Manual Lab Bioquimica 1 Prim 2020 BIOTEC OK

Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Vicerrectoría de Docencia
Dirección General de Educación Superior
Faculta de Ciencias Biológicas
Licenciatura en Biotecnología
111Equation Chapter 1 Section 1
PLAN DE ESTUDIOS (PE): Licenciatura en Biotecnología
ÁREA: Ciencias Biológicas
ASIGNATURA: Laboratorio de Bioquímica I
CÓDIGO: LBTS
CRÉDITOS: 4
FECHA DE ACTUALIZACIÓN: Julio de 2019
Laboratorio de Bioquímica I
1. DATOS GENERALES
Nivel Educativo: Licenciatura
Nombre del Plan de Estudios: Licenciatura en Biotecnología
Modalidad Académica: Presencial
Nombre de la Asignatura: Laboratorio de Bioquímica I
Ubicación: Básico
3. REVISIONES Y ACTUALIZACIONES
D.C. Mena Contla Armando
D.C. Pérez Xochipa Ivonne
Autores: D.C. Morales Lara Laura
D.C. Cabrera Hilerio Sandra Luz
D.C. Rosas Murrieta Nora Hilda
Fecha de diseño:
Fecha de la última actualización: Julio de 2019
Fecha de aprobación por parte de
la academia de área, departamento
u otro.
D.C. Mena Contla Armando
D.C. Pérez Xochipa Ivonne
Revisores:
D.C. Morales Lara Laura
D.C. Rosas Murrieta Nora Hilda
4. PERFIL DESEABLE DEL PROFESOR (A) PARA IMPARTIR LA ASIGNATURA:

Disciplina profesional: Licenciatura en Químicofarmacobiólogo y/o áreas afines
Nivel académico: Maestría o Doctorado en áreas afines.
Experiencia docente: Mínima de 2 años 1
Experiencia profesional: Mínima de 2 años
OBJETIVOS:
a. General:
 El estudiante aplica los conocimientos adquiridos en la asignatura de Bioquímica I, al
identificar químicamente a las moléculas presentes en los organismos vivos, relacionando
sus estructuras con sus propiedades químicas y las funciones biológicas que
desempeñan en la célula, y los diversos factores que pueden alterar su estructura y
propiedades. Estos fundamentos permitirán estudiar en cursos posteriores diferentes vías
metabólicas que realizan los organismos vivos.
b. Específicos:
 Explicar la relación de la estructura química-función biológica de las biomoléculas
como son aminoácidos, péptidos, proteínas, enzimas, carbohidratos, lípidos y
ácidos nucleicos presentes en los seres vivos, mediante la identificación de sus
propiedades físico-químicas las cuales son analizadas para demostrar su
presencia, actividad, realizar su aislamiento, analizando sus funciones en los
organismos y sus posibles aplicaciones biotecnológicas.
 Identifica y analiza el papel de diversos factores físicos y químicos como pH,
carga eléctrica, temperatura, constante dieléctrica de los solventes, cambio de
solventes, que influyen positiva o negativamente en las propiedades biológicas de
diversas biomoléculas producidas por los organismos.
NORMAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
 La asistencia al laboratorio es del 100 %, con una tolerancia de llegada de 5 minutos, en

caso de faltar, deberá ser justificada y repuesta en otro día acordado con el profesor.
 La calificación final que se obtenga es equivalente al 20% de la calificación final en la
teoría.
 El estudiante se informará de donde están los elementos de seguridad del laboratorio
(extintores, alarmas, salidas, lavaojos, etc.)
 Usar siempre bata y lentes de protección.
 Eliminar de la zona de trabajo los artículos personales.
 No ingerir bebidas ni alimentos en el laboratorio.
 Reportar cualquier defecto en el material provisto.
 El área de trabajo deberá quedar perfectamente limpia, así como lavabos en los cuales
no se tirarán desechos sólidos.
 En caso de cualquier accidente por leve que sea avisar de inmediato a su profesor.
 Antes de iniciar el experimento verificar el desarrollo metodológico, así como
fundamentos y fichas de seguridad, atendiendo a estas recomendaciones exclusivamente
emplear material y reactivos de acuerdo a las mismas, así como las indicaciones
señaladas por el profesor.
 Deberá leer siempre la etiqueta de cualquier reactivo antes de usarlo y observar los
símbolos y frases de seguridad que señalan los riesgos más importantes derivados de su
uso y las precauciones que hay que adoptar para su utilización.
 Verificar con el profesor todo el desarrollo de la práctica y atender a las indicaciones de
trabajo, especial atención a solventes y reacciones potencialmente peligrosas, cuyo
empleo o realización requieren uso de la campana de extracción.
 Nunca verter agua sobre un ácido. Siempre agregar lentamente el ácido sobre el agua.
 Si se desprenden vapores durante un experimento, realizarlo bajo la campana de
extracción
 Los desechos de las reacciones deberán verterse en los contenedores correspondientes.
 Al emplear equipo, deberá seguir las indicaciones de uso señaladas por el profesor y
anotarse en la bitácora de uso que está al lado del equipo.
 Al terminar la práctica entregar el material perfectamente limpio (lavado con agua y jabón)
y seco al personal encargado del área de almacén, y los reactivos deberán ser
guardados.
 El material regresado al área de almacén deberá encontrarse en las mismas condiciones
que se entregó, de presentar algún daño, el estudiante deberá reponerlo lo antes posible.
 Las áreas de trabajo (mesas y campanas) deberán quedar limpias y secas.
PRÁCTICA 1
DETECCIÓN CUALITATIVA DE AMINOÁCIDOS
INTRODUCCIÓN:
En esta práctica se realizará la detección de la presencia de aminoácidos

mediante tres técnicas.
A) Detección cualitativa empleando la reacción de Sakaguchi.
Mediante esta reacción es posible detectar la presencia de grupos guanidinos en la
muestra. En un medio alcalino, el grupo guanidino de la arginina reacciona con el alfa-
naftol y el hipoclorito de sodio, y produce un compuesto de color rojo.
OBJETIVOS:
1. Realizar la determinación cualitativa de arginina, histidina y tirosina, con base a
diferentes características de sus grupos radicales.
MATERIAL:
Tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas de 1 ml
Goteros
REACTIVOS:
Aminoácidos: Soluciones de arginina 0.1 M y de histidina y tirosina al 1% en agua
destilada.
Proteína: Solución de ovoalbúmina o clara de huevo al 10 % en solución salina .
Solución de hidróxido de sodio 2 N.
Solución de alfa-naftol al 1% en alcohol de 95 o.
Solución de hipoclorito de sodio al 1 % en agua destilada. 1
DESARROLLO:
1. Vierta 0.5 ml de una solución de arginina en un tubo de ensayo.
2. Agregue 5 gotas de solución de hidróxido de sodio 2N, 5 gotas de a-naftol y 3 gotas
de hipoclorito de sodio.
3. Mezcle bien.
4. Observe el cambio de color.
5. Anote los resultados en la columna correspondiente del cuadro.
6. Repita el procedimiento con las soluciones de histidina, ovoalbúmina y tirosina.
B) Reacción diazo de Ehrlich

Mediante esta reacción se detecta la presencia de grupos imidazol o fenoles en la
muestra. Los fenoles y el grupo imidazol (característico de la histidina) reacciona con el
ácido diazobencenosulfónico (diazida del ácido sulfanílico) y forman productos de
sustitución, que se tornan de color rojo al alcalinizar el medio.
MATERIAL:
Tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas de 2 ml
REACTIVOS:
Aminoácidos: Soluciones en agua destilada de arginina 0.1M, y de histidina y tirosina al
1%.
Proteína: solución de ovoalbúmina o clara de huevo al 10% en solución salina.
Solución de ácido sulfanílico al 0.5% en ácido clorhídrico al 2%.
Solución de nitrito de sodio al 0.5% (recién preparada).
Solución de carbonato de sodio al 10%. 1
DESARROLLO:
1. Vierta 1 ml de solución de nitrito de sodio en un tubo de ensayo y agregue 1 ml de la
solución de ácido sulfanílico.
2. Mezcle bien.
3. Deje en reposo por un minuto.
4. Agregue 1 ml de la solución de histidina.
5. Mezcle bien.
6. Agregue 5 gotas de carbonato de sodio para alcalinizar el medio.
8. Repita el procedimiento con las soluciones de arginina, tirosina y ovoalbúmina.
Indique en el siguiente cuadro si las pruebas realizadas a cada aminoácido son positivas
o no lo son.
DETECCIÓN CUALITATIVA DE AMINOÁCIDOS

