
(helio o nitrógeno) y la fase estacionaria es un sólido (cromatografía gas-sólido) o
un líquido “sostenido” por un sólido inerte (cromatografía gas-líquido). Este tipo de
cromatografía siempre es en columna, ya que es la única manera de que la fase
móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna
puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la
cromatografía líquida, o bien la fase estacionaria puede depositarse sobre las
paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de diámetro) y largo (hasta 100m). Este
tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor
capacidad de separación. De acuerdo con el mecanismo de retención, la
cromatografía se puede clasificar en los siguientes tipos:

 adsorción (normal, de fase reversa)

 partición líquido-líquido

 intercambio iónico

 permeación sobre gel

 de afinidad

Hipótesis

Al llevar un sistema de orden muy estricto es porque con el paso del tiempo se ha
dado un orden para llevar una estructura que una cosa lleva a la otra y poder
razonar el porqué de cada tipo de cromatografía. Al poder reconocer cada parte de
la espinaca por los disolventes podemos ver cómo está compuesto la espinaca de
tal forma se aprecia la separación en las capas Finas,
Lista de Material Para la maceración Reactivos

 Mortero con pistilo Acetato de Etilo

 Embudo de Decantación (500 ml) Hexano
 Soporte Universal
 Anillo de Hierro
 Frasco de Vidrio
 Espinaca

Material para Capa Fina Reactivos

 10 Frascos Gel de Silice para capa fina

 Porta Objetos (Varios) Éter de petróleo
 Papel Aluminio Hexano
 Papel Filtro Tolueno
 Pipeta Graduada Benceno
 Capilares Cloroformo
Cloruro de etileno
Acetato de etilo
Acetona
Etanol
Metanol
Material para Columna Reactivos

 Bureta Sal
 Matraz Erlenmeyer Hexano
 Algodón Acetato de etilo
 Vidrio de Reloj Gel de Silice para columna
 Matraz de Bola
 Embudo
 Espátula
 Varilla
 Pipeta
 Gradilla
 Tubos de ensayo
 Técnica

1. Pesar 20gramos de espinaca ya limpia y seca.

2. Empezar a macerar la espinaca sin ningún disolvente.
3. Agregar 50mL de acetato de etilo al mortero.
4. Filtramos el extracto (acetato de etilo y espinaca) y lo vertimos en el embudo de
decantación.
5. Mezclarlo de forma que al terminar se pueda distinguir el extracto.
6. Volver a hacerlo ahora con dos lavados de 30mL de Hexano.

Al extracto ya recuperado se le agregará sulfato de sodio el cual servirá como desecante, pero
este se dejará reposar por unos días asegurándose que donde se coloca este cubierto por papel
aluminio

Pesar 20 g de Espinaca Comenzar la maceración (Agregando

Disolventes)

Vaciar el contenido en un embudo de Decantación. Lavar

con Hexano para que haya fases

Esquema
 Resultados
Se Procedió a realizar Cromatografía en Capa Fina Para fines demostrativos
pasaremos a llamar al A (La primera Prueba añadieron solo un Disolvente) el
conjunto B (Cuando ya se hizo una Mezcla de Disolventes) y C Hay conjunto de
Rx (O sea un comparativo del original contra la columna)

A) Lo que se buscaba en esta ronda era averiguar que dependiendo de su

polaridad había disolventes que hacía que existiera una fase móvil y una
estacionaria con esto encontraríamos los Disolventes que mejor nos
conviene mezclar. Para que el pigmento quedara en medio de la placa.

B) Basado en la ronda anterior se concluyó que la mezcla seria Acetato de

Etilo más Hexano de esta forma podríamos hacer que los puntos se
quedaran en medio y se empezará a ver la separación de mejor manera.
Ahora tendríamos que ver en que proporciones se haría. Después de la
ronda averiguamos que donde se obtuvo una mejor separación fue en la
Placa G (6 +4) o sea 3.6 mil Hexano más 2.4 Acet. De Etilo (Se procede a
realizar Columna) Nota: En la placa se puede apreciar un segmento Gris
eso es la Putrefacción que sufre la espinaca después de un tiempo.
C) Preparado la solución en 100 ml y procedimos a realizar Cromatografía en
columna para hacer un Rx adecuado
 Cuestionario de Cromatografía
¿A qué grupo compuestos pertenecen los pigmentos?