Aminoácido Reacción de Reacción diazo
Sakaguchi de Ehrlich
Arginina
Histidina
Tirosina
Ovoalbúmina
CUESTIONARIO:
1. Defina los siguientes términos: aminoácido, péptido, carbono a y aminoácido esencial.
2. Escriba las estructuras de los aminoácidos arginina, histidina y tirosina. Señale en
ellas el grupo imidazol y el benceno sustituido, respectivamente.
3. Explique el fundamento de cada reacción.
4. ¿Qué sucede si se agrega un ácido fuerte a una solución de proteínas? Explique.
PRÁCTICA 2
TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS
INTRODUCCIÓN
En esta práctica se estudia, por medio de cambios en valores de pH, el

comportamiento de soluciones de aminoácidos frente a cambios en la concentración de
equivalentes básicos (grupos OH en este caso). Se utiliza un aminoácido básico (la
lisina), uno neutro (la glicina) y uno ácido (el ácido glutámico).
OBJETIVOS
1. Preparar una curva de titulación para un aminoácido.
2. Determinar los valores de pK y el punto isoeléctrico para un aminoácido neutro,
uno ácido y uno básico.
REACTIVOS
 Aminoácidos: soluciones al 1% de lisina, glicina y ácido glutámico.
 Solución de hidróxido de sodio 0,1 N
MATERIAL
 Pipetas de 2 mL y 20 mL
 Pera para pipetear
 Vaso de precipitados de 50 mL
 pHmetro
DESARROLLO
1. Pipetee 20 mL de la solución de glicina al 1% (con un pH de 1,3) y viértalos en un
vaso de precipitados de 50 mL.
2. Agregue el hidróxido de sodio 0,1 N en cantidades de 1,0 mL. Después de cada
adición, agite la solución, mida el pH y anote el volumen consumido de la base.
3. Continúe la titulación hasta que el pH sea 12.
5. Realice este mismo procedimiento con los aminoácidos lisina y ácido glutámico.
RESULTADOS
1. En el siguiente cuadro, indique los valores de pH medidos al adicionar solución de
hidróxido de sodio a cada aminoácido.
Cuadro 1. TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS
Volumen de pH pH pH
NaOH Glicina Lisina Ácido
(mL) glutámico
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
14.0
15.0
16.0
17.0
18.0
19.0
20.0
2. Construya la curva de titulación de cada aminoácido, pH vs. VNaOH (en mL), e

indique en ella los valores de las pK y el punto isoeléctrico.
3. En el siguiente cuadro indique, para cada aminoácido, los valores determinados
en este experimento de las pK y del punto isoeléctrico, así como los reportados en
la literatura.
Cuadro 2.1 EXACTITUD DE LA DETERMINACIÓN DE LOS VALORES DE pK DE LOS AMINOÁCIDOS
pK1 pK2 pKR

Aminoácido
Reportad
Obtenida Obtenida Reportada Obtenida Reportada
a
Glicina
Lisina
Ácido
glutámico
1
Cuadro 2.2 EXACTITUD DE LA DETERMINACIÓN DE LOS VALORES DEL PUNTO ISOELÉCTRICO
DE LOS AMINOÁCIDOS
Punto isoeléctrico
Aminoácido
Reportad
Obtenida
a
Glicina
Lisina
Ácido
glutámico
CUESTIONARIO
1. Defina los siguientes términos: aminoácido básico, pH, pK, titulación, punto
isoeléctrico, capacidad amortiguadora.
2. En los aminoácidos, ¿por qué a valores de pH cercanos al valor de pK se
presenta su mayor capacidad amortiguadora?
3. En los aminoácidos, ¿por qué a valores de pH cercanos al punto isoeléctrico se
presenta su menor capacidad amortiguadora?
4. A partir de la molécula del aminoácido lisina a un pH de 1, indique los cambios
estructurales y de carga neta que ocurren durante su titulación (pK 1 = 2,2; pK2 =
9,0; pKR = 10,0).
PRÁCTICA 3
CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS
INTRODUCCIÓN
Varios factores son importantes en la separación de sustancias por cromatografía en papel;

entre ellos hay que citar la partición, una combinación de partición y adsorción y en algunos
casos el intercambio iónico.
El factor predominante en la separación de solutos por cromatografía en papel es la

partición entre dos fases no miscibles (Coeficiente de reparto); fase estacionaria (Agua) y fase
móvil (Solventes orgánicos).
El soluto se mueve en la dirección del flujo del solvente a una velocidad determinada por la
atracción que ejerzan sobre él las fases del sistema, a esto se le denomina Rf.
Los principales factores que afectan al Rf de los aminoácidos son el pH, tipo de papel y
temperatura. Es conveniente analizar al mismo tiempo y en el mismo papel soluciones estándar y
desconocidas.
OBJETIVOS:
1. Realizar una cromatografía ascendente de aminoácidos.

1. Separar una mezcla de aminoácidos.
MATERIAL:
 Cámara cromatográfica
 Papel para cromatografía (16 cm largo X 18 cm ancho)
 Estufa 90 0 C
 Capilares
LOS ALUMNOS DEBERÁN TRAER:
 Lápiz
 Reglas
REACTIVOS:
 Aminoácidos en solución 0.05 M

 HIDROLIZADO DE CASEÍNA
1
 Solvente: n - Butanol: Ácido acético glacial: Agua
4 : 1 : 5
 Revelador: Solución de Ninhidrina
 Hidróxido de amonio concentrado
DESARROLLO
1. Cuidando de tocar SOLO en la esquina superior, marque una línea horizontal a 2 cm

del borde inferior a todo lo ancho de la hoja de cromatografía (Origen)
1. Sobre el origen marque respecto de la orilla las siguientes medidas: 3.5 , 7.5 , 11.5 y
15.5 cm respectivamente.
2. En estos puntos escriba el nombre del aminoácido que corresponda y la palabra
HIDROLIZADO.
3. Coloque en la cámara el solvente (aproximadamente 20 ml) tápela para que se sature.
4. Aplique con los capilares sobre el punto que marcó en el origen el aminoácido que
corresponda, para la mezcla deberá colocar una gota de cada aminoácido procurando
que seque entre cada aplicación.
5. Una vez secas todas las muestras pase el papel sobre el bocal de una botella de
hidróxido de amonio concentrado para neutralizar los aminoácidos.
6. Tomando las esquinas del borde superior únalas (Formando un rollo) e introdúzcalo a
la cámara, cierre.
7. Espere que corra el solvente y saque el papel cuando el solvente esté
aproximadamente a un cm. del borde de la cámara.
8. Seque por aereación el papel y rocíe el revelador, espere que seque un poco e
introdúzcalo a la estufa hasta aparición de color.
CUESTIONARIO
1. Defina los siguientes términos: aminoácido, péptido y carbono a.

2. Investiga el valor del índice de hidrofobicidad para los aminoácidos (Escala Kyte-
Doolittle).
3. Escribe la clasificación de los aminoácidos por su polaridad.
4. Escriba las estructuras de los aminoácidos que empleaste en estado neutro,
señalando la carga eléctrica en cada caso.
5. Explica la reacción de la ninhidrina con uno de los aminoácidos analizados.
PRÁCTICA 4
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET Y DE BRADFROD
INTRODUCCIÓN
Las investigaciones realizadas acerca de las propiedades y funciones de las proteínas,
mediante el empleo de técnicas químicas y físicas ha contribuido a la mejor comprensión
sobre las bases moleculares de la vida. Uno de los procedimientos iniciales requeridos
en el estudio de proteínas es su purificación, la proteína a purificar puede ser
extremamente inestable ó encontrarse en concentraciones muy bajas.
En la práctica bioquímica se requiere la rápida medida de pequeñas cantidades de

proteína. En la literatura se encuentran diversos métodos que permiten cuantificar la
concentración de proteína presente en las muestras biológicas, basados en las
propiedades que muestran las proteínas en solución. Entre los métodos más usuales se
encuentran: Método de Biuret, método de Lowry, método de Bradford, método del ácido
bicincónico, absorción en el ultravioleta.
En la práctica se van a ensayar dos métodos de diferente sensibilidad, el método

colorimétrico de Bradford y el método de Biuret, empleados con frecuencia en la
cuantificación de proteínas.
Método de Biuret
La reacción de biuret es un método general para la determinación de proteínas o
péptidos. La presencia de dos ó más enlaces peptídicos pueden reaccionar con sulfato
de cobre en medio alcalino, formando un complejo de color púrpura con registros de
absorbancia a 540 nm, cuya intensidad de color depende de la cantidad de enlaces
peptídicos presentes. El color es causado por el complejo de coordinación formado entre
el átomo de cobre y cuatro átomos de nitrógeno, dos de cada enlace peptídico. La
cantidad de producto formado (complejo de cobre) genera una intensidad de color que
está determinada por la concentración de proteína. Se basa en la reacción del sulfato de
cobre con compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos, en un medio alcalino.
1
Complejo proteína-Cu(II) Violeta-púrpura
El método de Biuret tiene varias ventajas incluyendo la reproducibilidad, la velocidad, el

similar color desarrollado con distintas proteínas y las pocas sustancias interferentes que
existen. La principal desventaja de este método es su sensibilidad, ya que requiere
concentraciones de proteína relativamente altas (alrededor de 1 a 20 mg/mL) para la
formación del color.
Método de Bradford
Este es un método alternativo para la cuantificación de proteínas en solución, en donde
se emplea un colorante hidrofóbico (cromógeno azul brillante de Coomasie) cuyas
disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo que al
encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul
intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende de la interacción
relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es
relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente
y líquidos orgánicos como el metanol. Su principal ventaja es que resulta más rápido y
fácil de emplear que otros métodos alternativos y su sensibilidad. Para determinar la
concentración de proteína total presente en una muestra se requiere la preparación de
una curva de calibrado empleando una proteína patrón, que generalmente suele ser la
seroalbúmina bovina.
El complejo formado entre el cromógeno (azul brillante de Coomasie) y una solución
ácida de proteína causa un cambio en la longitud de onda máxima (λmax) desde 465 nm
a 595 nm. La absorción a 595 nm está directamente relacionada en forma lineal con la
concentración de proteína. En la práctica, una curva de calibración es preparada
utilizando una proteína estándar como albúmina sérica de bovino (BSA).
OBJETIVO:
 Cuantificar proteínas y comparar la sensibilidad de dos métodos.
A) DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR LA REACCIÓN DE BIURET
REACTIVOS
 Soluciones de proteínas: clara de huevo al 10% en solución salina, la disolución
patrón de albúmina de suero bovino (BSA) 1 mg/mL.
 Reactivo de biuret.
MATERIAL
 Tubos de ensayo
 Gradilla para tubos de ensayo
 Pipetas de 5mL
1
 Micropipetas de 1 ml y 200 mL
 1 vaso de precipitado
DESARROLLO
1. Se enciende el espectrofotómetro y se ajusta la longitud de onda del
espectrofotómetro a 540 nm.
2. Se colocan en una gradilla ocho tubos de ensayo que deben de estar limpios y
secos.
3. Se numeran del 1 al 8 con un rotulador permanente al agua.
4. Con las micropipetas adecuadas al volumen a medir, se adiciona a cada uno de
ellos los volúmenes de la disolución patrón de albúmina de suero bovino (BSA) y de
agua destilada que se indican en la siguiente Tabla:
5. A cada uno de los tubos de ensayo se añaden 2 mL de reactivo de Biuret, se tapa con
papel parafilm y se invierte dos o tres veces para mezclar
6. Se toma la gradilla con los tubos de ensayo y se introduce en el baño de agua a 37 oC,
dejándose que se desarrolle el color durante 15 min.
7. Se enfrían los tubos de ensayo, introduciendo la gradilla en el agua a temperatura
ambiente
8. Se procede a medir en el espectrofotómetro, se ajusta el cero de absorbancia con la
solución blanco exenta de proteína (tubo 1).
9. Se miden las absorbancias de los tubos 2 a 8.
10. Se anotan las medidas de absorbancia en el cuaderno de laboratorio.
11. Se calcula la concentración de proteína que se ha colocado en cada uno de los tubos
de ensayo.
Como ejemplo: en el ensayo de Biuret, en el tubo 2 se han colocado 0,2 mL de BSA 10
mg/mL y se han diluido a un volumen de 2 mL con agua. Por tanto la concentración de
proteína en el tubo será:
(0,2 mL x 10 mg/mL) : 2 mL = 1 mg/mL
12. En papel milimetrado, se representan los valores experimentales de absorbancia
obtenidos frente a la concentración de proteína estándar calculada de cada uno de los
tubos, para cada método ensayado.
13. Se ajustan los puntos obtenidos por el método de mínimos cuadrados a una recta, 1
incluyendo el punto 0,0.
14. Se representan la rectas ajustada en el papel milimetrado.
15. Si la absorbancia de la muestra está dentro del rango de medida del método
seleccionado, mediante la ecuación de la recta de calibrado se puede calcular la
concentración de proteína de la disolución problema.
CUESTIONARIO
1. ¿Por qué la prueba de biuret es negativa para dipéptidos, si estos contienen
enlaces peptídicos?
2. Elaborar la curva estándar
3. Calcular el coeficiente de extinción
4. Escriba la reacción para la formación del péptido fenilglicina.
5. ¿Cuáles proteínas o péptidos están presentes en la clara de huevo y en la leche?
6. Enumerar ventajas e inconvenientes del método.
B) DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR LA REACCIÓN DE BRADFORD
REACTIVOS
Reactivo de Bradford
BSA 1 mg/mL
Solución problema de proteína
MATERIAL
 Tubos de ensayo
 Pipetas de 5mL
 Micropipetas de 1 ml y 200 mL
 1 vaso de precipitado
DESARROLLO
1. Preparar los siguientes tubos a partir de la solución estándar de albúmina sérica de
bovino (BSA) 1 ìg/ìL, según la siguiente tabla:
2. Posteriormente adicionar 3 mL de reactivo cuidadosamente por agitación. Realizar la

lectura en espectrofotómetro 595 nm empleando como blanco el tubo 1.
3. Determinación de la concentración de diferentes extractos proteicos:
Tomar 100 μL de solución problema de proteína y adicionar 3 mL de reactivo de
Bradford, luego proceder de igual forma que con las soluciones de proteína estándar.
Si la absorbancia es muy
alta, entonces se deben realizar diluciones de la muestra. REPETIR
PROCEDIMIENTO 2.
ALTERNATIVAMENTE:
Determinación de albúmina con verde de bromocresol
Esta prueba es específica para la determinación de albúmina. El verde de bromocresol
en medio ácido disocia y su forma aniónica se fija a la albúmina, específicamente, y se
produce un cambio de color, como se representa a continuación:
Albúmina con verde de bromocresol
La intensidad de este color es proporcional a la concentración de albúmina en la