R: Carotenoide y Xantofilias

¿A qué se debe que estos compuestos sean coloridos?

R: Carotenoide= Son los responsables de la gran mayoría de los colores

amarillos, anaranjados y rojos presentes en los alimentos vegetales. Entre mayor
sea la intensidad de color, por consecuente será mayor los carotenoides

Xantofilias = Compuestos químicos pertenecientes al grupo de los carotenoides

que poseen uno o más átomos de oxígeno en su estructura. Se encuentran de
forma natural en muchas plantas y presentan también acción fotosintética. Estos
pigmentos más resistentes a la oxidación que las clorofilas, proporcionan sus
tonos amarillentos y parduzcos a las hojas secas.

Diferencia entre Cromatografía de absorción y partición

Partición: La mayoría de las sustancias tendrán distinta solubilidad en diferentes

solventes. Si una sustancia se pone en contacto con dos solventes que no se
mezclan entre sí; se distribuirá entre los dos solventes en relación a su solubilidad
en cada uno. Se llama efecto de partición a la distribución de un soluto entre dos o
más solventes que no se mezclan. El solvente o el líquido que es atrapado por el
medio del sostén sea este papel, gel, Silice o alúmina; Se llama fase estacionara.
Al solvente revelador se le llama fase móvil.

Adsorción: (Liquido- Solido) forma clásica de cromatografía de líquidos. La

Adsorción se lleva a cabo cuando hay una concentración más alta en la superficie
de un sólido que en la solución circundante. La adsorción se refiere al enlace de
una sustancia a la superficie de otra. Generalmente los adsorbentes usados en
cromatografía son el carbón mineral, el gel de Silice y la alúmina.

¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la cromatografía en capa fina en

comparación con la cromatografía en columna?

R: Columna = Las separaciones en columna pueden realizarse por reparto,

adsorción o intercambio Iónico. El estado físico del absorbente hs de ser de tal
manera que permita el empacamiento uniforme de la columna y el flujo libre de
disolvente a través de ella.

Capa Fina = En todos los casos se emplea una capa plana y relativamente
delgada de una materia que a la vez es el soporte o bien que recubre o una
superficie de vidrio, plástico o metálica.

La fase móvil se mueve a través de la fase estacionara por capilaridad, a

veces ayudada por gravedad o por aplicación de un potencial eléctrico

Explique la diferencia que existe entre el adsorbente utilizado en

cromatografía en capa delgada y el de columna. Hacer una lista en orden
creciente de actividad.

En columna

Puede usarse cualquier medio adsorbente siendo los más generales la celulosa,
gel de Silice, alúmina, oxido de magnesio, oxido de calcio y carbón Activado (Para
separaciones por adsorción e intercambio Iónico) Se emplea para la separación de
mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa. Como fase
estacionaria se usa generalmente gel de Silice o alúmina dentro de una columna .
La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente
pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicación de
presión (Cromatografía Flash) La columna se prepara mezclando el soporte con
disolvente.

Capa Delgada

 Silica Gel se utiliza el 80% por ciento de las separaciones.

 Oxido de Alumino o Alumine
 Celulosa
 Poliamidas
Hacer una lista de los eluyentes usado o comúnmente en columna y capa
delgada.

 Éter de Petróleo Cloruro de Metilo

 Hexano Acetato de etilo
 Tolueno Acetona
 Benceno Etanol
 Cloroformo Metanol

Que compuesto es más retenido una amina o un alqueno, ejemplifique en

una capa cromatografía

Un Alqueno; por su polaridad

Como se prepara el capilar para aplicar la muestra en la cromatoplaca

Procedemos a ponerlo en una fuente de calor, de esta forma podemos separar el
capilar de tal forma que vamos haciendo que su grosor se redujo a un orificio muy
pequeño para un buen punteado.

Porque es necesario que la cámara de elusión este saturada con los vapores
diluyentes

Se hace por comodidad ya que de esta forma facilitamos el arrastre del pigmento
en cuestión al mismo tiempo de no permitir que se seque la placa.