muestra. 1
REACTIVOS
 Solución salina.
 Solución de trabajo de verde de bromocresol (VBC).
 Soluciones de proteínas: solución de plasma humano al 2%, leche descremada al
2%, crema deshidratada al 2% y gelatina al 2%.
MATERIAL
 Tubo de ensayo
 Pipetas de 1 mL y 5 mL
 Pera para pipetear
DESARROLLO
1. Vierta 0,5 mL de la solución de plasma humana en un tubo de ensayo. Repita el
procedimiento, en diferentes tubos, con la solución de leche descremada, la
solución de gelatina y la crema de hongos o de espárragos.
2. Agregue 3 mL de la solución de trabajo de VBC a cada tubo.
3. Observe el cambio de color. Un color celeste indica la presencia de albúmina.
RESULTADOS
1. En el siguiente cuadro, especifique la intensidad de la coloración, que es
proporcional a la concentración de albúmina. Utilice 1, 2 ó 3 cruces: a la mayor
intensidad se le asignan 3 cruces.
Cuadro 2. INTENSIDAD DE LA COLORACIÓN DE LA MUESTRA AL APLICAR LA PRUEBA DEL
VERDE DE BROMOCRESOL
Muestra Presencia de albúmina (coloración)
Plasma humano
Crema de hongos o de espárragos
Gelatina
Leche descremada
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es la finalidad de utilizar ácido succínico en la solución de trabajo del VBC?
2. Mencione y explique los cuatro niveles estructurales (o de organización) de las
proteínas.
3. Investigue cuál es la fuente de proteína para producir gelatina a escala industrial.
PRÁCTICA 5
AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS
INTRODUCCIÓN:
Las caseínas de la leche y las proteínas del suero son los dos grandes grupos de proteínas
de la leche. Se encuentran en forma de suspensión coloidal y existen grandes diferencias entre
sus estructuras y propiedades químicas.
Existen dos sistemas de estabilidad de las proteínas de la leche: En uno de estos sistemas
las proteínas se encuentran en forma coloidal debido a una combinación de los mecanismos de
carga eléctrica e hidratación.
Estas proteínas tienden a precipitar en presencia de iones divalentes como el calcio y son
insolubles en su punto isoeléctrico, ejemplo: Caseína.
En el segundo sistema, las proteínas están en suspensión coloidal estabilizadas por un

mecanismo de hidratación. Estas proteínas son más lábiles a la desnaturalización por calor y no
son tan sensibles a los iones divalentes, se encuentran solubilizadas en su punto isoeléctrico,
ejemplo: Las proteínas del suero.
El método clásico para el fraccionamiento de las proteínas de la leche consiste en una

precipitación de las caseínas en su punto isoeléctrico (pH 4.6) quedando como sobrenadante las
proteínas del suero que pueden separarse por medio de una precipitación selectiva con sales de
sulfato de amonio (precipitación por salado).
OBJETIVOS:
1. Aislar la proteína caseína de la leche.

1. Comprobar el efecto de las sales neutras en las proteínas (precipitación por salado)
2. Comprobar el efecto de la temperatura sobre las proteínas.
MATERIAL:
 1 Matraz Erlenmeyer
 1 agitador
 Papel filtro
 3 Tubos de ensaye
 1Baño María a ebullición
 1 Pipeta
1
 1 Embudo
 2 vasos de precipitado
 1 Baño María a 38 ºC
 1 Matraz aforado de 100 ml
REACTIVOS:
 Ácido acético 2 N  Agua destilada

 Eter etílico  NaOH al 50%
 Alcohol etílico
 Solución saturada de sulfato de
amonio
EL ALUMNO DEBERÁ TRAER:
 125ml de leche descremada (el día anterior a la práctica coloque la leche cruda en el
refrigerador y descreme antes de asistir al laboratorio).
 1 Frascos con tapa con capacidad de 100ml
DESARROLLO:
1. Calentar en un matraz 125ml de leche a 38ºC, sin retirar del baño.

2. Agregar gota a gota y con agitación ácido acético 2 N hasta obtener un máximo de
precipitado coposo (aproximadamente 25 ml)
3. Dejar reposar 15 minutos y filtrar (se obtendrá el precipitado y un sobrenadante, GUARDE
el sobrenadante para pasos posteriores y trabaje con el precipitado).
4. Transfiera a un vaso de precipitado, agregue 20 ml de alcohol etílico, agite y deje reposar
diez minutos.
5. Decante, deseche el sobrenadante.
6. Agregue 10 ml de éter, agite y deje reposar 5 minutos.
7. Filtre y exprima el precipitado en el papel filtro (presione ligeramente contra las paredes del
embudo con ayuda del agitador)
8. REPITA LOS PASOS 6 Y 7 DOS VECES.
9. Después del tercer lavado abra el papel filtro en la campana de extracción y deje evaporar
el éter entre 15 y 20 minutos.(GUARDE SU MUESTRA EN PAPEL ALUMINIO DENTRO
DE UN FRASCO CON TAPA, ROTULE Y GUARDE EN EL REFRIGERADOR HASTA LA
SESIÓN SIGUIENTE).
10. Del sobrenadante obtenido en el paso 3 coloque un ml en el tubo de ensaye y agregue un

ml de solución saturada de sulfato de amonio, observe.
11. En un tubo de ensaye coloque un ml de sobrenadante obtenido en el paso 3 y caliente en 1
el baño María a ebullición, observe.
CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué precipita la caseína y bajo qué condiciones?

1. ¿Cuál es el fundamento de la utilización de éter etílico?
2. ¿Cuál es la explicación física de la precipitación por salado?
3. ¿Cómo afecta la temperatura a las proteínas?
4. ¿Qué tipo de proteínas se afectan por obtienen en el paso 10?
PRÁCTICA 6
PUNTO ISOELÉCTRICO DE PROTEÍNAS
INTRODUCCIÓN:
La conducta de una proteína ante una titulación depende del número y la carga de cada uno de
los grupos ionizables de los aminoácidos que las formen (grupo guanidílico, fenólico, imidazólico,
amino y carboxilo).
El pH al que una proteína muestran un mínimo de solubilidad es su punto isoeléctrico o pH

isoeléctrico, definido como el valor de pH al que una molécula posee carga neta de cero y es incapaz
de desplazarse en un campo eléctrico. En estas condiciones no existe repulsión electrostática ente
moléculas de proteínas vecinas y tienden a coalecer y flocular o precipitar según sea el caso.
OBJETIVOS:
1. Determinar el pI de diferentes proteínas.
1. Observar el efecto del alcohol como agente precipitante.
MATERIAL:
 9 tubos de ensaye
 1 gradilla.
REACTIVOS:
 Caseinato de sodio 0.1 N  NaOH 1.0 N
PREPARADO CON LA CASEÍNA  Acetato de sodio 0.1 N
AISLADA EN LA PRÁCTICA  Alcohol etílico
ANTERIOR  Agua destilada
 Gelatina al 1.0 %
 Ácido acético: 0.01 N, 0.1 N, 1.0 N.
DESARROLLO:
DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA CASEINA.

Preparar 9 tubos como lo indica la tabla siguiente
NÚMERO DE TUBO
REACTIVOS.(ml.) 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Agua destilada 8.38 7.75 8.75 8.5 8 7 5 1 7.4
Ac acético 0.01 N 0.62 1.25 --- --- --- --- --- --- ---
Ac acético 0.1 N --- --- 0.25 0.5 1 2 4 8 ---
Ac acético 1.0 N --- --- --- --- --- --- --- --- 1.6
Agitar los tubos y agregar 1 ml de solución de caseína (Caseinato de sodio 0.1 N). Agitar los 1
tubos inmediatamente. Observar los enturbiamientos que se producen después de agitar, esperar 15
minutos y anotar los resultados marcando con "0" la falta de turbidez, marcar con una "+"· los grados
de turbidez y con una "X" la precipitación. El pH de cada tubo se determina usando la ecuación de
Henderson Hasselbach.
DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA GELATINA

La gelatina y otras proteínas se disuelven por completo en el agua aún en su punto isoeléctrico,
por lo tanto deben añadirse agentes precipitantes como el alcohol etílico para hacerlo de manifiesto.
Preparar 9 tubos como lo indica la tabla siguiente:

NÚMERO DE TUBO
REACTIVOS (ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Acetato de sodio 2 2 2 2 2 2 2 2 2
0.1 N
Ac. Acético 0.1 N 0.12 0.25 0.5 1 2 4 --- --- ---
Ac. Acético 1.0 N --- --- --- --- --- --- 0.8 1.6 3.2
Agua destilada 3.88 3.75 3.5 3 2 --- 3.2 2.4 0.8
Gelatina al 1 % 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Mezclar bien el contenido de los tubos y DESECHAR LA MITAD de cada uno, al tubo No 5
añadir de 5 a 8 ml de alcohol etílico hasta producir una tenue nebulosidad, adicionar a los demás
tubos la misma cantidad de alcohol que la añadida al tubo No. 5. Anote los resultados de la misma
forma que para la caseína.
Agite y anote los resultados igual que en el caso anterior.
CUESTIONARIO:
1. Defina pI de una proteína

2. Escriba la ecuación de Henderson Hasselbach y explica para qué se emplea.
3. ¿Por qué el alcohol actúa como agente precipitante para la gelatina?
4. ¿De qué depende el valor de pI de una proteína?, menciona 2 factores.
5. Explica cómo una solución puede afectar a la carga neta de una proteína.
PRÁCTICA 7
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GEL DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES
DESNATURALIZANTES (SDS-PAGE)
INTRODUCCIÓN:
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente

eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga
eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
Fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse
cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis
de zona, nombre que se asignó a la separación de materiales en un campo eléctrico en
presencia de algún tipo de soporte.
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo
eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta,
dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia
el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo
(el polo positivo).
La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis-
acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una reacción iniciada por el persulfato de amonio
y catalizada por N,N,N’,N’-tetrametiletiléndiamina (TEMED), formándose así una red de
porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reacción
y las concentraciones de los monómeros.
El sistema discontinuo fue introducido por Ornstein y Davis en 1964, y está conformado por
un gel concentrador y gel separador. En el gel separador, la movilidad es restringida por el
tamaño del poro, el cual depende de la concentración de monómeros del gel.
La electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) se 1

propuso desde que Laemmlin en 1970 modificó el sistema de Ornstein-Davis para la
estimación del peso molecular de las proteínas, al incorporar el detergente aniónico
dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0.1% en los amortiguadores, adicionando un paso de
desnaturalización con calor en presencia de 0.2% de SDS y 2-b-mercaptoetanol al 5%, que
provoca que las proteínas se desnaturalicen totalmente, debido a que el SDS se asocia a
estas adoptando una conformación extendida, con dimensiones proporcionales a su masa
molecular.
La movilidad electroforética relativa (Rf) de cada componente que es separado por

electroforesos es inversamente proporcional al logaritmo del PM. Trazando un gráfico con
estándares de PM conocido, se obtiene una línea de referencia en la cual se puede interpolar
muestras de PM desconocido. El Rf se calcula dividiendo la distancia (mm) recorrida por la
banda en cuestión, entre la distancia recorrida por el colorante azul de bromofenol (u otro
punto de referencia arbitrario).
OBJETIVO:
1. Realizar la separación de 3 proteínas de diferente peso molecular mediante SDS-PAGE.
2. Obtener el peso molecular aproximado de las proteínas analizadas, mediante la
elaboración del gráfico Rf contra Log PM.
MATERIAL:
Equipo de electroforesis
Fuente de poder
Baño de incubación
Cristales, peines y separadores para la preparación del gel.
Micropipetas de 5, 20, 200 y 1000 mL
Vasos de precipitados de 100 mL
Puntas para micropipetas
REACTIVOS:
Solución de acrilamida/bisacrilamida: Contiene 30 % acrilamida + 0.8 %
bisacrilamida preparada en agua destilada
• Disolución de SDS: 10 % en agua destilada
• Disolución de persulfato amónico: 100 mg/mL en agua destilada
• TEMED (solución comercial)
• Tampón del gel separador: Tris 1M; pH = 8,8
• Tampón del gel acumulador: Tris 0,5 M; pH = 6,8
• Tampón de carga 5X que contiene: 2,5 ml de solución de SDS 10%; 0,2 ml de
2-mercaptoetanol; 0,5 ml de azul de bromofenol 0,05%; 0,3 ml de tampón de
electroforesis; 1 ml de glicerol y 0,5 ml de Tris 0,5 M pH 6,8.
• Tampón de electroforesis: contiene 14,4 g/l de glicina, 3 g/l de Tris (base) y 10
ml/l de SDS 10%.
• Marcadores preteñidos de peso molecular
1
DESARROLLO:
1) MONTAJE DEL SISTEMA DE ELECTROFORESIS
Se utilizará un gel plano de 1,5 mm de grosor.
• Montar el “sandwich” con dos placas de vidrio (uno tiene un rebaje) y los dos “separadores”
en vertical entre ellas y a ambos lados.
• Introducirlo en el soporte formador de geles. Sujetar el conjunto.
• Se empleará un gel separador con un 7,5 % de acrilamida y un gel acumulador con un 4,8%
de acrilamida. Los geles se preparan mezclando, en un vaso de precipitados, los
componentes indicados en la tabla (el persulfato y el TEMED inician la reacción de
polimerización, por lo que se deben añadir en último lugar) y rápidamente proceder al llenado
con la mezcla (las cantidades indicadas dan para dos geles). La solución de
acrilamida/bisacrilamida se debe utilizar con guantes y pipetear con propipeta.
Primero se polimeriza el gel separador (ver tabla). Para ello se rellena, con la mezcla todavía
líquida, el espacio entre las dos placas hasta unos 3 cm del borde superior del cristal corto,
usando una pipeta pasteur. Añadir encima una pequeña cantidad de etanol. Esperar a que
polimerice el gel (entre 30 y 60 min, observar la mezcla sobrante en el vaso). Retirar el
etanol. Secar con un papel de filtro. Añadir sobre este gel separador la mezcla (ver tabla) del
gel “concentrador” y antes de que polimerice introducir en la parte superior el “peine”, que
formará en el gel acumulador los pocillos para luego poder aplicar las muestras. Se guarda el
gel en la cámara fría hasta el día siguiente.
Gel separador (7,5%):

Agua destilada, 12 mL
Acrilamida/Bisacrilamida, 6.25 mL
Tris 0,5 M pH 6,8., 6,25 mL
SDS 10%, 250 μL
TEMED 12,5 μL
Persulfato amónico (100 mg/mL), 200 μL
Gel concentrador :
Agua destilada, 5.8 mL
Acrilamida/Bisacrilamida, 1.65 mL
Tris 0,5 M pH 6,8; 2.5 mL
SDS10%, 100 μL
TEMED, 6,5 μL
Persulfato amónico, 94 μL
2) SEPARACION DE LAS PROTEINAS POR SDS-PAGE

2a. PREPARACION DE LAS MUESTRAS
Una vez polimerizado el gel concentrador se aplica la muestra.
• Cargar 24-30 μg de proteína (24 μL de la solución), se añade tampón de carga 5X en una 1
relación 4:1 (volumen:volumen) (por tanto, 6 μl).
• Utilizar un tubo con 10 μL de patrones preteñidos de peso molecular conocido.
Esta mezcla ya contiene el tampón de carga.
• Mantener las muestras durante 10 minutos a 100 oC. Centrifugar los tubos a baja velocidad
durante un minuto para concentrar toda la muestra en el fondo del tubo.
• Retirar con cuidado el peine al gel preparado el día anterior. Sacar del formador de geles el
“sandwich” de placas de vidrio, separadores y gel y sujetarlo en vertical en la cubeta de
electroforesis.
• Llenar las cámaras superior e inferior de la cubeta de electroforesis que contienen los
electrodos con tampón de electroforesis, de modo que entre en contacto con ambos
extremos del gel.
• Se aplican las muestras y los patrones de peso molecular en los pocillos del gel, usando
micropipetas.
• Anotar el orden de aplicación de las muestras en el gel.
2b. DESARROLLO DE LA ELECTROFORESIS