Explique cada uno de los siguientes términos

Eluyente: Solvente que se usa en técnicas de cromatografía para extraer un
compuesto que se quiere separar de otra fase.

Elución fraccionada: Aparato de elución fraccionada electroforético tiene una

columna con una rotación conjunta de sello en el que un delgado chorro de elución
búfer es dirigido a través de la luz de la columna electroforética en una dirección
perpendicular a la de migración electroforética. El contenido de la columna se gira
en relación con el jet estacionario o se gira en el jet con respecto a la columna. El
sistema puede emplear electroforesis en solución libre o en columnas
empaquetadas.
Eluato: La sustancia que se separa o sale de la columna después de cada
extracción.

Adsorción: Es un proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapados

o retenidos en la superficie de otra sustancia o material.

Partición: La separación se basa en las diferencias de solubilidad de los

componentes de la mezclas en las fases estacionarias y móvil.

Elución: Se produce por el flujo de una fase móvil a través de la fase

estacionaria.

Adsorbente: Es un sólido que tiene la capacidad de retener sobre su superficie

un componente presente en corrientes liquidas o gaseosas. Se caracteriza por una
alta superficie específica y por si inercia química frente al medio en el que se va a
utilizar.

Actividad del adsorbente: El nivel de actividad de la adsorción depende de la

concentración de la sustancia en la solución, la temperatura y la polaridad de la
sustancia.

Afinidad por el adsorbente: Es que la sustancia ceda a la capacidad de

capilaridad del adsorbente y eluya a través de el.

Como se Clasifica la cromatografía en función de su fase estacionaria

Naturaleza de la fase Clasificación
Estacionaria
Naturaleza de la fase Liquido  Liq-Liq: Partición
 Liq-Sol: Adsorción, Cambio
 Iónico: Exclusión, Afinidad
Móvil Gas  Gas-Liquido (CGL)
 Gas-Solido (CGS)

Cuál es la función de la fase móvil y como se lleva a cabo la separación en la

cromatografía de adsorción
Su función es eluir los componentes de la mezcla a separar a través de la fase
estacionara. La cromatografía de adsorción se lleva a cabo mediante el uso de
una fase estacionaria donde se observara la elución de los componentes de la
mezcla, los cuales serán eluidos por el disolvente; que es la fase móvil.

Como se prepara la papilla para la cromatografía en capa fina (Al menos dos
métodos)

1. Machacar con ayuda de un mortero y pistilo hasta hacer polvo la Silica.

Luego añadir el disolvente
2. Usar un envase o vaso de precipitado y con una varilla de vidrio agitar
constátenme hasta formar la papilla.

Cuando es conveniente activar una placa y como se activa

Antes de que se puedan usar las placas generalmente deben ser calentadas
para retirar el agua que actúa como una impureza y evita una buena
separación. La magnitud de calor depende del tipo de separación que se
requiere para compuestos hidrófilos o polares, el secado al aire o con un
secador de pelo son generalmente suficiente; para los compuestos
hidrofobicos o no polares es necesario un calentamiento más intenso. Las
placas de óxido de aluminio y de gel de Silice con adhesivo requieren ser
secadas al aire durante aproximadamente 30 min. Después ser activadas en
un horno a 100 °C alrededor de 30 min. Las placas de celulosa deberán
secarse al aire libre durante 30 min y activarse al horno durante 10 min a
105°C.

Que espesor debe tener la fase estacionaria en una C.C.D

No debe ser espesa ni muy aguada, debe deslizarse solo por la placa al
momento de prepararla.

Al comparar los Rx de dos componentes se encontró que eran iguales

¿Podría pensarse que se trata del mismo compuesto? Explique
brevemente

Si, esto se concluye debido a que si ambos componentes eluyen de la misma

manera significa que tiene una polaridad muy semejante por lo tanto podría
inferirse que se trata del mismo componente

Explicar brevemente si existe una relación entre la cantidad de

adsorbente y las dimensiones de la columna para una mezcla
Entre más grande sea una columna, mas adsorbente se necesitara, esto para
observar mejor la separación de los componentes: además de necesitar más
disolvente para continuar la elución y evitar la sequedad del sistema.

¿Cómo debe de ser la polaridad del Eluyente al empacar una columna?