• Conectar los cables de la cubeta a una fuente de corriente continua (comprobar la
polaridad: rojo (+), negro (-)).
• Aplicar 80 V hasta que el frente (visible por la banda azul de bromofenol) entre en el gel
separador; después subir a 120 V.
• Cuando el frente, se acerce al extremo inferior del gel, desconectar la corriente y sacar el
sandwich (tarda aproximadamente una hora y cuarto).
• Separar las placas de vidrio con ayuda de una espátula y sacar el gel (usar guantes para
evitar tocar el gel con los dedos) con cuidado de no invertir su orientación.
• Una vez finalizada la transferencia, se tiñe el gel de electroforesis mediante su inclusión en
solución de tinción que contiene Azul de Coomassie, ácido acético, metanol durante 30
minutos a temperatura ambiente.
• Posteriormente, se pasa el gel a solución de destinción que contiene ácido acético 10% y
metanol 10% en agua, destiñendo el gel durante toda la noche.
Determinar el Rf para cada proteína que se separó en el corrimiento electroforetico,
realizando el gráfico X = Rf y y= Log PM, en papel semilogarítmico.
Reportar los pesos moleculares aproximados para cada muestra.
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es el efecto del glicerol en el buffer de carga?
Explica el efecto del 2 b-mercaptoetanol en las proteínas.
2. ¿Por qué el azul de bromofenol es sirve como referencia de frente de corrimiento?
3.- ¿Por qué se utilizan dos geles (concentrador y separador) en la electroforesis en gel de
poliacrilamida en presencia de SDS?
4.- ¿Qué patrón de bandas se obtiene en la muestra de marcadores?
5.- Representar las movilidades electroforéticas de los patrones de peso molecular
preteñidos frente al logaritmo del peso molecular de cada patrón (en papel milimetrado).
6.- Calcular la movilidad electroforética de la proteína problema (a partir de la banda que 1
aparece en el gel tras tinción y distinción del mismo).
7.- Calcular el peso molecular de la proteína problema.
PRÁCTICA 8
CINÉTICA ENZIMÁTICA
INTRODUCCIÓN:
Las enzimas son proteínas con capacidad de catalizar reacciones biológicas. Las
Enzimas al igual que los catalizadores inorgánicos aumentan la velocidad para alcanzar el
equilibrio de la reacción. El mecanismo por el cual las enzimas incrementan la velocidad de
la reacción es reduciendo la energía libre de activación requerida para transformar un
sustrato al producto correspondiente, sin afectar la constante de equilibrio.
V1
A + B « C + D
V2
[C][D]
Keq = ________
[A][B]
Donde:
A y B = Sustratos
C y D = Productos
V1 = Velocidad de la reacción para formar los productos.
V2 = Velocidad de la reacción para formar los sustratos.
Keq = Constante de equilibrio
[] = Concentración molar
La actividad de una enzima se evalúa en función de la velocidad de la reacción. La

cinética enzimática estudia la velocidad de la reacción enzimática, los factores que la
modifican y el mecanismo de reacción. Los factores fisicoquímicos que modifican la actividad
de la enzima son: Concentración del sustrato, Concentración de la enzima, pH, Temperatura,
Fuerza iónica e Inhibidores.
La catalasa es una hemoproteina que contiene cuatro grupos hem. Ademas de poseer
una actividad peroxidasa, utiliza una molécula de H 2O2 como sustrato donador de electrones
y otra molécula de H2O2 como oxidante o aceptor de electrones.
2 H2O2 ® 2 H2O + O2
La catalasa se encuentra en la sangre, medula ósea, mucosas, riñón e hígado. Su

función es la destrucción del peróxido de hidrogeno formado por la acción de las oxidasas.
Los microcuerpos o peroxisomas se encuentran en numerosos tejidos incluyendo el hígado.
En ellos abundan las oxidasas y la catalasa, lo cual sugiere que puede haber una ventaja 1
biología al agrupar a las enzimas que producen H 2O2 con la enzima que lo destruye. Además
de la enzimas peroxisomales, los sistemas mitocondriales y microsomicos de transporte de
electrones así como la xantina oxidasa se deben considerar como fuentes de H 2O2.
OBJETIVO GENERAL:
Evaluar el comportamiento de las enzimas en presencia de factores fisicoquímicos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. Determinar el efecto del pH sobre la cinética enzimática.
2. Identificar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción.
3. Determinar el efecto de la concentración de sustrato y enzima sobre la cinética
enzimática.
MATERIAL:
8 Matraces volumétricos de 25 mL
1 Gradilla
3 Pipetas, 1, 5 y 10 mL
1 Micropipeta de 20 mL
1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL
1 Probeta de 25 mL
1 Jeringa de 3 mL
1 Torniquete
Tiras reactivas para medir pH, o un medidor de pH

1 Vaso de precipitado de 250 mL
1 Bomba para pipeta (Jeringa con manguera)
Recipiente con hielo
REACTIVOS:
H2SO4 2 N conteniendo 1 mg por mL de MnSO 4, KMnO4 0.05 N
Soluciones de sustrato: H2O2 al 0.24% acidulada a pH 3, pH 7 y pH 9.
Preparación de la solución de catalasa.

Coloque 25 mL de agua destilada (fría) en un matraz pequeño, deposite 20 mL de
sangre total y mantenga la mezcla en baño de hielo. Esta etapa debe realizarse rápidamente,
ya que la sangre se coagula en la pipeta si se deja más de medio minuto.
Lo otra alternativa sería la siguiente.

-500 ml de buffer fosfato 0.1 M a pH = 7. Para su preparación se toman 0.031
mol de K2HPO4 y 0.019 mol de KH2PO4 completándose con agua destilada hasta los
500 ml. Una vez preparada se coloca en un baño de agua-hielo hasta su uso
posterior.
1
-Disoluciones de agua oxigenada: 500 ml de H 2O2 al 2 %, 1 %, 0.5 %, 0.25 %, 0.125
%, 0.062 %, 0.031 %, 0.015 % y 0.007 % (p/v). Todas ellas se preparan a partir del reactivo
comercial al 30 % (p/v).
Fundamento
La concentración de H2O2 en cada experimento, está determinada por titulación con
estándar de KMnO4. La titulación de un tubo control por cada experimento sirve como medida
de la concentración de peróxido al comienzo del experimento. La diferencia entre las so
titulaciones representa la cantidad de peróxido descompuesto. En este experimento o
miliequivalentes (mEq) de peróxido descompuesto por unidad de tiempo serán considerados
como medida de la actividad catalasica.
Reacción:
2 H2O2 ® 2 H2O + O2
5H2O2 + 2 KMnO4 + 6 H ® 5 O2 + 2 Mn ® + 8 H2O
DESARROLLO:
Evaluar el efecto de la concentración de sustrato, concentración de la enzima, pH,
temperatura y tiempo en la actividad de la catalasa.
Experimento No. 1
Efecto de la concentración de la enzima.

a) Preparar una serie de matraces de acuerdo a la tabla de abajo y titular hasta
la aparición de un color rosa permanente.
b) Calcular los mEq de H2O2 transformados (destruidos) por ml de Sangre total
de siguiente manera:
Peso molecular (PM) del KMnO4 = 158

158 g/L = 1 Molar (1 M)
PM (g)
Eq = __________________________
No. de Valencia substituible
Eq = 158/1 = 158 g/L
1 N = 1 Eq
Por lo tanto, en la solución de KMnO4 0.05 N existen 0.05 Eq/L que es igual a 50
mEq/L
Para obtener los mEq de H2O2 no transformados, aplique la relación: 1
1 000 mL -------------------------------------50 mEq

mL gastados de KMnO4 ------------------ X._____________
X = mEq de H2O2
Tubo H2O2 Catalasa H2SO4 Titular mEq mEq

pH 7 2N (mL de KMnO4 0.05 N) H2O2 H2O2
No transformado transformado
Contro 5 mL --------- 5 mL ---------------
l
1 5 mL 0.0 mL R 5 mL
2 5 mL 0.10 mL E 5 mL
3 5 mL 0.20 mL P 5 mL
4 5 mL 0.40 mL O 5 mL
5 5 mL 0.80 mL S 5 mL
O
5 min
c) En los experimentos subsiguientes realice los mismos cálculos para obtener

los mEq de H2O2 no transformados. Para calcular los mEq de H 2O2
transformado.
d) Graficar en papel milimétrico la cantidad de mEq de H 2O2 destruido por la
enzima.
e) Interprete los resultados explicando el comportamiento de la actividad de la
enzima en función de su concentración.
Experimento No. 2
Efecto de la concentración de sustrato.
a) Preparar una serie de matraces de acuerdo a la tabla de abajo.
b) Calcular los mEq de H2O2 transformados (destruidos), restar los mEq de
H2O2 no transformado (No destruido) obtenido del tubo 2 a los mEq de H 2O2 no
transformado del tubo 1; del 4 al 3 y del 6 al 5.
c) Graficar en papel milimétrico la cantidad de mEq de H 2O2 destruido
contra la concentración del sustrato
d) Interprete los resultados explicando el comportamiento de la actividad de
la enzima en función del sustrato.
Tubo H2 O 2 H2 O Catalasa H2SO4 Titular mEq mEq

pH 7 2N (mL de H2 O 2 H2 O 2
KMnO4 No transformado transformado
0.05 N)
1 5 mL --------- --------- 5 mL ---------------
2 5 mL --------- 0.5 mL R 5 mL 1
3 2.5 2.5 --------- E 5 mL
mL mL P
4 2.5 2.5 0.5 mL O 5 mL
mL mL S
5 1.25 3.75 -------- 5 mL
mL mL
6 1.25 3.75 3.75 mL O 5 mL
mL mL 5
Experimento No. 3
Efecto del tiempo sobre la reacción.

b) Calcular los mEq de H2O2 transformados (destruidos), restando los mEq
de H2O2 no transformado (No destruido) del tubo 2, 3, 4 y 5 a los mEq de H 2O2 no
transformado del tubo 1.
c) Graficar en papel milimétrico la cantidad de mEq de H 2O2 transformado
(destruido) por minuto contra tiempo.
la enzima en función del tiempo de reacción.
Tub H2O2 Catalas Reposo H2SO4 Titular mEq mEq

o pH 7 a 2N (mL de KMnO4 0.05 N) H2O2 H2O2
No transformado transformado
1 5 --------- --- 5 mL --------------
mL
2 5 0.5 mL 1 min 5 mL
mL
3 5 0.5 mL 3 min 5 mL
mL
4 5 0.5 mL 5 min 5 mL
mL
5 5 0.5 mL 7 min 5 mL
mL
6 5 0.5 mL 10 min 5 mL
mL
Experimento No. 4
Efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción.
de H2O2 no transformado (No destruido) del tubo 2, a los mEq de H 2O2 no
transformado del tubo 1; del 4 al 3; 6 al 5 y del 8 al 7.
c) Graficar en papel milimétrico la cantidad de mEq de H 2O2 transformado
(destruido) contra la temperatura.
la enzima en función de la temperatura de reacción.
1
Tubo H2 O 2 Temp. Catalasa H2SO4 Titular mEq mEq
pH 7 2N (mL de H2 O 2 H2 O 2
KMnO4 No transformado transformado
R 0.05 N)
1 5 mL 15° C 0.5 mL E 5 mL --------------
2 5 mL 15° C ------ P 5 mL
3 5 mL 25° C 0.5 mL O 5 mL
4 5 mL ------ S 5 mL
25° C
O
5 5 mL 40° C 0.5 mL 5 mL
5
6 5 mL 40° C ------ min 5 mL
7 5 mL 60° C 0.5 mL
8 5 mL 60° C -----
Experimento No. 5
Efecto del pH sobre la velocidad de la reacción.
de H2O2 no transformado (No destruido) del tubo 2, a los mEq de H 2O2 no
transformado del tubo 1; del 4 al 3; 6 al 5 y del 8 al 7.
c) Graficar en papel milimétrico la cantidad de mEq de transformado
(destruido) contra EL pH.
la enzima en función de acuerdo al pH.
Tub H2O2 Catalasa H2SO4 Titular mEq mEq

o 5 2N (mL de KMnO4 0.05 N) H2O2 H2O2
mL No transformado transformado
1 pH 3 0.5 mL R 5 mL --------------
2 pH 3 ------ E 5 mL
3 pH 5 0.5 mL P 5 mL
4 pH 5 ------ O 5 mL
5 pH 7 0.5 mL S 5 mL
6 pH 7 ------ O 5 mL
7 pH 9 0.5 mL 5 min
8 pH 9 -----
CUESTIONARIO:
1. Definir que es un radical libe.
2. Enliste los radicales libres que se generan en al células.
3. ¿Cuál es la función de los radicales libres que se forman en la células?
4. Escribir 4 reacciones en donde se genera el H 2O2 en la célula.
5. Explicar la utilidad de la determinación de la actividad enzimática en la clínica. De tres
ejemplos.
1
PRÁCTICA 9
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
INTRODUCCIÓN:
Las enzimas son proteínas especializadas en la catálisis de reacciones biológicas específicas.
La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como proteínas,

mientras que otras necesitan además, uno o más componentes no proteicos llamados
COFACTORES. El cofactor puede ser un ion metálico o bien una molécula llamada COENZIMA,
algunas enzimas necesitan de ambos. Los cofactores son generalmente estables frente al calor,
mientras que muchas enzimas pierden la actividad por calefacción.
El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de HOLOENZIMA, la

proteína por sí misma es inactiva y recibe el nombre de APOENZIMA.
Algunas enzimas precisan de iones metálicos como cofactores y se les llama

+3
METALOENZIMAS, por ejemplo la catalasa que requiere de Fe .
La mayoría de las enzimas posee actividad a un pH característico al cual su actividad es

máxima; por enzima o por debajo de ese pH la actividad disminuye.
La velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa en general por la

temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y permanece totalmente activa. La
mayoría de las enzimas se desactivan a temperaturas comprendidas entre 55-60ºC. Esto depende
del hecho de que son proteínas; moléculas que se desnaturalizan con el calor, con la pérdida
simultánea de sus propiedades.
Si a un sistema enzimático se añaden sustancias que impiden la realización de la actividad

propia de la enzima se dice que el sistema ha sido inhibido y la sustancia que se usa con estos fines
se llama INHIBIDOR. 1
La reacción en que interviene la enzima Catalasa es:
2 H2O2 2 H2O + O2
Esta enzima pierde actividad a altas temperaturas o en presencia de inhibidores como el

grupo CN- que forma quelatos con su cofactor o el Pb- que actúa sobre grupos -SH de la enzima
indispensable para su actividad.
OBJETIVOS:
1. El alumno observará la actividad de la enzima Catalasa utilizando diferentes fuentes