La polaridad del Eluyente debe ser mayor

Con relación al 𝑹𝒙 : ¿Cuándo se usa el 𝑹𝒙 en cromatografía en capa

delgada?

Cuando no se cuenta con un compuesto con polaridad conocida, y por lo tanto

elusión conocida, que se pueda usar como referencia en la C.C.D.

¿Qué significa la obtención de 𝑹𝒙 igual a uno?

Que el compuesto y el Eluyente tienen la misma polaridad, incluso hasta mayor

la de este último.

¿Cuál es el orden de polaridad en que salen los compuestos de una

cromatografía en columna?

En la cromatografía de columna las moléculas de una mezcla son separadas e

n base a la afinidad de las moléculas por la fase estacionaria o por la fase móvi
l. Si una molécula A tiene más afinidad por la fase estacionaria que la B, B
bajará más rápido que A.

 Éter de petróleo

 Hexano

 Tolueno

 Benceno

 Cloroformo

 Cloruro de metilo

 Acetato de etilo

 Acetona

 Etanol
 Metanol

¿A qué se le llama frente del eluyente en cromatografía en capa delgada?

Demuéstrelo en una placa.

Es la línea donde acaba la elusión, si se rebasa dicha línea se corre el riesgo d

e que los componentes separados se esparzan a lo largo de la parte posterior
de la placa.

¿Cómo se controla la salida de los componentes en una cromatografía en

columna?

Se controla con la llave de la bureta, se va colocando los distintos pigmentos

en tubos de ensayo, a los que se les denominará como fracciones.

¿Por qué no debe dejarse secar la columna cromatografía? En caso de qu

e se fracture

¿Qué se recomienda hacer?

Porque de no ser así la fase estacionaria se contraería y agrietaría. Se debe

Rehidratar con más Eluyente si esto ocurre.

¿Por qué es importante que las muestras a separar por cromatografía deb
an estar lo

¿Más secas posible?

Para que no interfiera el agua con la elución, por medio del disolvente, de los

Componentes de la muestra.

¿Por qué al cargar una columna se recomienda que la muestra lleve la

mínima cantidad de disolvente?

Las cantidades altas de flujo dan malas separaciones, el promedio es de 3 a

4mL/min. En una columna de 40 cm de altura aprox.

¿Qué pH presenta la alúmina? Mencione los tres casos.

Presenta tres pH: alúmina ácida pH de 4.5, alúmina básica pH de 10.0 y

alúmina neutra pH de 8.0.
¿Por qué cuando se usa alúmina como adsorbente no se recomienda
usar acetona como Eluyente?

Porque se desnaturaliza y queda pegada en las paredes de la columna.

¿Cuáles son los pasos a seguir para la preparación de una placa

preparativa?

Las separaciones en capa fina características se realizan en placas de vidrio o

Plástico que se recubren con una capa delgada y adherente de partículas fina
mente divididas, esta capa constituye Ia fase estacionaria. Las partículas son s
emejantes a Ias de Ia cromatografía en columna. Las capas finas preparadas
sobre vidrio se denominan cromatoplaca o placas simplemente.

¿Cuál es la aplicación de la cromatografía en placa preparativa?

La elección de un Eluyente ideal para cromatografía en columna.

¿Qué diferencia existe entre cromatografía en capa delgada analítica y cr

omatografía?

¿En placa preparativa?

La preparativa se emplea generalmente para elegir un eluyente o mezcla de

Eluyentes ideal para cromatografía en columna. La analítica ya cuenta con un

eluyente ideal y registra 𝑅𝑥 es decir, se analiza la elusión de los componentes
para arrojar un valor numérico final.

¿Cómo se clasifican los reveladores en forma general?

Químicos y físicos.

¿Cuándo una sustancia orgánica no se revela con 𝑰𝟐 o luz UV, ¿qué otros
reveladores pueden usarse para observar la sustancia?

Con reveladores químicos específicos para los componentes separados.

 Universidad Nacional
Autónoma de México

Facultad De Estudios Superiores

Zaragoza

Santiago García Ricardo Asunción

Cromatografía (Columna y Capa fina)

Q. Ma. Estela Jiménez Encarnación

3303

23/10/19