biológicas.
1. El alumno comparará el efecto de la temperatura de algunos inhibidores como el Pb y el
CN- sobre la actividad enzimática de la Catalasa
MATERIAL:
El alumno deberá traer:
 H2O2  2 goteros
 Papa *  Pinzas pequeñas.
 Papel absorbente
 Hígado de pollo*  Cuchillo
 Manzana *
* todo crudo
En el laboratorio
 12 tubos de ensaye
 1 gradilla
 Baño María 100ºC
REACTIVOS:
 Cianuro de sodio al 5%
 Nitrato de plomo al 5%
DESARROLLO:
1. Corte en trozos delgados (procure que sean todos del mismo tamaño)cada tejido disponible
y póngalo sobre el papel absorbente anotando el nombre correspondiente. No debe tocarse
con los dedos, sino manipularse con las pinzas.
1. De cada tejido separe una porción y póngala en un tubo y cúbrala con agua destilada,
1
introdúzcala en el agua hirviente durante 5 minutos, coloque estas porciones sobre el papel
absorbente indicando que están hervidas y anote su nombre.
2. Prepare una serie de tubos para cada tejido como lo indica la tabla siguiente:
Contenido Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Tejido Sin hervir Hervido Sin hervir Sin hervir
NaCN 5% ----- ----- 5 gotas -----
Pb(NO3)2 5% ----- ----- ----- 5 gotas
H2O2 2 ml 2 ml 2 ml 2ml
Mezcle bien, marque con cruces de 1 a 5 según aprecie la intensidad de burbujeo en cada
serie de tubos.
CUESTIONARIO:
1. Defina el concepto de: Enzima, apoenzima, holoenzima, inhibidor y cofactor
2. Investiga cómo afectan los siguientes factores fisicoquímicos a la cinética enzimática:
Concentración del sustrato, Concentración de la enzima, pH, Temperatura, Fuerza iónica e
Inhibidores.
3. Mencione como actúa el plomo en la inhibición enzimática y que tipo de inhibición realiza.
4. Menciona 2 ejemplos de uso de la catalasa en la industria.
PRÁCTICA 10
DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE AZÚCARES Y FORMACIÓN DE OSAZONAS
INTRODUCCIÓN:
Los carbohidratos son moléculas que desde el punto de vista químico se definen como
polihidroxialdehidos o polihidroxiacetonas (derivados aldehídicos o cetónicos de polialcoholes), es
necesario saber identificar a estas moléculas del conjunto de biomoléculas presentes en una muestra,
existen pruebas generales como la de Molish o más específicas como la de Seliwanoff, Bial Biuret,
Formación de osazonas, etc., que nos permiten conocer diferentes aspectos de las moléculas en
cuestión,
En esta práctica realizaremos una prueba general de detección que es la de Molish y una
reacción de identificación por formación de osazonas.
OBJETIVOS:
1. Detectar la presencia de carbohidratos en una solución problema mediante la prueba de

Molish.
1. Identificar el azúcar presente en la solución problema por formación de osazonas.
MATERIAL:
 5 tubos de ensaye  Balanza granataria.
 2 portaobjetos.  1 agitador.
 3 pipetas  Baño María.
 Microscopio
REACTIVOS :
 Solución de glucosa al 10%  Soluciones problema 0.01 M
 H2SO4 concentrado.  H2O destilada.
 Soluciones problema A y B  Reactivo de Molish (a naftol 5% en
etanol)
 Clorhidrato de fenilhidracina  CH3COONa
DESARROLLO: (Antes de iniciar espere las indicaciones del profesor)
PRUEBA DE MOLISH
1. En cuatro tubos de ensaye rotulados: blanco, testigo, problema A y problema B, coloque

2.5 ml de cada solución indicada al 10%.
1. Añada dos gotas de reactivo de Molish y mezcle bien.
1
2. Vierta con cuidado y deslizando por las paredes del tubo 2 ml de H 2SO4 concentrado ¡no
agite!
3. La aparición de un color violeta rojizo en la interfase es una prueba positiva de la presencia
de carbohidratos (compare con el testigo).
FORMACIÓN DE OSAZONAS
En la balanza granataria:
1. Pese 2gr de clorhidrato de fenilhidracina y 3gr de acetato de sodio, mezcle cuidadosamente
bien (reactivo de fenilhidracina-acetato).
1. Pese 0.7gr de reactivo fenilhidracina-acetato por cada muestra positiva que obtuvo en la
prueba de Molish (Excepto para el testigo).
2. En un tubo de ensaye coloque 1ml de la solución positiva a Molish pero ahora con una
concentración de 0.01 M
3. Agregue el reactivo de fenilhidracina-acetato.
4. Adicione 2ml de agua destilada y mezcle bien.
5. Tape el (o los) tubos con algodón y colóquelos en el baño María a ebullición, observe a los
15 minutos y deje hervir 10 minutos más.
6. Rotule cada portaobjetos.
7. Retire el (o los) tubos del baño y deje enfriar, coloque cuidadosamente los cristales en un
portaobjetos con ayuda del agitador.
8. Observe los cristales al microscopio a seco débil.
REPORTE:
1. Escriba los problemas con que trabajó e indique cuál fue positivo a la prueba de Molish
1. Dibuje la forma de los cristales de los azúcares conocidos.
2. Dibuje la forma de sus cristales problema.
3. Escriba el nombre y estructura del problema identificado.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de Molish? Escriba la reacción utilizando glucosa y

ribosa como ejemplos.
1. ¿Cuál es el fundamento de la formación de osazonas? Escriba la reacción utilizando
galactosa como ejemplo.
2. ¿Qué es un epímero?
¿Qué monosacéridos dan la misma osazona y por qué?
BIBLIOGRAFÍA
LEHNINGER, A. L. Principles of biochemistry. 4a. ed. /New York : W.H. Freeman, c2005.
STRYER L. Biochemistry. 4a ed. New York: W.H. Freeman, c1995
MATHEWS, C. K., Bioquimica. 3a ed. Madrid: Addison Wesley Longman, c2002.
VOET, D. Biochemistry. 2nd ed. New York: J. Wiley & Sons, c1999.
DÍAZ-ZAGOYA, J. C. Bioquímica. México: McGraw-Hill, 2007.
MACARULLA, J. M. Biomoléculas. 3a ed. Barcelona, España: Reverté, 1993.
BIBLIOGRAFÍA COMPLEMENTARIA
RAWN, J. D.. Bioquímica. 5a ed. Barcelona: Reverté 2003
BERG, J. M. Bioquímica. 6a ed. Barcelona: Reverté, 2008.
BIOQUÍMICA DE HARPER. 15a ed. México: El Manual Moderno,c2001
HERRERA, E. Bioquímica 1ª Edición España Interamericana, S. A. 1986

Manual Lab Bioquimica 1 Prim 2020 BIOTEC OK

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Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

ÁREA: Ciencias Biológicas

ASIGNATURA: Laboratorio de Bioquímica I

FECHA DE ACTUALIZACIÓN: Julio de 2019

Nivel Educativo: Licenciatura

Nombre del Plan de Estudios: Licenciatura en Biotecnología

Modalidad Académica: Presencial

Nombre de la Asignatura: Laboratorio de Bioquímica I

4. PERFIL DESEABLE DEL PROFESOR (A) PARA IMPARTIR LA ASIGNATURA:

NORMAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

 La asistencia al laboratorio es del 100 %, con una tolerancia de llegada de 5 minutos, en

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1. Calentar en un matraz 125ml de leche a 38ºC, sin retirar del baño.

10. Del sobrenadante obtenido en el paso 3 coloque un ml en el tubo de ensaye y agregue un

1. ¿Por qué precipita la caseína y bajo qué condiciones?

El pH al que una proteína muestran un mínimo de solubilidad es su punto isoeléctrico o pH

DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA CASEINA.

DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA GELATINA

Preparar 9 tubos como lo indica la tabla siguiente:

Agite y anote los resultados igual que en el caso anterior.

1. Defina pI de una proteína

La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente

La electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) se 1

La movilidad electroforética relativa (Rf) de cada componente que es separado por

Gel separador (7,5%):

2) SEPARACION DE LAS PROTEINAS POR SDS-PAGE

2b. DESARROLLO DE LA ELECTROFORESIS

La actividad de una enzima se evalúa en función de la velocidad de la reacción. La

La catalasa se encuentra en la sangre, medula ósea, mucosas, riñón e hígado. Su

Tiras reactivas para medir pH, o un medidor de pH

Preparación de la solución de catalasa.

Lo otra alternativa sería la siguiente.

Efecto de la concentración de la enzima.

Peso molecular (PM) del KMnO4 = 158

1 000 mL -------------------------------------50 mEq

Tubo H2O2 Catalasa H2SO4 Titular mEq mEq

c) En los experimentos subsiguientes realice los mismos cálculos para obtener

Tubo H2 O 2 H2 O Catalasa H2SO4 Titular mEq mEq